CN109517052A - 一种il-12蛋白突变体及其制备方法和应用、nk细胞培养体系和培养nk细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种IL‑12蛋白突变体及其制备方法和应用、NK细胞培养体系和培养NK细胞的方法。本发明提供了一种IL‑12蛋白突变体，IL‑12蛋白突变体由突变型IL‑12基因所编码；所述突变型IL‑12基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。结果表明IL‑12蛋白突变体能够促进NK细胞的活化和增殖，增加NK细胞表型的比例，提高NK细胞的纯度，能够在短时间内使得NK细胞扩增数量增加，并能增强NK细胞对肿瘤的杀伤能力。

Description

一种IL-12蛋白突变体及其制备方法和应用、NK细胞培养体系 和培养NK细胞的方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种IL-12蛋白突变体及其制备方法和应用、NK细胞培养体系和培养NK细胞的方法。
背景技术
自然杀伤(natural killer，NK)细胞是一类大颗粒淋巴细胞，主要分布于外周各淋巴器官及血液循环系统，可产生大量参与免疫检测和免疫应答的干扰素γ(Interferon-γ，IFN-γ)和穿孔素，是免疫系统的重要组成成分。NK细胞不表达特异性的抗原识别受体，无需抗原的预先刺激与活化即可发挥细胞毒效应，尤其是对多种肿瘤细胞有快速杀伤和溶解的作用，是抗肿瘤的第一道防线。因其毒副作用小，已广泛应用于临床的相关治疗。
NK细胞占外周血淋巴细胞的5％～10％，与外周血相比，脐带血中NK细胞含量较多，可达20％，但想要达到临床治疗的效果仍需要对NK细胞进行体外大量扩增。目前NK细胞培养有两种常见的培养方法，第一种是采用基因工程改造过的细胞作为滋养层进行细胞培养，第二种是采用纯因子刺激单个核细胞，向NK细胞方向诱导、扩增培养。第一种培养方法得到的NK细胞纯度高，阳性率可达到90％以上，但该培养方法在培养过程中选用的滋养层细胞为肿瘤细胞，存在安全隐患。第二种培养方法所使用的细胞因子是体内环境原本就存在的，培养过程相当于模拟体内环境，能够促进NK细胞的激活及大量增殖，安全性高，但培养得到的NK细胞纯度较低，NK细胞的表型阳性率仅达到60％～70％左右。采用多种细胞因子可促进NK细胞的扩增，单独作用效果不显著，联合作用效果可显著增加。目前，体外扩增高纯度NK细胞体系中常用的是IL-2、IL-15和IL-12的细胞因子组合，但经过一段时间后扩增NK细胞的倍数以及得到的NK细胞纯度和杀伤活性不够理想，不能完全满足实际应用。
发明内容
本发明提供了一种IL-12蛋白突变体及其制备方法和应用、NK细胞培养体系和培养NK细胞的方法，用于解决目前采用细胞因子组合进行NK细胞的体外扩增，经过一段时间后仅能使NK细胞扩增几倍或几十倍，并且得到的NK细胞纯度和杀伤活性不够理想，不能完全满足实际应用的问题。
本发明的具体技术方案如下：
一种IL-12蛋白突变体，IL-12蛋白突变体由突变型IL-12基因所编码；
所述突变型IL-12基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
白细胞介素是一组由多种类型细胞分泌的，能调节细胞生长、分化和免疫活性的细胞因子，与NK细胞关系密切，具有直接参与NK细胞的调控或通过影响其它免疫细胞间接调节NK细胞的功能。已有许多文献报道IL-2、IL-15、干细胞集落刺激因子等对促进NK细胞的分化成熟、活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。IL-12与IL-2具有某种相似的功能特性，它们均能增强细胞的杀伤活性，介导IFN的产生及正向调节NK细胞及粘附分子。其中IL-12更具有应用于临床治疗肿瘤的潜力。IL-12是由p35、p40两个亚基共同组成的异源二聚体，两个亚基单独存在时没有生物学活性，只有结合成异二聚体后才具有生物学活性。NK细胞表面有其受体(IL-12R)，能够刺激NK细胞的活性，又称细胞毒性细胞成熟因子或NK细胞刺激因子。IL-12能上调NK细胞NKG2D和穿孔素的表达以提高NK细胞的细胞毒作用，并诱导不成熟树突状细胞分化为成熟DC，后者可以与NK细胞一起协同发挥抗肿瘤效应。IL-12还可直接上调NK细胞表面CD2、CD11a和CD56等黏附分子表达，从而增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
