CN1839202B - 细胞毒性淋巴细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细胞毒性淋巴细胞的制备方法，其特征在于，它包括选自应用培养基中血清和血浆的总浓度为0容量％或以上但小于5容量％的培养基，在纤连蛋白、其片段或其混合物存在下诱导、维持及扩大培养细胞毒性淋巴细胞中的至少一种步骤。
Description
技术领域
本发明涉及在医疗领域中有用的、获得细胞毒性淋巴细胞的方法。
技术背景
生物体主要通过免疫应答保护机体免受异物的侵袭，免疫系统由各种各样的细胞及其分泌的可溶性因子构成。其中起核心作用的为白细胞，特别是淋巴细胞。淋巴细胞主要分为B淋巴细胞(以下，记作B细胞)和T淋巴细胞(以下，记作T细胞)2种，每一种均通过特异性识别抗原、作用于抗原而发挥防御作用。
T细胞分为辅助性T细胞(以下称作TH)和细胞毒性T细胞(TC：细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte)，也叫做杀伤性T细胞。以下有时称作CTL。)两个亚类。辅助性T细胞有CD(分化群)4标志、主要参与辅助抗体的产生和各种免疫应答的诱导；细胞毒性T细胞有CD8标志、主要具有细胞杀伤活性。CTL对识别、破坏、去除肿瘤细胞和病毒感染细胞等起最重要的作用，它不象B细胞那样只产生抗原特异性地抗体反应，它直接识别与靶细胞膜表面上存在的主要组织相容性复合体(MHC：人类称作人白细胞抗原(HLA))I类分子结合的靶细胞来源的抗原(抗原肽)。此时，CTL膜表面的T细胞受体(以下，称作TCR)特异性识别上述抗原肽及MHC-I类分子，判断抗原肽是自身来源的还是非自身来源的。然后，由CTL特异性破坏、去除非自身来源的靶细胞。
近年，人们又重新评估药物疗法和放射线疗法等给患者带来沉重肉体负担的治疗方法，对给患者肉体负担较轻的免疫疗法的关注较高。尤其关注过继性免疫疗法的有效性，该方法是从免疫功能正常的人来源的淋巴细胞先体外后体内诱导对目的抗原产生特异反应的CTL后、或者不进行诱导而扩大培养淋巴细胞后移入患者。例如，动物模型中提示过继性免疫疗法是一种对病毒感染和肿瘤有效的治疗方法(例如，Greenberg，P.D.著，1992年发行，Advances in Immunology及Reusser P.等4人，Blood，1991年，Vol.78，No.5，P1373～1380)。该方法中，维持或增加CTL的细胞数对维持或增强CTL的抗原特异性杀伤活性很重要。
在上述过继性免疫疗法中，为了取得治疗效果，施用一定量以上数目的细胞毒性淋巴细胞是必要的。也就是说，先体外后体内(ex vivo)短时间内获得这些细胞数是最大的问题。
为了维持或增加CTL的抗原特异性杀伤活性，在诱导CTL对抗原的特异性应答时，通常应用用目的抗原进行反复刺激的方法。但是，通常，该方法最终所得CTL数目减少，得不到足够的细胞数。
作为对疾病治疗有效的T细胞的制备方法，已知有，例如应用淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK细胞)的过继性免疫疗法(例如，Rosenberg S.A.等人，N.Engl.J.Med.1987年，Vol.316，No.15，P889～897)、用高浓度的白细胞介素2(IL-2)诱导的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的过继性免疫疗法(例如，Rosenberg S.A.等人，N.Engl.J.Med.1988年，Vol.319，No.25，P1676～1680及Ho M.等10人，Blood，1993年，Vol.81，No.8，P2093～2101)。
其次，关于抗原特异性CTL的制备有这样的报道：分别应用自身CMV感染的成纤维细胞和IL-2(例如，Riddell S.A.等5人，J.Immunol.，1991年，Vol.146，No.8，P2795～2804)，或者应用抗CD3单克隆抗体(抗CD3mAb)与IL-2，分离并大量培养CMV特异的CTL克隆的方法(例如，Greenberg P.D.，等2人，J.Immunol.Methods，1990年，Vol.128，No.2，P189～201)。
还有国际公布第96/06929号公报中阐明的REM法(rapidexpansion method)。REM法是短期内使包括抗原特异性CTL及TH的初级T细胞增殖的方法。总之，该方法能使各T细胞克隆增殖，提供大量的T细胞，其特征在于，应用抗CD3抗体、IL-2、经放射线照射的无增殖能力的PBMC(peripheral blood mononuclear cell，末梢血单个核细胞)和EB病毒(Epstein-Barr virus，以下略作EBV)感染细胞，使抗原特异性CTL数目增加。
此外，国际公布第97/32970号公报中公开了改良的REM法，该方法中使用与PBMC不同，将能表达T细胞刺激成分但不分裂的哺乳动物细胞株作饲养细胞，减低了PBMC的使用量。
淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK细胞)是向包含淋巴细胞的末梢血(末梢血白细胞)和脐带血、组织液等中加入IL-2，体外培养数日而得到的具有细胞杀伤活性的细胞团。该过程中，加入抗CD3抗体进行培养时，可加速LAK细胞的增殖。如此得到的LAK细胞对各种癌细胞和其它靶细胞具有非特异性杀伤活性。LAK细胞与上述CTL同样可用于过继性免疫疗法。
如上所述，获得细胞毒性淋巴细胞例如CTL、LAK细胞、TIL等的过程中，IL-2的利用是不可欠缺的。IL-2通过与细胞表面的白细胞介素-2受体(IL-2R)结合使细胞活化。已知，IL-2R可作为淋巴细胞活化的标志。从这一点上讲，增加细胞表面IL-2R的表达很重要。另外，在CTL的诱导中，提高诱导通过抗原刺激所得的CTL前体细胞成为CTL的效率，也就是说，提高诱导后细胞群中CD8阳性细胞的比率很重要。
另外，体外扩大培养这些淋巴细胞时，通常添加5％～20％体积的血清或血浆。血清或血浆是先体外后体内培养淋巴细胞等细胞时的必要成分，但由于血清、血浆来源于非自身动物(人、牛等)的血液，所以不能排除各种病毒感染的危险性。另外，也不可能完全否定用现在检测技术检测不出来的病毒、病原性微生物的存在。
考虑到这一点，近年人们向往使用患者来源的血清、血浆(自身血清、血浆)。但是，要确保培养中必要量的血清、血浆，就要多量采取患者自身的血液，这对患者的肉体负担很大，有可能危及生命。为了避免这种危险，应用少量的血清、血浆进行扩大培养获得治疗所必要的淋巴细胞时，必然在低浓度血清、血浆的条件下进行培养。一般情况下，淋巴细胞等细胞在低血清、低血浆条件下进行培养时，增殖不稳定，得不到治疗所必要量的细胞。再者，为了避免上述肉体的负担和感染的危险性，强烈要求无血清培养，但在这样的培养条件下，细胞基本上不增殖。
因此，非常需要低血清、无血清(低血浆、无血浆)条件下的淋巴细胞扩大培养方法。
若能确立无血清(无血浆)条件下的淋巴细胞扩大培养方法，就可排除血清、血浆的批间差异，排除患者血清、血浆来源的负面因素(免疫抑制成分等)，因该体系的确立而得的利益将无以计算。
纤连蛋白是一种分子量25万的巨大糖蛋白，存在于动物的血液中、培养细胞表面、组织的细胞外基质中，具有多种多样的功能。其结构域分成7个(参照以下图1)，其氨基酸序列中包含3种类似的序列，这些序列重复构成了整体。3种类似序列叫做I型、II型、III型，其中III型由71～96个氨基酸残基构成，这些氨基酸残基的一致率为17％～40％。纤连蛋白中存在14个III型序列，其中第8、9、10号(以下分别叫做III-8、III-9、III-10)包含细胞结合功能域，第12、13、14号(以下分别叫做III-12、III-13、III-14)包含肝素结合功能域。另外，III-10中包含VLA(very late activation antigen)-5结合区域，其核心序列为RGDS。另外，肝素结合功能域的C末端存在叫做IIICS的区域。IIICS中存在由25个氨基酸构成的叫做CS-1的区域，该区域具有VLA-4结合活性(例如，Deane F.Momer著，1988年，FIBRONECTIN，ACADEMIC PRESS INC.，P1～8；Kimizuka F.等9人，J.Biochem.，1991年，Vol.110，No.2，P284～291；Hanenberg H.等6人，Human Gene Therapy，1997，Vol.8，No.18，p2193～2206)。
本发明的目的是提供细胞毒性淋巴细胞的获得方法，该方法安全性高、适于医疗应用，细胞毒性淋巴细胞保持高水平地细胞杀伤活性。
概括地说，本发明的第一方面涉及细胞毒性淋巴细胞的制备方法，其特征在于，它包括选自应用培养基中血清和血浆的总浓度为0容量％或以上但小于5容量％的培养基，在纤连蛋白、其片段或其混合物存在下诱导、维持及扩大培养细胞毒性淋巴细胞中的至少一种步骤。与不存在纤连蛋白、其片段或其混合物的条件下制备的淋巴细胞相比，本发明的第一方面制备的细胞毒性淋巴细胞，是高表达白细胞介素2受体的细胞毒性淋巴细胞。另外，与不存在纤连蛋白、其片段或其混合物的条件下制备的淋巴细胞相比，本发明的第一方面制备的细胞毒性淋巴细胞，是所含CD8阳性细胞比率高的细胞毒性淋巴细胞。此外，与不存在纤连蛋白、其片段或其混合物的条件下制备的淋巴细胞相比，本发明的第一方面制备的细胞毒性淋巴细胞，是扩大培养率高的细胞毒性淋巴细胞。另外，与不存在纤连蛋白、其片段或其混合物的条件下制备的淋巴细胞相比，本发明的第一方面制备的细胞毒性淋巴细胞，是细胞杀伤活性增强或能维持高细胞杀伤活性的细胞毒性淋巴细胞。
本发明的第一方面中使用的纤连蛋白、其片段或其混合物，可将其固化成固相使用。可使用细胞培养用器材或细胞培养用载体作为固相。可应用平皿、培养瓶、或袋(バツグ)作为细胞培养用器材；应用珠子、膜或载玻片等作为细胞培养用载体。
本发明的第一方面中，细胞毒性淋巴细胞为淋巴因子活化的杀伤细胞。
本发明的第一方面中，纤连蛋白的片段为至少包含一种序列表中序列号1～8所示的任一氨基酸序列的多肽(m)，或为至少包含一种上述任一氨基酸序列中1或多个氨基酸发生置换、缺失、插入或附加的氨基酸序列的多肽，与上述多肽(m)具有同等功能的多肽(n)。纤连蛋白的片段具有细胞附着活性和/或肝素结合活性。此外，纤连蛋白的片段为选自具有序列表中序列号9～20及25所示的任一氨基酸序列中多肽的至少一种多肽。
本发明的第一方面中，作为在细胞培养用器材中实施该制造方法时的一实施方案，满足这样的条件：
(a)细胞培养开始时的细胞数与细胞培养用器材培养面积的比率为1细胞/cm2～5×105细胞/cm2，和/或
(b)培养开始时培养基中的细胞浓度为1细胞/mL～5×105细胞/mL。
此外，这样的制备方法是不需要细胞培养液稀释步骤的方法。
本发明的第一方面中，纤连蛋白、其片段或其混合物存在下、在含培养基的细胞培养用器材中进行细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持及扩大培养中的至少任何一种时，包含例如至少一次的细胞培养液稀释步骤、培养基的交换步骤或细胞培养用器材的交换步骤，且至少一次的细胞培养液稀释步骤、培养基的交换步骤或细胞培养用器材的交换步骤之后紧接着的培养条件满足：(c)细胞培养液中细胞的浓度为2×105细胞/mL～1×108细胞/mL，或
(d)细胞培养液中细胞数与细胞培养用器材培养面积的比率为1×105细胞/cm2～1×108细胞/cm2。
本发明的第一方面的制备方法，其中纤连蛋白、其片段或其混合物存在下、在含培养基的细胞培养用器材中进行细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持及扩大培养中的至少任何一种时，没有特殊的限制，例如包含至少一次的细胞培养液稀释步骤、培养基的交换步骤或细胞培养用器材的交换步骤，且至少一次的细胞培养液稀释步骤、培养基的交换步骤或细胞培养用器材的交换步骤之后的培养基中血清及血浆的总浓度与开始培养时相同，或者比开始培养时降低。
本发明的第一方面，其中还包含将外源基因导入细胞毒性淋巴细胞的步骤的方法。外源基因的导入可应用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或猴病毒导入。
本发明的第二方面涉及用本发明的第一方面的方法而得的细胞毒性淋巴细胞。
本发明的第三方面涉及以用本发明的第一方面的方法而得的细胞毒性淋巴细胞为有效成分的药物。
本发明的第四方面涉及细胞毒性淋巴细胞培养用的培养基，其特征在于，它包含纤连蛋白、其片段或其混合物作有效成分、且血清及血浆的总浓度在0容量％或以上但小于5容量％。
本发明提供安全性高、能减轻患者负担的细胞毒性淋巴细胞的制备方法。
附图简述
图1为纤连蛋白功能域结构示意图。
实施发明的最佳状态
本发明由发现了在细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持或扩大培养方法中，通过纤连蛋白和/或纤连蛋白片段的存在下制备细胞毒性淋巴细胞，可降低或去除培养基中的血清和血浆的含量，高扩大培养率下获得具有充分的细胞杀伤活性、IL-2R表达量高、CD8阳性细胞的比率高的细胞毒性淋巴细胞，由此完成了本发明。
本说明书中细胞毒性淋巴细胞的制备是指包含该细胞的诱导(活化)、维持、扩大培养各步骤，或这些步骤的组合。另外，本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备也叫做细胞毒性淋巴细胞的培养。
以下，对本发明进行具体说明。
(1)本发明中使用的纤连蛋白及其片段
本说明书中描述的纤连蛋白及其片段既可是天然获得的，也可是人为合成的。纤连蛋白及其片段，例如可根据[Ruoslahti E.等J.Biol.Chem.，第256卷，第14号，第7277～7281]的公开，从天然起源的物质制备基本上纯的产品。这里，本说明书中描述的基本上纯的纤连蛋白或纤连蛋白片段是指基本上不包含与天然纤连蛋白一起存在的其它蛋白质。本发明中使用的上述纤连蛋白及其片段，可分别单独、或多种种类混合使用。
已知，纤连蛋白存在多种可变剪接体，本发明中使用的纤连蛋白可以使用任何一种剪接体，只要能发挥本发明期望的效果即可。例如，血浆来源的纤连蛋白，已知其缺失下述功能区域的血浆来源的纤连蛋白，所述功能区域中存在于细胞结合功能域上游的叫做EDB的区域、存在于细胞结合功能域和肝素结合功能域之间的叫做EDA的区域。
有关本发明中可使用的纤连蛋白片段以及该片段的制备的有用资料可从Kimiduka F.，等[Kimiduka F.，等，J.Biochem，第110卷，第284～291页(1991)；Kornbrihtt A.R.等人，EMBO J.，第4卷，第7号，1755～1759(1985)]及Sekiguchi K等[Sekigchi K.，等，Biochemistry，第25卷，第17号，4936～4941(1986)]获得。纤连蛋白的氨基酸序列公开于Genbank Accession No.NM_002026(NP_002071)。
本发明中纤连蛋白片段为，例如，至少包含一种构成III-8(序列表中序列号1表示的氨基酸序列)、III-9(序列表中序列号2表示的氨基酸序列)、III-10(序列表中序列号3表示的氨基酸序列)、III-11(序列表中序列号4表示的氨基酸序列)、III-12(序列表中序列号5表示的氨基酸序列)、III-13(序列表中序列号6表示的氨基酸序列)、III-14(序列表中序列号7表示的氨基酸序列)及CS-1(序列表中序列号8表示的氨基酸序列)任一区域的氨基酸序列的多肽(m)(参照图1)；至少包含一种在上述任一氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生置换、缺失、插入或附加的氨基酸序列的多肽；与上述多肽(m)具有同等功能的多肽(n)。
另外，该片段具有细胞附着活性和/或肝素结合活性的更适于应用。细胞附着活性，可通过使用众知的方法测定本发明使用的片段(其细胞结合功能域)与细胞的结合而进行测定。例如，Williams D.A.等，[Williams D.A.等，Nature，第352卷，第438～441(1991)]中包含该方法。该方法是测定固化到培养板上的片段的细胞结合能力。另外，肝素结合活性，可通过使用众知的方法测定本发明使用的片段(其肝素结合功能域)与肝素的结合而进行检测。例如，上述Williams D.A.等方法中，将细胞换成肝素，例如通过使用标记的肝素，可用同样的方法评价片段与肝素的结合。
再者，纤连蛋白的片段为选自C-274(序列表中序列号9表示的氨基酸序列)、H-271(序列表中序列号10表示的氨基酸序列)、H-296(序列表中序列号11表示的氨基酸序列)、CH-271(序列表中序列号12表示的氨基酸序列)、CH-296(序列表中序列号13表示的氨基酸序列)、CS1(序列表中序列号14表示的氨基酸序列)、或CH-296Na(序列表中序列号25表示的氨基酸序列)的多肽。CH-296Na是本说明书中首次制备出的多肽。
上述CH-271、CH-296、CH-296Na、C-274、C-CS1各片段是具有细胞结合功能域的多肽，具有VLA-5结合活性。另外，C-CS1、H-296、CH-296、CH-296Na是具有CS-1的多肽，具有与VLA-4结合的活性。H-271、H-296、CH-271、CH-296及CH-296Na是具有肝素结合功能域的多肽。CH-296Na是包含血浆来源的纤连蛋白中从细胞结合功能域到CS-1的多肽。也就是说，CH-296Na是包含Genbank Accession No.NM_002026(NP_002017)中公开的纤连蛋白氨基酸序列中从第1270位的脯氨酸到第2016位的苏氨酸的多肽，缺失从第1631位的天冬酰胺到1720位的苏氨酸区域(ED-A)。
本发明中也可使用上述各功能域改变了的片段。纤连蛋白的肝素结合功能域由3个III型序列(III-12、III-13、III-14)构成。包含肝素结合功能域的、缺失上述一个或两个III型序列的片段也可在本发明中使用。包括，例如，纤连蛋白的细胞结合部位(VLA-5结合区域，Pro1239～Ser1515)与1个III型序列结合的片段CHV-89(序列表中序列号15所示的氨基酸序列)、CHV-90(序列表中序列号16所示的氨基酸序列)、CHV-92(序列表中序列号17所示的氨基酸序列)，或者与两个III型序列结合的片段CHV-179(序列表中序列号18所示的氨基酸序列)、CHV-181(序列表中序列号19所示的氨基酸序列)。CHV-89、CHV-90、CHV-92分别包含III-13、III-14、III-12，CHV-179包含III-13和III-14，CHV-181包含III-12和III-13。
另外，上述各片段中附加了氨基酸的片段也可在本发明中使用。这些片段可，例如按照后述的制造例中描述的H-275-Cys的制备方法，通过向上述各片段中附加预期的氨基酸而制备。例如，H-275-Cys(序列表中序列号20所示的氨基酸序列)是具有纤连蛋白的肝素结合功能域、且C末端具有半胱氨酸的片段。
本发明中使用的片段，只要能达到本发明预期的效果，也可是与至少包含部分上述示例中天然的纤连蛋白的氨基酸序列的片段具有同等功能、构成该片段的多肽的氨基酸序列中1个或多个氨基酸序列发生置换、缺失、插入或附加的片段。
氨基酸的置换等优选在能维持原来多肽功能的范围内改变多肽的理化性状等。例如，氨基酸的置换等优选在基本上不改变原本多肽具有的性质(例如，疏水性、亲水性、电荷、pK等)范围内进行。例如，氨基酸的置换可以是1.甘氨酸、丙氨酸；2.缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；3.天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；4.丝氨酸、苏氨酸；5.赖氨酸、精氨酸；6.苯丙氨酸、酪氨酸各组内置换；氨基酸的缺失、附加、插入优选在多肽中在基本上不改变靶部位周边性质的范围内在多肽中插入、附加、缺失具有与靶部位周边性质类似的氨基酸。
氨基酸的置换可以是因种间和个体差异而造成的天然发生，也可是人工诱导而造成的。可根据众所周知的方法进行人工诱导，对此没有特殊限定，例如，可根据众知的方法，在天然纤连蛋白来源的上述区域和编码特定片段的核酸中进行1个或多个碱基的置换、缺失、附加或插入，从而制备成特定的核酸，使用它可制备成与天然纤连蛋白来源的上述区域和特定片段具有同等功能、包含构成该片段等的多肽的氨基酸序列中发生置换等的氨基酸序列的多肽。
另外，本说明书中的“具有同等功能”是指作为比较对照的多肽至少具有天然来源的纤连蛋白片段所具有的(i)增强或维持细胞毒性淋巴细胞的细胞杀伤活性的功能；(ii)增强IL-2R表达量的功能；(iii)增加CD8阳性细胞比率的功能；(iv)增加细胞毒性淋巴细胞的扩大培养率的功能中的任一功能。上述功能可按照后面实施例中描述的方法进行适当确认。另外，由氨基酸发生置换等的多肽构成的片段具有细胞附着活性和/或肝素结合活性的较适合。细胞附着活性和/或肝素结合活性可按照上述活性测定方法进行评价。
由氨基酸发生置换等的多肽构成的片段，例如2个不同功能域间插入1个以上的氨基酸接头的片段也可在本发明中使用。
与上述片段同样，对于纤连蛋白而言，其多肽的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸发生置换、缺失、附加或插入的多肽、至少具有上述(i)～(iv)任一功能的多肽也可在本发明中使用。
本说明书中描述的纤连蛋白片段，例如，可参照美国专利第5198423号说明书描述的通过基因重组体而进行制备。例如，上述H-271(序列号10)、H-296(序列号11)、CH-271(序列号12)、CH-296(序列号13)的各片段以及其获得方法均在该说明书中有详细描述。另外，CH-296Na(序列号25)及其制备方法在后面的(3)CH-296Na及实施例中有记载。上述C-274(序列号109)片段可通过在美国专利第5102988号说明书中描述的方法而获得。C-CS1(序列号14)片段可通过在日本专利第3104178号说明书中描述的方法而获得。CHV-89(序列号15)、CHV-90(序列号16)、CHV-179(序列号18)各片段可通过在日本专利第2729712号说明书中描述的方法而获得。CHV-181(序列号19)片段可按照国际公布第97/18318号公报中描述的方法而获得。CHV-92(序列号17)片段可参照日本专利第2729712号说明书及国际公布第97/18318号公报，以这些文献中描述的质粒为基础构建特定的质粒，应用该质粒通过基因工程学方法而获得上述片段。
这些片段或从这些片段而定向诱导的片段可应用于305-8566日本国茨城县筑波东1丁目1番地1中央第6独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心以下述保藏号保藏的微生物进行制备，或者按照众知的方法通过改变各微生物的质粒而进行制备：
FERM BP-2264(保有编码H-271的质粒的大肠杆菌，保藏日1989年1月30日)，
FERM BP-2800(保有编码CH-296的质粒的大肠杆菌，保藏日1989年5月12日)，
FERM BP-2799(保有编码CH-271的质粒的大肠杆菌，保藏日1989年5月12日)，
FERM BP-7420(保有编码H-296的质粒的大肠杆菌，保藏日1989年5月12日)，
FERM BP-1915(保有编码C-274的质粒的大肠杆菌，保藏日1988年6月17日)，
FERM BP-5723(保有编码C-CS1的质粒的大肠杆菌，保藏日1990年3月5日)，
FERM BP-10073(编码CH-296Na的质粒，保藏日2004年7月23日)，
FERM P-12182(保有编码CHV-89的质粒的大肠杆菌，保藏日1991年4月8日)，
FERM P-12183(保有编码CHV-179的质粒的大肠杆菌，保藏日1991年4月8日)。
由于纤连蛋白是巨大的糖蛋白，制备天然来源的蛋白质使用在产业上及药品制造上必然不容易。另外，由于纤连蛋白是多功能的蛋白质，根据其使用状况，考虑会固与本发明的方法中所示效果区域不同的区域而造成不便。因此，本发明中从获得、使用容易、安全方面考虑，使用纤连蛋白片段较适宜，使用如上所得重组纤连蛋白片段更适宜。后述的能显示增加淋巴细胞扩大培养率、增加扩大培养的淋巴细胞IL-2R表达量、增加扩大培养的淋巴细胞中CD8阳性细胞比率、提高细胞杀伤活性等效果的纤连蛋白片段尤其适于使用。另外，对本发明中使用的纤连蛋白片段的分子量无特殊限定，但优选1～200kD，更优选5～190kD、更优选10～180kD。其分子量，例如可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行测定。
构成本发明的纤连蛋白片段的多肽的氨基酸序列中，对除了构成天然来源的纤连蛋白片段的多肽的氨基酸序列以外的氨基酸序列部分，无特殊限定，只要不影响本发明预期效果的表达即可。
(2)本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法