NK细胞表面存在活化性受体和抑制性受体。机体发生肿瘤时，肿瘤细胞高表达主要组织相容性复合体I类分子，激活NK细胞的活化性受体，从而杀死肿瘤细胞。但同时肿瘤细胞能使NK细胞表面抑制性受体表达上调，活化性受体下调，即肿瘤细胞与NK细胞的相互免疫编辑作用，抑制NK细胞对肿瘤的杀伤作用。IL-12能够上调NK细胞表面的活化性受体，下调抑制性受体，促进NK细胞分泌INF-γ、转化生长因子β等提高NK细胞的杀伤效应。它不仅可以促进NK细胞的杀伤活性和分泌功能，而且可在体外促进NK细胞的增殖。但是，采用IL-2、IL-15和IL-12的细胞因子组合进行NK细胞体外扩增，但经过一段时间后仅可以使NK细胞扩增几倍或几十倍，并且得到的NK细胞纯度和杀伤活性不够理想，不能完全满足实际应用。
本发明中，IL-12蛋白突变体由突变型IL-12基因所编码，突变型IL-12基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，IL-12蛋白突变体能够活化IL-12的免疫应答功能，活化的IL-12能够通过提高IFN-γ增加IL-15的表达，进而提高NK细胞的体外活化及扩增能力。结果表明IL-12蛋白突变体能够促进NK细胞的活化和增殖，增加NK细胞表型的比例，提高NK细胞的纯度，能够在短时间内使得NK细胞扩增数量增加，并能增强NK细胞对肿瘤的杀伤能力。
本发明中，突变型IL-12基因通过将野生型IL-12基因的IL-12 p40的第222位Asn突变为Leu得到。
本发明还提供了上述技术方案所述IL-12蛋白突变体的制备方法，包括以下步骤：
1)将IL-12基因的IL-12 p40的第222位Asn突变为Leu，得到突变型IL-12基因；
2)将所述突变型IL-12基因进行蛋白表达，得到IL-12蛋白突变体。
突变型IL-12基因通过基因工程方法得到。
本发明中，步骤1)具体包括：
以重组pcDNA3.1-IL 12质粒为模板，采用overlap PCR法进行点突变，得到IL-12p40的第222位Asn突变Leu的重组突变体IL-12质粒。
点突变采用overlap PCR法，优选采用高效点突变试剂盒，可同时进行两个碱基的突变，提高了突变的准确度。
重组pcDNA3.1-IL 12质粒的制备方法如下：
将IL-12融合基因与CD513B-1质粒载体分别用EcoR I和BamH I进行双酶切，再将酶切后的CD513B-1质粒载体与IL-12融合基因用T4DNA连接酶连接，得到重组CD513B-IL12质粒；
将重组CD513B-IL12质粒进行纯化，得到重组pcDNA3.1-IL12质粒。
IL-12融合基因的制备方法如下：
以pcDNA-IL-12 p40-Flag质粒和pcDNA-IL-12 p35-Flag质粒为模板分别进行p40亚基基因和p35亚基基因的扩增，得到p40扩增片段和p35扩增片段；
以p40扩增片段和p35扩增片段为模板，采用overlap PCR法进行拼接，得到IL-12融合基因。
本发明中，步骤2)具体包括：
将重组突变体IL-12质粒与包装质粒pMD2G和pCMVdR8进行慢病毒包装细胞HEK293FT的转染，得到含有突变型IL-12基因的重组慢病毒载体；
将含有突变型IL-12基因的重组慢病毒载体进行蛋白表达，得到IL-12蛋白突变体。
本发明中，含有突变型IL-12基因的重组慢病毒载体进行蛋白表达具体包括：将含有突变型IL-12基因的重组慢病毒载体感染白血病细胞株K562细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述IL-12蛋白突变体和上述技术方案所述制备方法制得的IL-12蛋白突变体在培养NK细胞中的应用。
本发明还提供了一种NK细胞培养体系，包括：活化培养基和增殖培养基；
所述活化培养基包括第一添加物；
所述第一添加物包括上述技术方案所述IL-12蛋白突变体或上述技术方案所述制备方法制得的IL-12蛋白突变体。
优选的，所述IL-12蛋白突变体在所述活化培养基中的浓度为0.5mg/mL～1.5mg/mL。
优选的，所述第一添加物还包括：CD16单抗、Her2单抗、IL-2和IL-15。
优选的，所述CD16单抗在所述活化培养基中的浓度为1μg/mL～100μg/mL；
所述Her2单抗在所述活化培养基中的浓度为0.5mg/mL～1mg/mL；