以下，对本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法进行具体说明。本发明的方法是应用培养基中血清及血浆的总浓度为0容量％或以上但小于5容量％的培养基，在纤连蛋白、其片段或其混合物存在下，至少进行诱导、维持及扩大培养细胞毒性淋巴细胞中任何一种的细胞毒性淋巴细胞的制备方法。
本说明书中的细胞毒性淋巴细胞是指含有细胞毒性淋巴细胞的细胞群的意思。狭义地讲，仅指上述细胞群中所包含的细胞毒性淋巴细胞。另外，本发明中的细胞毒性淋巴细胞的制备包含从能成为本发明的细胞毒性淋巴细胞的前体细胞诱导成具有细胞杀伤活性的淋巴细胞、细胞毒性淋巴细胞的维持、应用细胞毒性淋巴细胞和/或前体细胞扩大培养细胞毒性淋巴细胞中的任何一种。本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法中，可根据供于该方法的细胞的种类和培养条件等进行适当调整，从而进行细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持或扩大培养。
对于本发明的细胞毒性淋巴细胞无特殊限定，例如，包括具有细胞杀伤活性的淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK细胞)、细胞毒性T细胞(CTL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、NK细胞等。
本发明中能成为细胞毒性淋巴细胞，即具有淋巴细胞分化潜能的前体细胞包括末梢血单核细胞(PBMC)、NK细胞、稚细胞、记忆细胞、造血干细胞、脐带血单核细胞等。另外，血细胞系的细胞可作为本发明中的前体细胞使用。这些细胞可直接从活体采集使用，也可冻存后使用。本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法中，含有上述细胞的材料，例如，末梢血液、脐带血等血液，从血液中去除红细胞和血浆等成分后的成分、骨髓液等均可使用。
本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法，其一大特征为，在选自纤连蛋白、其片段或其混合物的有效成分的存在下制备细胞毒性淋巴细胞。本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法，在细胞毒性淋巴细胞培养的全程、或者其间的任何一段时间内进行。也就是说，即使细胞毒性淋巴细胞的制备步骤中部分过程中包含上述步骤也包含在本发明的范围内。
此外，以往的细胞毒性淋巴细胞的扩大培养方法中，培养基中必需添加5～20％的血清、血浆，与此相对，本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法，其特征在于，血清、血浆在培养基中的总浓度在0容量％或以上但小于5容量％。血清、血浆在培养基中的总浓度优选在0容量％以上4容量％以下，特别优选在0容量％以上3容量％以下。本发明中特别优选的实施方案中，培养基中一点也不添加血清、血浆，可进行足量的细胞毒性淋巴细胞的制备，从安全性和减轻患者负担方面是非常有用的方法。此外，本发明中减低使用的血清、血浆使用量时，可在培养过程中阶段性地降低血清、血浆的使用量。也就是说，对应于培养开始时的血清、血浆浓度，在后面细胞培养液的稀释、培养基交换或细胞培养器材交换时降低新培养基中血清、血浆浓度或不添加，由此可常规降低血清、血浆的使用量。因此，本发明提供细胞毒性淋巴细胞的制备方法，它至少包括1次细胞培养液的稀释、培养基的交换或细胞培养用器材的交换，且至少1次的细胞培养液的稀释之后、培养基的交换或细胞培养用器材的交换之后，培养基中血清及血浆的总浓度与培养开始时相同，或比培养开始时降低。
作为血清或血浆的来源，既可是自身(指与使用的细胞毒性淋巴细胞的前体细胞来源相同)来源也可是非自身(指与使用的细胞毒性淋巴细胞的前体细胞来源不同)来源，但从安全性方面考虑，优选使用自身来源的。
本发明的方法中，细胞毒性淋巴细胞的制备，即细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持和/或扩大培养，通常在本发明的前面所述的有效成分的存在下、在包含规定成分的培养基中进行。
另外，本发明的方法中，想进行细胞毒性淋巴细胞的诱导或扩大培养时，对本发明中使用的培养开始时的细胞(细胞毒性淋巴细胞和/或前体细胞)数无特殊限定，例如，可以是1细胞/mL～1×108细胞/mL，优选1细胞/mL～5×107细/mL，更优选1细胞/mL～2×107细胞/mL。另外，对培养条件无特殊限定，使用常规细胞培养时使用的条件即可。例如，在37℃、5％CO2等条件下进行培养。在适当的时间间隔内加入新鲜的培养基稀释细胞培养液，或换培养基，或交换细胞培养用器材。
除血清及血浆的总浓度之外，对本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法中使用的培养基无特殊限定，可使用混合了细胞毒性淋巴细胞、其前体细胞的维持、生长所必需成分而制备的众所周知的培养基，例如可适当选择市售的培养基。这些培养基中除其原来的构成成分以外，还可包含适当的蛋白质、细胞因子类、其它成分。本发明中优选使用包含IL-2的培养基。对培养基中IL-2的浓度无特殊限定，例如优选0.01～1×105U/mL、更优选0.1～1×104U/mL。
对本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法中使用的细胞培养用器材无特殊限定，例如可使用平皿、培养瓶、培养袋、大型培养槽、生物反应器等。至于培养袋，可按下面实施例34～38及45～52中描述的，使用细胞培养用CO2通透性培养袋。另外，工业上大量制备淋巴细胞时，可使用大型培养槽。另外，培养既可使用开放体系，也可使用封闭体系，但从所得淋巴细胞的安全性方面考虑，优选使用封闭体系进行培养。
另外，在含有抗CD3抗体的培养基中也可培养成为细胞毒性淋巴细胞的前体细胞。对培养基中抗CD3抗体的浓度无特殊限定，例如优选0.001～100μg/mL，尤其是0.01～100μg/mL。添加抗CD3抗体的目的是活化淋巴细胞上的受体。此外，也可添加植物凝集素等刺激因子。这些成分在培养基中的浓度无特殊限定，只要能获得预期的效果即可。
含有本发明有效成分的上述成分除溶解在培养基中以外，还可固化到适当的固相上使用，例如固化到平皿、培养瓶、培养袋等细胞培养用器材(包含开发系统和封闭系统的)、或者珠子、膜、载玻片等细胞培养用载体上。固化到珠子上时，可按照下述实施例61～62描述的进行，制备的珠子按照下述实施例63～64描述的使用。对固相材质无特殊限定，只要能在细胞培养中使用即可。例如，将上述成分固化到上述器材上时，将培养基加入到器材上时，优选以与将该成分溶解到培养基中使用时期望的浓度同样的比率，针对加入到器材的培养基量固化一定量的各种成分，各成分的固化量无特殊限定，只要能获得期望的效果即可。上述载体可在细胞培养时浸渍到细胞培养用器材中的培养液中使用。将所述成分固化到上述载体时，将载体放入到培养基中时，优选以与将该成分溶解到培养基中使用时期望的浓度同样的比率，针对加入到器材的培养基量固化一定量的各种成分，各成分的固化量无特殊限定，只要能获得期望的效果即可。
例如，纤连蛋白片段的固化可按照国际公布第97/18318号公报、及国际公布第00/09618号公报中描述的方法进行。
若上述各种成分和本发明的有效成分固化到固相上，按本发明的方法获得细胞毒性淋巴细胞后，只有淋巴细胞与固相的分离，有效成分等与淋巴细胞能很容易地分离，可防止有效成分等混入淋巴细胞。
此外，国际公布第02/14481号公报中描述的对具有抗原特异性细胞杀伤活性的细胞毒性T细胞的诱导有效的酸性多糖、酸性寡糖、酸性单糖以及选自其盐的化合物，可与选自下面(A)～(D)的物质作为上述成分共同使用。
(A)具有CD44结合活性的物质
(B)通过CD44配体与CD44结合而调控信号传导的物质
(C)抑制生长因子与生长因子受体结合的物质
(D)通过生长因子与生长因子受体结合而调控信号传导的物质
作为具有CD44结合活性的物质的示例有，例如CD44配体和/或抗CD44抗体。作为通过CD44配体与CD44结合而调控信号传导的物质包括，例如各种磷酸酶及脱磷酸酶的抑制剂或活化剂等。作为抑制生长因子与生长因子受体结合的物质包括，例如具有生长因子结合活性、通过与生长因子形成复合体而抑制生长因子与生长因子受体结合的物质，或者具有生长因子受体结合活性而抑制生长因子与生长因子受体结合的物质。作为通过生长因子与生长因子受体结合而调控信号传导的物质包括，例如各种磷酸酶及脱磷酸酶的抑制剂或活化剂等。这些成分在培养基中的浓度无特殊限定，只要能获得预期效果即可。此外，这些成分除可溶解到培养基中与之共存之外，还可向前面那样固化到固相上使用。
上述各种物质可单独或2种以上混合使用。
本发明中所述有效成分存在下是指进行细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持或扩大培养时，有效成分在能发挥其功能的状态下存在，对其存在状态无特殊限定。例如，使用的有效成分溶解到培养基中时，进行培养的培养基中本发明的有效成分的含有量只要能获得预期效果即可，对此无特殊限定，但优选，例如优选0.0001～10000μg/mL、较优选0.001～10000μg/mL、更优选0.005～5000μg/mL、特别优选0.01～1000μg/mL。
测定用本发明的制备方法所得细胞毒性淋巴细胞IL-2R的表达量时发现，与纤连蛋白、其片段或其混合物非存在下诱导、维持及扩大培养中任一种而得的细胞毒性淋巴细胞相比，其IL-2R的表达量显著性增高。这里，可使用众所周知的方法，例如使用抗IL-2R抗体测定IL-2R的表达量。
如上所述，通过本发明的方法而获得的细胞毒性淋巴细胞其IL-2R的表达量增加。IL-2R是活化的T细胞表面表达的活化标志，伴随该分子的表达，细胞因子的产生、细胞杀伤活性、增殖活性等活化。因此，根据本发明的方法而获得的细胞毒性淋巴细胞是具有高活性的细胞群。
由于根据本发明的方法而获得的细胞毒性淋巴细胞其IL-2R的表达量增加，所以对添加到培养基中的IL-2、或细胞毒性淋巴细胞的前体细胞、淋巴细胞自身或共存的其它细胞产生的IL-2的刺激的感受性增加。因此，在IL-2少的环境下(例如体内等)也可自身活化。
此外，用本发明的制备方法所得细胞毒性淋巴细胞与纤连蛋白、其片段或其混合物非存在下诱导、维持及扩大培养中任一种而得的细胞毒性淋巴细胞相比，其具有CD8标志(CD8阳性)细胞的存在比率高。其具有如下优点，例如：1.CD8阳性细胞产生干扰素γ等细胞因子，引起免疫激活，使辅助性T细胞为Th1系；2.CD8阳性细胞为细胞性免疫细胞，可有效排除病毒和肿瘤细胞等异物；3.获得CD8阳性细胞时，与以往用磁珠和流式细胞仪纯化CD8阳性细胞相比，本发明的方法可边培养边富集CD8阳性细胞；4.由于CD8阳性细胞比率高，适于作为诱导CTL时的前体细胞使用；5.即使是CD8阳性细胞比率低的细胞团，也可边培养边提高CD8阳性细胞比率。因此，本发明的方法在细胞毒性淋巴细胞的制备中极其有用。
通过本发明的方法而获得的细胞毒性淋巴细胞中CD8阳性细胞的比率无特殊限定，可例如使用抗CD8抗体进行测定。
通过本发明的方法而获得的细胞毒性淋巴细胞，即使长期维持培养后的细胞、或使之增殖，仍具有维持以往观察到的高细胞杀伤活性的性质。也就是说，与纤连蛋白、其片段或其混合物非存在下诱导、维持及扩大培养中任一种而得的细胞毒性淋巴细胞相比，该细胞毒性淋巴细胞能维持较高的细胞杀伤活性。因此，通过将培养的细胞毒性淋巴细胞克隆化，可作为具有稳定细胞杀伤活性的淋巴细胞进行维持。另外，可对诱导的细胞毒性淋巴细胞施用抗原、各种细胞因子、抗CD3抗体刺激使之增殖，进行扩大培养。对细胞毒性淋巴细胞的维持、扩大培养无特殊限定，可应用众所周知的方法。
上述细胞毒性淋巴细胞的维持是指将细胞毒性淋巴细胞维持在保持细胞杀伤活性。其培养条件无特殊限定，可使用常规的细胞培养中使用的条件。例如，37℃、5％CO2等条件下进行培养。另外，在适当的时间间隔内将培养基换成新鲜的培养基。使用的培养基及同时使用的其它成分等与前面相同。
本发明的方法中细胞毒性淋巴细胞的维持和扩大培养，其一大特征在于，本发明的有效成分，即纤连蛋白、其片段或其混合物的存在下，在血清及血浆的总浓度为0容量％或以上但小于5容量％的培养基中，分别继续培养及扩大培养细胞毒性淋巴细胞。通过扩大培养，可在维持细胞毒性淋巴细胞所具有的细胞杀伤活性的状态下增加细胞数。也就是说，本发明的方法作为一个实施方案，提供细胞毒性淋巴细胞的扩大培养方法。
通过本发明的方法而获得的细胞毒性淋巴细胞，具有识别预期的靶细胞的能力，例如通过其细胞杀伤活性而破坏靶细胞。可通过众所周知的方法评价该细胞毒性淋巴细胞的细胞杀伤活性。例如，通过测定由细胞毒性淋巴细胞破坏的靶细胞而释放的放射活性和荧光强度而评价细胞毒性淋巴细胞对用放射性物质、荧光物质标记的靶细胞的细胞杀伤活性。另外，可通过测定从细胞毒性淋巴细胞和靶细胞特异分泌的GM-CSF、IFN-γ等细胞因子的量而进行检测。也可通过使用其它荧光色素标记的抗原肽-MHC复合体进行直接确认。此时，例如将细胞毒性淋巴细胞与细胞毒性淋巴细胞特异性抗体和偶联的第一荧光标志接触，然后与二荧光标志和偶联的抗原肽-MHC复合体进行接触，通过进行FACS(fluorescence-activated cell sorting)分析双重标记细胞的存在评价细胞毒性淋巴细胞的细胞杀伤活性。
作为本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法的特征，可从低细胞数开始培养。进行过继性免疫疗法必需大量的淋巴细胞，从患者获得大量的淋巴细胞很困难。此外，在常规的细胞毒性淋巴细胞的扩大培养中，有必要根据使用的细胞数而选择适当培养面积的细胞培养用器材和用适当的培养量进行培养。也就是说，通常，与细胞培养用器材的培养面积[即，培养基接触的器材表面部分的面积(cm2)]相对应的细胞量(个数)1×106细胞/cm2以上、细胞浓度1×106细胞/mL以上的高密度下开始培养，在此以下的细胞量条件下，扩大培养率[扩大培养后的细胞数与扩大培养前的细胞数之比(扩大培养后的细胞数/扩大培养前的细胞数)]非常低，要获得大量的细胞毒性淋巴细胞需要长期的培养。因此，一般而言，例如应用小的细胞培养器材开始培养后，通过阶段性的使用大规模的细胞培养器材，或者通过增加细胞培养器材的数目和反复进行稀释操作等方法制备出大量的淋巴细胞。如此，在通常的细胞毒性淋巴细胞的扩大培养中，必需多个培养体系。
根据本发明的方法，即使在从少量的细胞量开始培养时，也可在高扩大培养率下进行培养，而与所用细胞培养器材的大小无关。因此，不需要以往的麻烦的细胞培养器材和细胞培养液的交换、细胞培养液的稀释操作。也就是说，根据本发明的方法，通过应用1个细胞培养器材的培养，换言之，通过1个培养体系，即可进行充分的细胞毒性淋巴细胞的扩大培养。因此，通过本发明的方法可实现不需要细胞培养液稀释步骤的细胞毒性淋巴细胞的制备方法。尤其是，用本发明的方法扩大培养LAK细胞时，将成为LAK细胞的前体细胞和培养基添加到大容量的细胞培养器材中，之后仅添加IL-2，即可进行LAK细胞的扩大培养。从用简便的操作获得大量LAK细胞这一点讲本发明非常有用。此时，从得到更高的扩大培养率这一点出发，作为使用的本发明的有效成分，优选使用纤连蛋白片段。如此，通过本发明的方法，短时间内可获得必要量的细胞毒性淋巴细胞。
例如，进行细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持及扩大培养中至少任一种，本发明的有效成分存在下、在含有培养基的细胞培养器材中从低细胞数开始时，可在满足选自下面(a)和(b)的条件下使用低浓度或低密度的细胞量。
(a)对应于使用的细胞培养器材的培养面积，细胞量的比率优选1细胞/cm2～5×105细胞/cm2、更优选10细胞/cm2～1×105细胞/cm2、特别优选1×102细胞/cm2～5×104细胞/cm2。
(b)培养基中细胞的浓度优选1细胞/mL～5×105细胞/mL、更优选10细胞/mL～1×105细胞/mL、特别优选1×102细胞/mL～5×104细胞/mL。
这里，细胞量是指细胞毒性淋巴细胞和/或前体细胞的个数。
此外，本发明的方法中不需要细胞培养液的稀释步骤。在1个培养体系中进行细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持及扩大培养中的任一种。
作为本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法的特征，也可在高细胞数下进行培养。也就是说，含有培养基的细胞培养器材中进行细胞毒性淋巴细胞的制备的方法，培养过程中包含至少进行1次的用新鲜培养基稀释细胞培养液的步骤、交换培养基的步骤、或交换细胞培养用器材时，即便这些步骤之后，培养条件设定到高浓度(例如，培养液中细胞的浓度为2×105细胞/mL～1×108细胞/mL、优选2×105细胞/mL～5×107细胞/mL、更优选2×105细胞/mL～2×107细胞/mL)或高密度(培养液中细胞的细胞数与细胞培养器材的培养面积的比率为1×105细胞/cm2～1×108细胞/cm2、优选1×105细胞/cm2～5×107细胞/cm2、更优选1×105细胞/cm2～2×107细胞/cm2)时，与以往的方法相比，本发明的方法也可实现良好的扩大培养率。通常的细胞毒性淋巴细胞的扩大培养中，培养开始时多数将细胞数设定在较高浓度或高密度，但，随细胞增殖率的上升，细胞培养液中细胞的浓度和细胞培养器材中的细胞密度设定的较低。本发明的高细胞数下的培养是指，培养过程中，细胞浓度和细胞密度的设定中，细胞培养液中细胞的浓度设定为2×105细胞/mL～1×108细胞/mL、或者培养液中细胞的细胞数与细胞培养器材的培养面积的比率为1×105细胞/cm2～1×108细胞/cm2这样的高浓度或高密度条件下制备细胞毒性淋巴细胞。需要指出的是，这里所述的用新鲜的培养基稀释细胞培养液之后、交换培养基之后、或交换细胞培养用器材之后不包括培养开始时。
作为能在高细胞数下实施培养的优点包括，消减使用的培养基、血清血浆等培养基添加物、细胞培养用器材、劳力及培养空间等。由于过继性免疫疗法中必需大量的淋巴细胞，使用的培养基和细胞培养用器材必需非常多，随之需要大规模的培养空间和许多人员。这样过继性免疫疗法的普及就成为一大课题。因此，由于本发明的方法能解决该课题，所以在设施的筹建、运营上是非常有意义的发明。
如前所述，本发明的方法无论在低浓度或低密度时的细胞培养还是高浓度或高密度时的细胞培养均可适用，所以通过应用本发明的方法，可根据培养状况制备出各种细胞浓度或细胞密度的细胞毒性淋巴细胞。
另外，本发明的方法中可与适当的饲养细胞共培养。当细胞毒性淋巴细胞与饲养细胞共培养时，优选应用适于细胞毒性淋巴细胞、饲养细胞二者维持、生长的培养基。可使用市售的培养基。
本发明的方法中使用的饲养细胞无特殊限定，只要与抗CD3抗体协同刺激细胞毒性淋巴细胞活化T细胞受体即可。本发明中可使用，例如PBMC和EB病毒转化的B细胞(EBV-B细胞)。通常，用放射线照射等手段剥夺饲养细胞的增殖能力后使用。饲养细胞在培养基中的含有量按照众所周知的方法确定，例如1×105细胞/mL～1×107细胞/mL较适宜。
特别优选的实施方案中，使用非病毒感染细胞，例如使用EBV-B细胞以外的细胞作饲养细胞。由此，可排除扩大培养的细胞毒性淋巴细胞中混杂EBV-B细胞的可能性，从而可提高向过继性免疫疗法这样利用细胞毒性淋巴细胞的医疗的安全性。
另外，本发明的方法中，可与适当的抗原提呈细胞共培养。抗原提呈细胞可通过给具有抗原提呈能力的细胞附加抗原肽，将抗原肽提呈到细胞表面而进行制备[例如参照Bendnarek M.A.等，J.Immunol.，第147卷，第12号，第4047～4053页(1991)]。具有抗原提呈能力的细胞具有抗原加工(process)能力的情况是，通过给该细胞负荷抗原，抗原可被摄取到细胞内，经过加工、处理，把片段化的抗原肽提呈到细胞表面。将抗原肽附加给具有抗原提呈能力的细胞时，使用与使用的抗原提呈细胞、要诱导的细胞毒性淋巴细胞的MHC限制性一致的抗原肽或MHC非限制性的抗原肽。
对本发明中使用的抗原无特殊限定，例如细菌、病毒等外源性抗原和肿瘤相关抗原(癌抗原)等内源性抗原。
本发明中优选抗原提呈细胞为非增殖性的。为了使细胞成为非增殖性的，例如可进行X线等放射线照射或丝裂霉素(mitomycin)等药物处理。
根据本发明的制备方法制备LAK细胞时，在所述有效成分的存在下、与IL-2一起培养成为LAK细胞的前体细胞。对成为LAK细胞的前体细胞无特殊限定，例如末梢血单核细胞(PBMC)、NK细胞、脐带血单核细胞、造血干细胞、含这些细胞的血液成分等。
此外，培养LAK细胞的一般条件，除使用上述培养基之外，可按照公知的条件[例如，参照细胞工学，Vol.14，No.2，p223～227(1995)；细胞培养，17(6)，p192～195(1991)；THE LANCET，Vol.356，p802～807，(2000)；Current Protocols in Immunology，supplement 17，UNIT7.7]。对培养条件无特殊限定，可使用常规细胞培养所使用的条件，例如在37℃、5％CO2等条件下进行培养。培养通常进行2～15天。另外，在适当的时间间隔进行稀释细胞培养液、交换培养基或交换细胞培养用器材。
与上面LAK细胞的诱导、维持、扩大培养同样，可通过在纤连蛋白、其片段或其混合物的存在下进行培养，制备CTL、TIL等具有高细胞杀伤活性的细胞群。本发明中，使这些细胞活化的操作中，除纤连蛋白、其片段或其混合物共存、且使用血清和血浆的总浓度在0容量％或以上但小于5容量％的培养基之外无特殊限定，可使用适于上述细胞培养、活化的培养基。至于纤连蛋白、其片段或其混合物的使用量、添加方法等，按照前面的方法适当地选择。
再者，对本发明的细胞毒性淋巴细胞的扩大培养方法中无特殊限定，只要所述有效成分存在于该方法中使用的培养体系中、且培养基中血清和血浆的总浓度在0容量％或以上但小于5容量％即可，除上述之外的以往的细胞毒性淋巴细胞的扩大培养方法中，其培养体系中存在所述有效成分、且培养基中血清和血浆的总浓度在0容量％或以上但小于5容量％的也包含在本发明之内。
对通过本发明的方法制备的细胞毒性淋巴细所施用的疾病无特殊限定，示例包括，例如癌、恶性肿瘤、肝炎和流感等病毒、细菌、霉引发的感染性疾病等。另外，如后面所述导入外源基因时，还期待对各种遗传性疾病有效。此外，利用本发明的方法制备的细胞毒性淋巴细胞还可以用作为骨髓移植和预防放射性照射后的感染症目的的供体淋巴细胞输入。
作为本发明的其它实施方案，还提供细胞毒性淋巴细培养用培养基，其中含有纤连蛋白、其片段或其混合物作有效成分，且培养基中血清和血浆的总浓度在0容量％或以上但小于5容量％。该培养基还包括其它任意成分，例如公知的用于细胞培养的培养基成分、蛋白质、细胞因子类(IL-2)、预期的其它成分。可应用本发明的有效成分、及培养基中总浓度在0容量％或以上但小于5容量％的自身或非自身血清和血浆，按照公知的方法制备该培养基。该培养基中本发明的有效成分的含有量无特殊限定，只要能达到本发明的预期效果即可，例如按照本发明的方法中使用的培养基中的有效成分等的含有量，根据预期的效果，进行适当的确定。作为本发明的培养基的一实施方案，包括含有将纤连蛋白、其片段或其混合物固化的细胞培养用载体的培养基，供封入将纤连蛋白、其片段或其混合物固化的细胞培养用器材的培养基。
应用上述细胞毒性淋巴细胞的制备方法所得淋巴细胞含有培养物中，通常混杂辅助性T细胞等细胞毒性淋巴细胞以外的细胞。但由于本发明所得淋巴细胞含有培养物中保持细胞杀伤活性的淋巴细胞占大多数，通过离心可从培养物中回收培养物中的细胞，用本发明的方法所得细胞毒性淋巴细胞可直接使用。而且，所述有效成分只要固化到细胞培养用器材等上，就不用担心所得细胞毒性淋巴细胞中混入这些成分。
此外，通过公知的方法，还可从培养物中分离出富集细胞毒性淋巴细胞的细胞团(或培养物)，作为用本发明的方法所得细胞毒性淋巴细胞使用。也就是说，本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法包括从用该方法所得的培养物中筛选出富集细胞毒性淋巴细胞的细胞团的步骤。
对富集细胞毒性淋巴细胞的细胞团的筛选方法无特殊限定，例如应用结合了针对细胞表面上表达的细胞表面抗原的抗体，例如结合了抗CD8抗体的细胞培养用器材或载体，仅选择性地从培养物中回收预期的目的细胞的方法，和应用流式细胞仪的方法。所述载体的示例有磁珠和柱等。另外，也可通过从培养物中吸附去除预期的细胞以外的细胞，而获得富集目的细胞的细胞团。例如，使用针对辅助性T细胞表面上表达的细胞表面抗原的抗体，例如抗CD4抗体，可从淋巴细胞培养物中除去辅助性T细胞。该步骤也可应用流式细胞仪进行。