所述IL-2在所述活化培养基中的浓度为500U/mL～1500U/mL；
所述IL-15在所述活化培养基中的浓度为1ng/mL～30ng/mL。
本发明中，活化培养基还包括第一基础培养基和第一血浆，第一血浆优选为自体血浆。
优选的，所述增殖培养基包括第二添加物；
所述第二添加物包括IL-2和IL-15；
所述IL-2在所述增殖培养基中的浓度为500U/mL～1500U/mL；
所述IL-15在所述增殖培养基中的浓度为1ng/mL～30ng/mL。
本发明中，增殖培养基还包括第二基础培养基和第二血浆，第二血浆优选为自体血浆。
本发明NK细胞培养体系为NK细胞专业培养体系，采用无血清的第一基础培养基和第二基础培养基，采用自体血浆，不含动物源成分，不含滋养层细胞，在保证NK细胞大量扩增的同时，保证NK细胞表型CD3-CD56+的高表达，使用更安全、放心。
本发明中，第一培养基选自NK细胞无血清培养基、RPMI 1640无血清培养基、X-VIVO无血清培养基或CellGro SCGM无血清培养基。
第二培养基选自NK细胞无血清培养基、RPMI 1640无血清培养基、X-VIVO无血清培养基或CellGro SCGM无血清培养基。
本发明还提供了一种培养NK细胞的方法，采用上述技术方案所述NK细胞培养体系进行NK细胞培养，包括以下步骤：
a)将单个核细胞接种于所述活化培养基中进行活化，得到活化培养细胞；
b)将所述活化培养细胞接种于所述增殖培养基中进行增殖，得到增殖细胞。
本发明中，单个核细胞通过将血细胞采用淋巴细胞分离液分离得到，血细胞采集自外周血、脐带血、骨髓和/或淋巴结，优选外周血。
单个核细胞具体通过以下步骤得到：将血细胞用PBS稀释后，加入淋巴细胞分离液，离心，吸取白层膜细胞，加入无血清细胞培养基，离心去上清，得到单个核细胞。
本发明中，单个核细胞接种于活化培养基的细胞密度为(1～10)×106个/ml，优选为2×106个/ml，活化的时间为3天～7天，优选为5天。
活化培养细胞接种于增殖培养基的细胞密度为(1～5)×106个/ml，优选为1×106个/ml。
优选的，步骤a)所述将单个核细胞接种于所述活化培养基中进行活化之后还包括：补加所述第一添加物。
本发明中，补加第一添加物具体包括在活化的第0～5天添加IL-2、IL-15和IL-12蛋白突变体使其在活化培养基中的浓度保持稳定，第一添加物中的CD16单抗及Her2单抗通过包被处理加入到活化培养基中。
本发明中，进行活化时，需要根据细胞的生长状态补充活化培养基。
本发明中，进行增殖时，需要根据细胞的生长状态补充增殖培养基，并在增殖培养基添加IL-2和IL-15使其在增殖培养基中的浓度保持稳定。
本发明培养NK细胞的方法是在纯因子诱导培养的基础上，采用基因工程改造的细胞因子IL-12蛋白突变体，使得NK细胞受到信号刺激，活化细胞，促进其大量扩增，添加因子的使用种类及数量减少，降低了培养成本，培养方式更简便高效，短周期内可大量扩增高质量高纯度的细胞，对于临床治疗至关重要。
综上所述，本发明提供了一种IL-12蛋白突变体，IL-12蛋白突变体由突变型IL-12基因所编码；所述突变型IL-12基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。结果表明IL-12蛋白突变体能够促进NK细胞的活化和增殖，增加NK细胞表型的比例，提高NK细胞的纯度，能够在短时间内使得NK细胞扩增数量增加，并能增强NK细胞对肿瘤的杀伤能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例中体外培养NK细胞的扩增曲线；
图2为本发明实施例中体外培养NK细胞的表型分析；
图3为本发明实施例中体外培养NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
具体实施方式
本发明提供了一种IL-12蛋白突变体及其制备方法和应用、NK细胞培养体系和培养NK细胞的方法，用于解决目前采用细胞因子组合进行NK细胞的体外扩增，经过一段时间后仅能使NK细胞扩增几倍或几十倍，并且得到的NK细胞纯度和杀伤活性不够理想，不能完全满足实际应用的问题。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 IL-12蛋白突变体的制备
(1)PCR获得p40亚基基因和p35亚基基因
以pcDNA-IL-12 p40-Flag质粒和pcDNA-IL-12 p35-Flag质粒为模板分别进行p40亚基基因和p35亚基基因的扩增。以F:5’ATTGAATTCGCCGCCACCATGTGTCACCAGCAGTTG 3’和R:5’GTTTCTGGAGCCACCACCGCCACTGCAGGGCACAGATGC 3’为引物扩增P40编码全序列，以F:5’AGTGGCGGTGGTGGCTCCAGAAACCTCCCCGTGGCC 3’和R:5’ATTGGATCCTAGGAAGCATTCAGATA 3’为引物扩增P35编码全序列。扩增P40编码全序列和扩增P35编码全序列的PCR反应参数为：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸2min，10℃保温。之后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离产物，采用DNA凝胶回收试剂盒回收并纯化P40扩增片段和P35扩增片段，目的片段大小分别为987bp和762bp。其中，pcDNA-IL-12 p40-Flag质粒和pcDNA-IL-12 p35-Flag质粒购自TAKARA公司，琼脂糖和DNA marker购自北京全式金生物公司，PCR扩增所使用DNA聚合酶采用KOD高保真聚合酶，购自东洋纺上海生物科技有限公司，DNA凝胶回收试剂盒购自赛默飞公司，引物合成由苏州金唯智公司完成。
(2)IL-12融合基因的构建
分别以回收纯化后的p40扩增片段和p35扩增片段为模板，以F:5’ATTGAATTCGCCGCCACCATGTGTCACCAGCAGTTG 3’和R:5’ATTGGATCCTAGGAAGCATTCAGATA 3’为引物，采用overlap PCR法进行拼接，获得IL-12融合基因。overlap PCR的扩增循环参数为：95℃5min，94℃30s，58℃45s，72℃45s，共35个循环；72℃延伸10min。overlap PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳后进行测序鉴定。经测序确认后，将IL-12融合基因与CD513B-1质粒载体分别用EcoR I和BamH I双酶切后DNA凝胶电泳回收纯化，将酶切后的CD513B-1质粒载体与IL-12融合基因片段用T4DNA连接酶连接，将IL-12融合基因插入CD513B-1质粒载体的EcoR I位点和BamH I位点，将构建的重组CD513B-IL12质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，再将大肠杆菌涂布在含有相应抗生素的平板上，倒置37℃培养箱过夜。进行菌液PCR和双酶切鉴定正确后，进行测序鉴定。使用赛默飞公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得高品质重组pcDNA3.1-IL12质粒，为重组野生型IL-12质粒。其中，CD513B-1质粒载体购自TAKARA公司，大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物公司，限制性内切酶EcoRI和BamHI购自美国New England Biolabs公司，测序由苏州金唯智公司完成。
(3)IL-12基因定点突变
将回收纯化后的重组pcDNA3.1-IL12质粒为模板，以F:5’AAGCTCAAGTATGAACTCTACACCAGCAGCTTC 3’和R:5’GAAGCTGCTGGTGTAGAGTTCATACTTGAGCTT 3’为引物，采用overlapPCR法进行点突变，扩增循环参数为：95℃2min，94℃20s，55℃10s，68℃2.5min，共18个循环；68℃延伸5min。在PCR扩增产物中加Dpn1酶1μL 37℃水浴消化1h。取消化后PCR产物5μL，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，再将大肠杆菌涂布在含有相应抗生素的平板上，倒置37℃培养箱过夜。进行菌液PCR鉴定正确后，进行测序鉴定，得到IL-12 p40的第222位Asn突变Leu的重组突变体IL-12质粒。其中，点突变试剂盒使用的是天根快速定点突变试剂盒。
(4)慢病毒的包装