本发明还提供用上述本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法而获得的细胞毒性淋巴细胞。该淋巴细胞具有高细胞杀伤活性，并具有即使进行长期的继续培养和扩大培养其细胞杀伤活性的降低很少的性质。此外，本发明提供含有以该淋巴细胞作有效成分的药物(治疗剂)。含有该淋巴细胞的治疗剂尤其适用于过继性免疫疗法。过继性免疫疗法中，适于患者治疗的具有细胞杀伤活性的淋巴细胞，例如可通过静脉施用而施用给患者。该治疗剂在上述疾病和供体淋巴细胞的输注使用中非常有用。该治疗剂的制备可按照制药领域公知的方法，例如以按本发明的方法制备的淋巴细胞为有效成分，通过如与公知的适于非经口施用的有机或无机载体、赋形剂、稳定剂等混合进行制备。治疗剂中本发明的淋巴细胞的含有量、治疗剂的施用量、与该治疗剂相关的诸条件可遵照公知的过继性免疫疗法而进行适当确定。
本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法中还包括将外源基因导入该淋巴细胞的步骤。也就是说，作为其一个实施方案，本发明提供还包含将外源基因导入细胞毒性淋巴细胞步骤的细胞毒性淋巴细胞的制备方法。所谓“外源”是指相对于基因导入对象的淋巴细胞而言是外来的。
通过实施本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法，尤其是细胞毒性淋巴细胞的扩大培养方法，可增强培养的淋巴细胞的增殖能力。因此，通过本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法与基因导入步骤联合，期待可提高基因的导入效率。
对外源基因的导入手段无特殊限定，可根据公知的基因导入方法选择适当的使用。基因导入步骤可在细胞毒性淋巴细胞制备时、任意时间点实施。例如，从工作效率方面考虑适于与上述淋巴细胞的诱导、维持和/或扩大培养中任一步骤同时，或之后实施。
作为基因导入方法，无论使用病毒载体的方法，还是不使用该载体的方法均可在本发明中使用。关于这些方法的详细描述已经在许多文献中公开。
对病毒载体无特殊限定，通常可使用基因导入方法中使用的公知的病毒载体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、猴病毒载体、痘苗病毒载体或仙台病毒载体等。作为病毒载体，特别适宜的是逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或猴病毒载体。作为病毒载体，在感染的细胞中不能进行自身复制的缺失复制能力的较适宜。
逆转录病毒载体可将插入到载体中的外源基因稳定地整合到载体导入的细胞的染色体DNA中，可用于基因治疗等目的。由于该载体对分裂、增殖细胞的感染效率高，所以适于本发明细胞毒性淋巴细胞的制备步骤，例如扩大培养步骤中进行基因导入。
作为不使用病毒载体的基因导入方法，本发明并未限定，例如使用脂质体、配体-多聚赖氨酸等载体的方法和磷酸钙法、电穿孔法、粒子枪法等。该情况下，可导入重组到质粒DNA和直链状DNA中的外源基因。
对导入到本发明的细胞毒性淋巴细胞中的外源基因无特殊限定，可选择预导入上述细胞的任意基因。这些基因，例如除编码蛋白质(例如酶、细胞因子类、受体类等)的之外，可使用反义核酸、siRNA(smallinterfering RNA)、编码核酶的基因。另外，可同时导入标志基因以进行基因导入细胞的筛选。
上述外源基因，例如可插入到适当的启动子调控下能表达的载体和质粒中使用。另外，实现基因的高效转录，载体内应存在启动子和与转录起始部位协同的其它调节要素，例如增强子序列和终止序列。此外，以通过同源重组将外源基因插入到导入对象淋巴细胞的染色体中为目的的话，可将外源基因配置到例如与染色体中基因预插入部位两侧的碱基序列具有同源性的碱基序列构成的侧翼序列之间。导入的外源基因既可是天然产物，也可是人工制备的，或者是通过连接等公知的手段结合了不同起源的DNA分子的产物。还可是根据目的在天然序列中导入了突变的序列。
根据本发明的方法可赋予淋巴细胞耐药性，例如将编码对癌等患者的治疗中使用的药物抵抗相关的酶的基因导入细胞毒性淋巴细胞中。若应用这样的细胞毒性淋巴细胞，过继性免疫疗法与药物治疗可联合应用，因此，可取得更高的治疗效果。作为耐药基因包括例如多药耐药基因(multidrug resistance gene)。
另一方面，与上面的实施方案相反，将对特定药物赋予敏感性的基固导入细胞毒性淋巴细胞中，可赋予淋巴细胞对该药物的敏感性。这样，通过施用该药物可除去活体移植后的淋巴细胞。作为赋予药物敏感性的基因有，例如胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因。
(3)关于CH-296Na
本发明提供新型的多肽，它具有序列表中序列号25中的氨基酸序列(x)(CH-296Na)、或氨基酸序列(y)，氨基酸序列(y)是氨基酸序列(x)中1个或多个氨基酸发生缺失、插入、附加或置换的氨基酸序列，有氨基酸序列(y)的多肽与具有氨基酸序列(x)的多肽具有同等的功能；提供编码该多肽的核酸。该核酸包括包含以下DNA的核酸：(1)包含序列号26所示碱基序列的DNA(编码CH-296Na的核酸)；(2)包含序列号26的碱基序列中1个或多个碱基发生缺失、插入、附加或置换的碱基序列，且编码的多肽与DNA(1)编码的多肽具有同等功能的DNA；或(3)严紧条件下能与包含序列号26中的碱基序列的DNA杂交，且编码的多肽与DNA(1)编码的多肽具有同等功能的DNA。
本说明书中，将上述新型多肽称为本发明的多肽，将其编码核酸称为本发明的核酸。
以下，对本发明的多肽、编码该多肽的核酸、该多肽的制备方法进行说明。
本发明的多肽，只要具有如前所述的细胞毒性淋巴细胞的制备中所预期的功能[前面(i)～(iv)的功能]中的任一种，在上述氨基酸序列中通过一种或以上的1个～多个氨基酸的置换、缺失、插入或附加生成的氨基酸序列也包含在本发明的多肽中。CH-296Na以外的本发明的多肽，如序列表中序列号25的氨基酸序列中发生1种或以上，优选1～20个氨基酸，更优选1～10个氨基酸，更优选1～5个氨基酸的置换、缺失、插入或附加。氨基酸的置换等在能够维持原来多肽功能的范围内，即使改变了多肽的理化性状也可。详细地该多肽的制备方法如前所述。
编码本发明多肽的序列表中序列号26中的核酸，可以编码血浆来源的人纤连蛋白的cDNA为模板进行PCR，获得编码CH-296Na的DNA片段。此时应用的引物无特殊限定，例如可使用序列表中序列号27、28中描述的Primer CH-296Na1、Primer CH-296Na2。此外，该核酸可通过应用适当的限制性酶位点将FERM BP-2800(保有编码CH-296的质粒的大肠杆菌)的质粒与具有天然血浆来源的纤连蛋白的细胞结合功能域与肝素结合功能域间存在的序列(图1中III型重复序列的II)的DNA片段结合而获得。
另外，作为本发明的核酸还包括序列表中序列号26中核酸的碱基序列中发生1个以上任一种1个～多个碱基的置换、缺失、插入或附加。例如，序列表中序列号26的碱基序列中发生1种或以上，优选1～60个碱基，更优选1～30个碱基，更优选1～15个碱基的置换、缺失、插入或附加。碱基的置换等在能够维持核酸编码的多肽的功能范围内，即使改变了多肽的理化性状也可。详细地碱基的置换等方法参照与氨基酸的置换相关的记载。
在严紧条件下与包含序列表中序列号26中的碱基序列的核酸杂交、编码具有与本发明的多肽具有同等功能，即，至少具有前面所述细胞毒性淋巴细胞的制备中(i)～(iv)任一功能的多肽也包含在本发明的核酸内。上述“严紧条件”无特殊限定，根据能与包含序列号26中的碱基序列的核酸杂交的DNA，优选通过适当确定杂交时洗涤时的温度和盐浓度而进行设定。严紧条件包括，例如Sambrook等人，Molecularcloning，A laboratory manual 3rd edition，2001年，Cold Spring HarborLaboratory Press.等文献中记载的条件。
具体而言，例如，在包含6×SSC(1×SSC：0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt液(Denhardt’s：0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficoll400)、100μg/mL鲑精DNA的溶液中，50℃、优选65℃保温。当应用的DNA的Tm温度已知时，该温度可比其温度低5～12℃。再者，通过洗涤除去非特异杂交的DNA的步骤，这里从提高精度的观点考虑，可追加这样的条件，在更低离子强度，例如2×SSC，更严紧的0.1×SSC等条件和/或较高温，例如根据所用核酸的Tm值不同而不同，25℃以上，更严紧的37℃以上，再严紧的42℃以上，还更严紧的50℃以上等条件下进行洗涤。
在较低严紧度杂交的条件下，与本发明的多聚核苷酸杂交的核酸分子也包含在本发明内。杂交的严紧度及信号检测的变化主要通过甲酰胺浓度(较低百分率的甲酰胺降低严紧度)、盐浓度、或温度的操作进行。例如，较低严紧度的条件包括，在包含6×SSPE(20×SSPE＝3M NaCl，0.2M NaH2PO4，0.02M EDTA，pH7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/mL鲑精封闭的DNA的溶液中，37℃孵育一晚；然后用1×SSPE、0.1％SDS50℃洗涤。为了达到更低的严紧度，进行严紧的杂交后，在较高盐浓度(例如，5×SSC)下进行洗涤。
上述条件可通过添加和/或置换杂交实验中为了抑制背景而使用的封闭试剂而进行改变。代表性的封闭试剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑精DNA及市售的制品另外。另外，对应于这种变化，上述杂交条件中其它要素有时也有必要改变。
另一方面，应用如此所得的核酸，利用遗传工程学手段可获得具有序列表中序列号25中氨基酸序列的多肽。也就是说，将该核酸导入适当的表达载体中，对表达载体无特殊限定，例如可插入到pET载体和pCold载体中，通过公知的方法，可获得该多肽，例如通过用大肠杆菌等进行表达。
实施例
以下，列举实施例，对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限定于这些描述。
制造例1纤连蛋白片段的制备
(1)纤连蛋白片段的制备
人纤连蛋白来源的片段H-271按照美国专利第5198423号说明书中的描述从E.coli大肠杆菌HB101/pHD101(FERM BP-2264)制备。
此外，人纤连蛋白来源的片段H-296、CH-271、CH-296分别用E.coli HB101/pHD102(FERM BP-7420)、E.coli HB101/pCH101(FERM BP-2799)、E.coli HB101/p CH102(FERM BP-2800)，用上面说明书中描述的方法进行培养，从培养物进行制备。
人纤连蛋白来源的片段C-274用E.coli JM109/pTF7221(FERMBP-1915)，按照美国专利第5102988号说明书中的描述的方法进行培养，从培养物进行制备。
人纤连蛋白来源的片段C-CS1用E.coli HB101/pCS25(FERMBP-5723)，按照日本专利第3104178号说明书中的描述的方法进行培养，从培养物进行制备。
人纤连蛋白来源的片段CHV-89、CHV-179分别用E.coliHB101/p CHV89(FERMP-12182)、E.coli HB101/p CHV179(FERMP-12183)，按照日本专利第2729712号说明书中的描述的方法进行培养，从培养物进行制备。
此外，人纤连蛋白来源的片段CHV-90按照日本专利第2729712号说明书中的描述的方法进行制备。即，按照该说明书中记载的操作构建质粒pCHV90，然后培养保有该质粒的转化体，从培养物中制备CHV-90。
人纤连蛋白来源的片段CHV-181按国际公布第97/18318号公报中描述的方法，构建含有编码CHV-181的DNA的质粒(pCHV181)，然后培养导入了该质粒的大肠杆菌(E.coli HB101/p CHV181)，用与上面CHV-179同样的方法，从培养物中制备。
(2)CHV-92的制备
用表达上述多肽CHV-181的质粒pCHV181构建质粒CHV92，该质粒缺失了编码CHV-181的区域中编码III-13区域的区域。缺失操作按照日本专利第2729712号说明书中的描述的质粒pCHV179 III-14编码区域的缺失操作进行。
培养用上面的质粒pCHV92转化的大肠杆菌HB101(E.coliHB101/p CHV92)，按照日本专利第2729712号说明书中的描述的CHV-89多肽的纯化方法，从培养物中进行纯化，获得纯化的CHV-92标准品。
(3)H-275-Cys的制备
按照如下所示的操作构建表达多肽H-275-Cys所用的质粒。从E.coli HB101/p CH102(FERM BP-2800)制备质粒pCH102。以该质粒为模板，应用序列表中序列号21中碱基序列所示引物12S和序列表中序列号22中碱基序列所示引物14A进行PCR，获得编码纤连蛋白肝素结合功能域的大约0.8kb的DNA片段。用NcoI、BamH I(均为TAKARA BIO INC.制造)消化所得DNA片段，然后与用NcoI、BamHI消化的pTV118N(TAKARA BIO INC.制造)进行连接，构建成质粒pRH1。
用BamH I和Hinc II(TAKARA BIO INC.制造)消化质粒载体pINIII-ompA1[Ghrayeb J.等人，EMBOJ.，第3卷，第10号，第2437～2442(1984)]，回收包含脂蛋白终止区域的大约0.9kb的DNA片段。将之与用BamH I和Hinc II消化的上述质粒pRH1混合，进行连接，获得质粒pRH1-T，该质粒中顺次包含lac启动子、编码肝素结合功能域的DNA片段和脂蛋白终止子。
以质粒pRH1-T为模板，应用序列表中序列号23中碱基序列所示引物Cys-A和序列表中序列号24中碱基序列所示引物Cys-S进行PCR，然后用Not I(TAKARA BIO INC.制造)消化回收的扩增DNA片段，再对该片段进行自身连接。用SpeI和ScaI(TAKARA BIO INC.制造)消化所得环状DNA，得到2.3kb的DNA片段，将之与用SpeI和ScaI(TAKARA BIO INC.制造)消化质粒pRH1-T而得的2.5kb的DNA片段混合，进行连接，获得质粒pRH-Cys。该质粒能编码多肽H-275-Cys，该多肽在前面H-271的N末端添加了Met-Ala-Ala-Ser4个氨基酸，还在C末端添加了Cys。
按以下方法制备多肽H-275-Cys。将用上述质粒pRH-Cys转化的大肠杆菌HB101(E.coli HB101/pRH-Cys)在120mL的LB培养基中，37℃培养1晚。将从培养液中回收的菌体悬浮到40mL破碎用缓冲液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、150mM NaCl、1mM DTT、1mM PMSF，pH7.5)中，进行超声波处理，使菌体破碎。将离心所得上清加到用纯化用缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5)平衡过的Hitrap-肝素柱(Pharmacia制造)。用同一缓冲液洗涤柱内的非吸附级分，用保持0～1M NaCl浓度梯度的纯化用缓冲液进行洗脱。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析洗脱液，收集与H-275-Cys分子量相当的级分，获得纯化的H-275-Cys标准品。
实施例1测定应用低血清的LAK细胞培养体系中的扩大培养率
(1)PBMC的分离及保存
从获得承诺的健康人供者实施成分采血，用PBS(-)将血液稀释2倍，覆盖到Ficoll-paque(Pharmacia制造)上，500×g离心20分钟。用吸管回收中间层的末梢血单核细胞(PBMC)，洗涤。将采集的PBMC悬浮到由90％FBS(Bio Whittaker制造)/10％DMSO(SIGMA制造)构成的保存液中，保存到液氮中。诱导LAK时，在37℃水浴中迅速溶解这些保存的PBMC，用含10μg/mLDNase(Calbiochem制造)的RPMI1640培养基(Bio Whittaker制造)进行洗涤后，用苔盼兰染色法算出活细胞数，用于各实验。
(2)抗人CD3抗体及FN片段的固定化
以下的实验中使用的培养器材上固化了抗人CD3抗体及FN片段。即，将含有抗人CD3抗体(Jassen-Kyowa制造)(终浓度5μg/mL)的1mL的PBS(用24孔板时)或2mL(应用12.5cm2培养瓶时)均摊到24孔培养板或12.5cm2细胞培养瓶(Falcon制造)中。此时，在FN片段添加组中，添加制造例1中描述的各纤连蛋白片段(FNfr)，使其终浓度为10μg/mL(用24孔板时)或25μg/mL(应用12.5cm2培养瓶时)。设立不添加FNfr的作对照。
将这些培养器材室温培养5小时后，保存在4℃，直到使用时。使用之前，将含有抗体、FNfr的PBS从培养器材中吸去，用PBS将各孔洗涤2次，用XVIVO20培养基(Bio Whittaker制造)洗涤1次用于各实验。
(3)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到含有1％人AB血清的XVIVO20(以下略作1％XVIVO20)中，使其浓度达1×106细胞/mL，然后向实施例1-(2)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养板或固化了抗人CD3抗体及FNfr的培养板中添加终浓度达1000U/mL的IL-2(盐野义制药社)，1mL/孔。将培养板在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第2天、第3天添加含1000U/mL IL-2的1％XVIVO20，1mL/孔。培养开始后第4天，将用适宜的1％XVIVO20稀释的培养液移到未经任何固化的新培养瓶中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。继续培养，每2～3天，与培养开始后第4天同样添加用适宜的1％XVIVO20稀释的终浓度达300～500U/mL的IL-2。培养开始后第11天或第15天用苔盼兰染色法算出活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。结果如表1所示。
表1
如表1所示，用含低浓度血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，LAK细胞的扩大培养率高。这表明各纤连蛋白片段适于用含低浓度血清的培养基进行LAK细胞培养。
实施例2测定应用低血清培养基的LAK细胞培养体系中的扩大培养率(通过反复刺激进行的扩大培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到0.5％或1％XVIVO20中，使其浓度达1×106细胞/mL，然后铺到实施例1-(2)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养板或固化了抗人CD3抗体及FNfr的培养板中，1mL/孔，添加终浓度达1000U/mL的IL-2(盐野义制药社)。将培养板在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第2天、第3天添加含1000U/mL IL-2的0.5％或1％XVIVO20，1mL/孔。培养开始后第4天，将用适宜的0.5％或1％XVIVO20稀释的培养液移到未经任何固化的新培养瓶中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。到培养开始第9天，将用适宜的0.5％或1％XVIVO20稀释的培养液移到用与实施例1-(2)同样的方法制备的固化了抗人CD3抗体的培养瓶或固化了抗人CD3抗体及FNfr的培养瓶(只是用于固化的抗人CD3抗体的浓度为0.5μg/mL)中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始第12天，再次将用适宜的0.5％或1％XVIVO20稀释的培养液移到未经任何固化的新培养瓶中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第15天用苔盼兰染色法算出活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。结果如表2所示。
表2
如表2所示，用含低浓度血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，与对照组相比，反复使用固化了各纤连蛋白片段及抗CD3抗体的培养器材的组中，LAK细胞的扩大培养率高。该扩大培养率远远高于LAK细胞诱导的初期及中期反复使用只固化了抗CD3抗体的培养器材的组中LAK细胞的扩大培养率。也就是说，该结果表明，在LAK细胞诱导的初期及中期，通过应用各纤连蛋白片段及抗CD3抗体进行刺激，即使应用含低浓度血清的培养基也可以高扩大培养率进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例3应用低血清培养基的LAK细胞培养体系中诱导IL-2受体(IL-2R)的表达
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例2-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。
(2)LAK细胞中IL-2R表达率的测定
用含1％多聚甲醛(Nakalai Tesque，公司制造)的PBS(Nissui制造)固定实施例3-(1)中制备的2×105的LAK细胞，然后用PBS洗涤。将固定细胞悬浮到含1％BSA(SIGMA制造)的100μL的PBS中，添加FITC标记的小鼠IgG1或FITC标记的小鼠抗人IL-2R(CD25)抗体(均为DAKO)后，冰浴30分钟。然后，用PBS洗涤，再次悬浮到含1％多聚甲醛的PBS中。这些细胞供应用FACS Vantage(Becton Dickinson制造)进行流式细胞仪分析，测定IL-2R表达阳性细胞的含有率。结果如表3所示。该表中IL-2R表达阳性细胞的含有率(％)以IL-2R表达率(％)表示。
表3
如表3所示，用含低浓度血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，使用固化了备纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养中的LAK细胞表面上IL-2R表达率增高。也就是说，该结果表明，应用含低浓度血清的培养基诱导LAK细胞时，通过与纤连蛋白片段共存，可边提高IL-2R的表达率边进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例4应用低血清培养基的LAK细胞团中CD8阳性细胞含有率
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例2-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用含1％多聚甲醛的PBS固定实施例4-(1)中制备的2×105的LAK细胞，然后用PBS洗涤。将固定细胞悬浮到含1％BSA的100μLPBS中，添加FITC标记的小鼠IgG1或FITC标记的小鼠抗人CD8抗体(均为DAKO制造)后，冰浴30分钟。然后，用PBS洗涤，再次悬浮到含1％多聚甲醛的PBS中。这些细胞供应用FACS Vantage进行流式细胞仪分析，测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表4所示。
表4
如表4所示，用含低浓度血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期或者初期和中期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养中的LAK中CD8阳性细胞含有率增高。也就是说，该结果表明，应用含低浓度血清的培养基诱导LAK细胞时，通过与纤连蛋白片段共存，可提高LAK中CD8阳性细胞含有率的同时进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例5应用无血清培养基的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定
(1)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到不含血清的XVIVO20(以下略作0％XVIVO20)中，使其浓度达1×106细胞/mL，然后铺到实施例1-(2)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养板或固化了抗人CD3抗体及FNfr的培养板中，1mL/孔，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养板在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第2天、第3天添加含1000U/mL IL-2的0％XVIVO20，1mL/孔。培养开始后第4天，将用适宜的0％XVIVO20稀释的培养液移到未经任何固化的新培养瓶中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。继续培养，每2～3天，与培养开始后第4天同样添加用适宜的0％XVIVO20稀释的终浓度达300～500U/mL的IL-2。培养开始后第11天或第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。结果如表5所示。