慢病毒包装细胞HEK293FT的培养条件为添加体积分数10％胎牛血清的H-DMEM，转染前一天采用6cm培养皿传代铺板，第二天进行转染，转染时HEK293FT细胞达到70％融合。分别取2.5μg重组野生型IL-12质粒和2.5μg重组突变体IL-12质粒与包装质粒1.25μgpMD2G和1.25μg pCMVdR8，在不含血清和双抗的opti-MEM中与Lipofectamine 2000混合，室温孵育15min，形成DNA Lipofectamine 2000复合物后，转染HEK293FT细胞，6h后更换为含血清的正常培养基，24h后换液，48h后收集培养基，3000rpm离心15min，吸取上清液，得到含有野生型IL-12基因的重组慢病毒载体和含有突变型IL-12基因的重组慢病毒载体。将含有野生型IL-12基因的重组慢病毒载体和含有突变型IL-12基因的重组慢病毒载体分别加入到等体积的胎牛血清中，混匀，得到重组慢病毒浓缩液，分装后-80℃保存。其中，H-DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，
(5)野生型IL-12蛋白和IL-12蛋白突变体的蛋白表达及总蛋白的制备
将含有野生型IL-12基因的重组慢病毒载体和含有突变型IL-12基因的重组慢病毒载体的重组慢病毒浓缩液分别加入至已培养至对数生长期的白血病细胞株K562细胞中进行感染。24h后观察GFP的表达，确定慢病毒已整合到宿主细胞中，对重组K562细胞进行Western实验鉴定蛋白的表达。同时，分别离心收集表达野生型IL-12蛋白和IL-12蛋白突变体的K562细胞并采用低温超声破碎获取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，调整野生型IL-12蛋白和IL-12蛋白突变体的蛋白浓度至1mg/ml。
实施例2
用含EDTA抗凝剂的一次性无菌采血管无菌采集健康志愿者外周血，采血量50mL，共两份。
(1)细胞培养瓶包被
在T175培养瓶中加入18ml PBS后加入CD16单抗和Her2单抗混匀，CD16单抗和Her2单抗的浓度分别为1μg/mL和0.6mg/mL，4℃冰箱过夜或置于37℃培养箱中，包被至少2h。其中，CD16单抗及Her2单抗购自美国Beckman公司。
(2)自体血浆制备
将抽取到的两份50mL抗凝外周血分别800g、室温离心15min。取上清血浆置于水浴锅中56℃孵育30min，然后转-20℃冰箱，静置10min，最后1100g、室温离心15min，取上清，得到两份自体血浆，4℃保存备用。
(3)人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的制备
取步骤(2)抗凝外周血800g、室温离心15min后的两份下部细胞成分，分别加PBS至50mL，混匀，再分别加到2个装有13ml医疗级人淋巴细胞分离液的50mL高效离心管中，800g、室温离心15min，离心时保持离心机缓慢升速，缓慢降速。离心后取细胞层，分别加未添加因子的NK细胞无血清培养基ALys5505NK-EX至50mL，600g、室温离心10min，弃上清液，得到两份PBMC。其中，NK细胞无血清培养基ALys5505NK-EX购自日本株式会社生物科学研究所，医疗级人淋巴细胞分离液为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。
(4)NK细胞体外培养
将两份PBMC进行NK细胞体外培养，分为对照组和实验组，对照组和实验组PBMC中分别加入ALys5505NK-EX培养基，配制成两份40mL细胞悬液，再分别转移到步骤(1)弃去包被液的培养瓶中，加入IL-2和IL-15，同时加入5mL步骤(2)自体血浆，对照组中加入野生型IL-12蛋白，实验组中加入IL-12蛋白突变体，轻轻吹打混匀，使PBMC在活化培养基中进行活化，IL-2和IL-15在活化培养基中的浓度分别为500U/mL和2ng/mL，野生型IL-12蛋白和IL-12蛋白突变体在活化培养基中的浓度为1mg/mL，置于饱和湿度、37℃、体积分数5.0％CO2培养箱中培养。第3天和第5天，分别补加40mL和70mL ALys5505NK-EX培养基，同时加入5mL血浆，补加IL-2和IL-15，使IL-2和IL-15在活化培养基中的浓度分别维持在500U/mL和2ng/mL。同时在对照组和实验组分别补加野生型IL-12蛋白和IL-12蛋白突变体，使野生型IL-12蛋白和IL-12蛋白突变体在活化培养基中的浓度维持在1mg/mL。第7天，将对照组和实验组培养瓶中细胞完全吹打下来，加入剩下自体血浆，分别转移到培养袋，补液至500mL并加入IL-2和IL-15，使PBMC在增殖培养基中进行增殖，IL-2和IL-15在增殖培养基中的浓度分别为1000U/mL和2ng/mL。第10天和第13天，视细胞生长状态，分别补加ALys5505NK-EX培养基500mL和1L，同时补加IL-2和IL-15，使IL-2和IL-15在增殖培养基中的浓度分别维持在1000U/mL和2ng/mL。其中，注射用IL-2购自沈阳三生制药股份有限公司，IL-15购自美国Abbkine公司，细胞培养袋购自日本NIPRO公司。
实施例3体外培养NK细胞
分别在第0天、第7天、第14天及第21天从对照组和实验组取培养后的细胞用台盼蓝染色后计数，计算细胞的扩增倍数并绘制细胞扩增曲线，动态比较对照组和实验组细胞的扩增情况。其中，台盼蓝染液购自北京索莱宝科技有限公司。
结果如图1所示。图1表明，在第7天、第14天及第21天，实验组的细胞扩增倍数高于对照组的细胞扩增倍数，说明IL-12蛋白突变体能够有效刺激NK细胞的扩增，采用本发明NK细胞培养体系能够有效刺激NK细胞的扩增。
实施例4体外培养NK细胞的表型分析
在第15天取对照组和实验组的细胞培养液，用PBS洗涤两次后，洗涤后调整细胞浓度为1×106个/ml，加入流式抗体CD3、CD56和CD16，4℃避光孵育30min，用PBS洗涤两次洗掉多余抗体，用200μL PBS重悬细胞，流式细胞仪进行细胞表型检测CD3-CD56+CD16+NK细胞的比例。其中，流式细胞仪及抗体购自美国BD公司。
结果见图2，对照组的CD3-CD56+CD16+NK细胞约占76％，实验组CD3-CD56+CD16+NK细胞占95％，实验组NK细胞的纯度明显高于对照组，表明IL-12蛋白突变体能够提高NK细胞的纯度，采用本发明NK细胞培养体系能够有效提高NK细胞的纯度。
实施例5 CCK-8法检测NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性
收集培养至15天的NK细胞作为效应细胞，取对数生长期的K562细胞系作靶细胞，检测对照组和实验组中的NK细胞对K562细胞的杀伤能力。分别将对照组和实验组的NK细胞及K562细胞重悬于无血清培养基中，调整NK细胞和K562细胞的浓度分别为1×106个/ml和1×105个/ml，按照效靶细胞比5：1、10：1和20：1加入到96孔板，同时设置单纯K562细胞组和单纯NK细胞组作为对照，每组设3个孔。置于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养24h后，每孔加入10μL CCK-8，摇匀，继续培养4h,比色法测450nm吸光度值，计算杀伤率。计算杀伤率：细胞毒作用(％)＝[1－(实验组OD值－单独NK细OD值)/单独K562细胞OD值]×100％。其中人红白血病细胞株K562为NK敏感细胞株，用作检测NK细胞的细胞毒作用靶细胞，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所。
结果如图3所示，图3表明对照组和实验组NK细胞均对K562细胞具有杀伤活性，而实验组NK细胞的杀伤效率明显高于对照组，在效靶比20：1的条件下杀瘤效率最高可达到98％，说明IL-12蛋白突变体能够增强NK细胞对肿瘤的杀伤能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏禄亿生生物科技有限公司
<120> 一种IL-12蛋白突变体及其制备方法和应用、NK细胞培养体系和培养NK细胞的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1743
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagttggccc cctgggtcag cctcccagcc accgccctca 1020
cctgccgcgg ccacaggtct gcatccagcg gctcgccctg tgtccctgca gtgccggctc 1080
agcatgtgtc cagcgcgcag cctcctcctt gtggctaccc tggtcctcct ggaccacctc 1140
agtttggcca gaaacctccc cgtggccact ccagacccag gaatgttccc atgccttcac 1200