表5
如表5所示，用不含血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，LAK细胞的扩大培养率高。这表明各纤连蛋白片段适于用不含血清的培养基进行的LAK细胞培养。
实施例6应用无血清培养基的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(通过反复刺激进行的扩大培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到0％XVIVO20中，使其浓度达1×106细胞/mL，然后铺到实施例1-(2)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养板或固化了抗人CD3抗体及FNfr的培养板中，1mL/孔，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养板在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第2天、第3天添加含1000U/mL IL-2的0％XVIVO20，1mL/孔。培养开始后第4天，将用适宜的0％XVIVO20稀释的培养液移到未经任何固化的新培养瓶中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。到培养开始第9天，将用适宜的0％XVIVO20稀释的培养液移到用与实施例1-(2)同样的方法制备的固化了抗人CD3抗体的培养瓶或固化了抗人CD3抗体及FNfr的培养瓶(只是用于固化的抗人CD3抗体的浓度为0.5μg/mL)中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始第12天，再次将用适宜的0％XVIVO20稀释的培养液移到未经任何固化的新培养瓶中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。结果如表6所示。
表6
如表6所示，用不含血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，与对照组相比，反复使用固化了各纤连蛋白片段及抗CD3抗体的培养器材的组中，LAK细胞的扩大培养率高。该扩大培养率远远高于LAK细胞诱导的初期及中期反复使用只固化了抗CD3抗体的培养器材的组中LAK细胞的扩大培养率。也就是说，该结果表明，在LAK细胞诱导的初期及中期，通过应用各纤连蛋白片段及抗CD3抗体进行刺激，即使应用不含血清的培养基也可以高扩大培养率进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例7应用无血清培养基的LAK细胞培养体系中诱导IL-2受体(IL-2R)的表达
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例6-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。
(2)LAK细胞中IL-2R表达率的测定
用与实施例3-(2)同样的方法测定IL-2R表达阳性细胞的含有率。结果如表7所示。该表中IL-2R表达阳性细胞的含有率(％)以IL-2R表达率(％)表示。
表7
如表7所示，用不含血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养中的LAK细胞表面上IL-2R表达率增高。也就是说，该结果表明，应用不含血清的培养基诱导LAK细胞时，通过与纤连蛋白片段共存，可边提高IL-2R表达率边进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例8应用无血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例5-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为不含血清的AIM V培养基(Invitrogen，以下略作0％AIM V)。结果如表8所示。
表8
如表8所示，用不含血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，LAK细胞的扩大培养率高。另外，即使改变无血清培养用的基本培养基也能发挥该效果。这表明各纤连蛋白片段适于用不含血清的培养基进行的LAK细胞培养。
实施例9应用无血清培养基的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(低细胞数开始的LAK细胞诱导、培养/不进行稀释的培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到XVIVO20(不含血清)中，使其浓度达1×105细胞/mL，然后铺到用与实施例1-(2)同样的方法制备的固化了抗人CD3抗体或固化了抗人CD3抗体及FNfr的6孔培养板中，1mL/孔，加入4mL XVIVO20(不含血清)(1×104细胞/cm2)，再添加终浓度达500U/mL的IL-2。将培养板在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第2天、第3天、第4天添加终浓度达500U/mL的IL-2。继续培养，培养开始第7天以后每2～3天，添加终浓度达500U/mL的IL-2。其间完全不进行培养液的稀释。
培养开始后第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。结果如表9所示。
表9
如表9所示，从低细胞数开始LAK细胞诱导时，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，诱导过程中不必要进行细胞的稀释，培养开始后第15天获得高的扩大培养率。与此相对，即使到达培养开始后第15天对照组中几乎无增殖。也就是说，该结果表明，应用无血清培养基从低细胞数开始LAK细胞诱导时，通过与纤连蛋白片段共存，完全没必要进行稀释，可以高扩大培养率进行LAK的细胞诱导、培养。
实施例10应用无血清培养基的LAK细胞培养体系中IL-2R表达的诱导(低细胞数开始的LAK细胞诱导、培养/不进行稀释的培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例9-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。
(2)LAK细胞中IL-2R表达率的测定
用与实施例3-(2)同样的方法测定IL-2R表达阳性细胞的含有率。结果如表10所示。该表中IL-2R表达阳性细胞的含有率(％)以IL-2R表达率(％)表示。
表10
如表10所示，从低细胞数开始LAK细胞诱导时，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，诱导过程中不必要进行细胞的稀释，培养中的LAK细胞表面上IL-2R表达率增高。也就是说，该结果表明，应用无血清培养基从低细胞数开始LAK细胞诱导时，通过与纤连蛋白片段共存，完全没必要进行稀释，即可边提高IL-2R表达率边进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例11应用无血清培养基(AIM V)培养的LAK细胞团中CD8阳性细胞含有率
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例8-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表11所示。
表11
如表11所示，用不含血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养中的LAK中CD8阳性细胞含有率增高。也就是说，该结果表明，应用不含血清的培养基诱导LAK细胞时，通过与纤连蛋白片段共存，可在提高LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的同时进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例12应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例1-(3)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为含1％或5％人AB血清的AIM V培养基(以下略作1％AIM V或5％AIM V)。结果如表12所示。
表12
如表12所示，用含低浓度血清的培养基(AIM V)进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，LAK细胞的扩大培养率高。这表明各纤连蛋白片段适于用含低浓度血清的AIM V培养基进行的LAK细胞培养。
实施例13应用各种低血清培养基的LAK细胞培养体系中扩大培养率的效果
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例1-(3)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为含1％人AB血清的XVIVO20培养基/XVIVO10培养基或AIM V培养基(以下分别略作1％XVIVO20、1％XVIVO 10或1％AIM V)。测定各培养基中的扩大培养率。结果如表13所示。
表13
如表13所示，用含低浓度血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，LAK细胞的扩大培养率高。此外，即使变化基本培养基也能发挥该效果。该结果表明各纤连蛋白片段适于用任一种含低浓度血清的培养基进行的LAK细胞培养。
实施例14应用低血清培养基的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例1-(3)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为含0.2％人AB血清的培养基。结果如表14所示。
表14
如表14所示，用含低浓度(0.2％)血清的培养基(XVIVO20)进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，LAK细胞的扩大培养率高。该结果表明备纤连蛋白片段适用于用含低浓度血清的培养基进行的LAK细胞培养。
实施例15应用低血清培养基的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(通过反复刺激进行扩大培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例2-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为含0.2％人AB血清的XVIVO20或含1％人AB血清的XVIVO10培养基。结果如表15所示。
表15
如表15所示，用含低浓度(0.2％)血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，与对照组相比，反复使用固化了各纤连蛋白片段及抗CD3抗体的培养器材的组中，LAK细胞的扩大培养率高。该扩大培养率远远高于LAK细胞诱导的初期及中期反复使用只固化了抗CD3抗体的培养器材的组中LAK细胞的扩大培养率。即使改变了基本培养基也可以显示出该效果。该结果表明，在LAK细胞诱导的初期及中期，通过应用各纤连蛋白片段及抗CD3抗体进行刺激，即使应用含低浓度血清的培养基也可以高扩大培养率进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例16应用低血清培养基的LAK细胞培养体系中IL-2受体(IL-2R)表达的诱导