cactcccaaa acctgctgag ggccgtcagc aacatgctcc agaaggccag acaaactcta 1260
gaattttacc cttgcacttc tgaagagatt gatcatgaag atatcacaaa agataaaacc 1320
agcacagtgg aggcctgttt accattggaa ttaaccaaga atgagagttg cctaaattcc 1380
agagagacct ctttcataac taatgggagt tgcctggcct ccagaaagac ctcttttatg 1440
atggccctgt gccttagtag tatttatgaa gacttgaaga tgtaccaggt ggagttcaag 1500
accatgaatg caaagcttct gatggatcct aagaggcaga tctttctaga tcaaaacatg 1560
ctggcagtta ttgatgagct gatgcaggcc ctgaatttca acagtgagac tgtgccacaa 1620
aaatcctccc ttgaagaacc ggatttttat aaaactaaaa tcaagctctg catacttctt 1680
catgctttca gaattcgggc agtgactatt gatagagtga tgagctatct gaatgcttcc 1740
taa 1743

Claims (10)

1.一种IL-12蛋白突变体，其特征在于，IL-12蛋白突变体由突变型IL-12基因所编码；
所述突变型IL-12基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.权利要求1所述IL-12蛋白突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将IL-12基因的IL-12p40的第222位Asn突变为Leu，得到突变型IL-12基因；
2)将所述突变型IL-12基因进行蛋白表达，得到IL-12蛋白突变体。
3.权利要求1所述IL-12蛋白突变体和权利要求2所述制备方法制得的IL-12蛋白突变体在培养NK细胞中的应用。
4.一种NK细胞培养体系，其特征在于，包括：活化培养基和增殖培养基；
所述活化培养基包括第一添加物；
所述第一添加物包括权利要求1所述IL-12蛋白突变体或权利要求2所述制备方法制得的IL-12蛋白突变体。
5.根据权利要求4所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述IL-12蛋白突变体在所述活化培养基中的浓度为0.5mg/mL～1.5mg/mL。
6.根据权利要求4所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述第一添加物还包括：CD16单抗、Her2单抗、IL-2和IL-15。
7.根据权利要求6所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述CD16单抗在所述活化培养基中的浓度为1μg/mL～100μg/mL；
所述Her2单抗在所述活化培养基中的浓度为0.5mg/mL～1mg/mL；
所述IL-2在所述活化培养基中的浓度为500U/mL～1500U/mL；
所述IL-15在所述活化培养基中的浓度为1ng/mL～30ng/mL。
8.根据权利要求4所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述增殖培养基包括第二添加物；
所述第二添加物包括IL-2和IL-15；
所述IL-2在所述增殖培养基中的浓度为500U/mL～1500U/mL；
所述IL-15在所述增殖培养基中的浓度为1ng/mL～30ng/mL。
9.一种培养NK细胞的方法，其特征在于，采用权利要求4至8任意一项所述NK细胞培养体系进行NK细胞培养，包括以下步骤：
a)将单个核细胞接种于所述活化培养基中进行活化，得到活化培养细胞；
b)将所述活化培养细胞接种于所述增殖培养基中进行增殖，得到增殖细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤a)所述将单个核细胞接种于所述活化培养基中进行活化之后还包括：补加所述第一添加物。
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