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例2-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为含0.2％人AB血清的XVIVO20或含1％人AB血清的XVIVO10培养基。
(2)LAK细胞中IL-2R表达率的测定
用与实施例3-(2)同样的方法测定IL-2R表达阳性细胞的含有率。结果如表16所示。该表中IL-2R表达阳性细胞的含有率(％)以IL-2R表达率(％)表示。
表16
如表16所示，用含低浓度血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养中的LAK细胞表面上IL-2R表达率增高．即使改变培养基也能发挥该效果。也就是说，该结果表明，应用低血清培养基进行LAK细胞诱导时，通过与纤连蛋白片段共存，即可边提高IL-2R表达率边进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例17应用低血清培养基培养的LAK细胞团中CD8阳性细胞含有率
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例1-(3)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为含0.2％或1％人AB血清的XVIVO20或含1％人AB血清的XVIVO10培养基．
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表17所示。
表17
如表17所示，用含低血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养中的LAK中CD8阳性细胞含有率增高。即使改变基本培养基也能发挥该效果。也就是说，该结果表明，应用含低浓度血清的培养基诱导LAK细胞时，通过与纤连蛋白片段共存，可在提高LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的同时进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例18应用低血清培养基培养的LAK细胞团中CD8阳性细胞含有率(通过反复刺激进行扩大培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例2-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为含0.2％人AB血清的XVIVO20或含1％人AB血清的XVIVO10培养基。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表18所示。
表18
如表18所示，用含低血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期或中期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养中的LAK中CD8阳性细胞含有率增高。即使改变基本培养基也能发挥该效果。也就是说，该结果表明，应用含低浓度血清的培养基诱导LAK细胞时，通过与纤连蛋白片段共存，可在提高LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的同时进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例19应用无血清培养基的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例5-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为不含血清的XVIVO10培养基或AIM V。结果如表19所示。
表19
如表19所示，用不含血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，LAK细胞的扩大培养率高。即使改变基本培养基也能发挥该效果。该结果表明各纤连蛋白片段适用于用不含血清的培养基进行的LAK细胞培养。
实施例20应用无血清培养基的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(通过反复刺激进行扩大培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例6-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为不含血清的XVIVO10培养基。结果如表20所示。
表20
如表20所示，用不含血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，与对照组相比，反复使用固化了各纤连蛋白片段及抗CD3抗体的培养器材的组中，LAK细胞的扩大培养率高。该扩大培养率远远高于LAK细胞诱导的初期及中期反复使用只固化了抗CD3抗体的培养器材的组中的扩大培养率。此外，即使改变基本培养基也能发挥该效果。也就是说，该结果表明，在LAK细胞诱导的初期及中期，通过应用各纤连蛋白片段及抗CD3抗体进行刺激，即使应用不含血清的培养基也可以高扩大培养率进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例21应用无血清培养基的LAK细胞培养体系中IL-2R表达的诱导
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例6-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为不含血清的XVIVO10培养基。
(2)LAK细胞中IL-2R表达率的测定
用与实施例3-(2)同样的方法测定IL-2R表达阳性细胞的含有率。结果如表21所示。该表中IL-2R表达阳性细胞的含有率(％)以IL-2R表达率(％)表示。
表21
如表21所示，用不含血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养中的LAK细胞表面上IL-2R表达率增高。也就是说，该结果表明，应用不含血清的培养基进行LAK细胞诱导时，通过与纤连蛋白片段共存，可边提高IL-2R表达率边进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例22应用无血清培养基培养的LAK细胞团中CD8阳性细胞含有率
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例5-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为不含血清的XVIVO20或XVIVO10或AIMV培养基。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表22所示。
表22
如表22所示，用不含血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养中的LAK中CD8阳性细胞含有率增高。另外，即使改变基本培养基也能发挥该效果。也就是说，该结果表明，应用不含血清的培养基诱导LAK细胞时，通过与纤连蛋白片段共存，可在提高LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的同时进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例23应用无血清培养基培养的LAK细胞团中CD8阳性细胞含有率(通过反复刺激进行扩大培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例6-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为不含血清的XVIVO20或XVIVO10培养基。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表23所示。
表23
如表23所示，用不含血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期或者初期中期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养中的LAK中CD8阳性细胞含有率增高。另外，即使改变基本培养基也能发挥该效果。也就是说，该结果表明，应用含低浓度血清的培养基诱导LAK细胞时，通过与纤连蛋白片段共存，可在提高LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的同时进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例24应用低血清培养基的LAK细胞培养体系中IL-2R表达的诱导(低细胞数开始的LAK细胞诱导、培养/不进行稀释的培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到含1％人AB血清的XVIVO20(以下略作1％XVIVO20)中，使其浓度达1×105细胞/mL或5×104细胞/mL，然后铺到用与实施例1-(2)同样的方法制备的固化了抗人CD3抗体的培养板或固化了抗人CD3抗体及FNfr的6孔培养板中，1mL/孔，加入4mL 1％XVIVO20(1×104细胞/cm2/或5×103细胞/cm2)，再添加终浓度达500U/mL的IL-2(盐野义制药社制)。将培养板在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第2天、第3天、第4天添加终浓度达500U/mL的IL-2。继续培养，培养开始第7天以后每2～3天，添加终浓度达500U/mL的IL-2。其间完全不进行培养液的稀释。培养开始后第16天回收细胞。
(2)LAK细胞中IL-2R表达率的测定
用与实施例3-(2)同样的方法测定IL-2R表达阳性细胞的含有率。该表中IL-2R表达阳性细胞的含有率(％)以IL-2R表达率(％)表示。结果如表24所示。
表24
如表24所示，从低细胞数开始LAK细胞诱导时，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，诱导过程中不必要进行细胞的稀释，培养中的LAK细胞表面上IL-2R表达率增高。也就是说，该结果表明，应用低血清培养基从低细胞数开始LAK细胞诱导时，通过与纤连蛋白片段共存，完全没必要进行稀释，即可边提高IL-2R表达率边进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例25应用无血清/低血清培养基的LAK细胞培养体系中细胞杀伤活性的测定
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例1-(3)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为含0％～5％人AB血清的XVIVO20或含0％～5％人AB血清的AIM V培养基或含5％人AB血清的XVIVO10。
(2)培养的LAK细胞的细胞杀伤活性的测定
通过应用钙荧光素-AM的细胞杀伤活性测定法[Lichtenfels R.等人，J.Immnol.Methods，第172卷，第2号，第227～239页(1994)]对实施例25-(1)中制备的培养后第15天的LAK细胞杀伤活性。将细胞株K562、Daudi悬浮到含5％FBS(Bio Whittaker制造)的RPMI1640培养基中，使其浓度达1×106细胞/mL，添加终浓度达25μM的钙荧光素-AM(Dotite制造)，37℃培养1小时。用不含钙荧光素-AM的培养基洗涤细胞后，作为钙荧光素标记的靶细胞。
以实施例25-(1)中制备的LAK细胞作效应细胞，用含5％人血清的RPMI1640(以下略作5HRPMI)将其稀释成1×106细胞/mL～3×106细胞/mL，加到96孔细胞培养板中，100μl/孔，向其中添加1×105细胞/mL的制备的钙荧光素标记的靶细胞，100μl/孔。将上述加入细胞悬浮液的培养板400×g离心1分钟后，37℃湿式CO2培养箱内培养4小时。4小时后，从各孔吸取培养上清100μl，应用荧光酶标仪(platereader)(485nm/538nm)测定培养上清中释放出的钙荧光素量(荧光强度)。按以下公式1计算LAK细胞的细胞杀伤活性。
公式1：
细胞杀伤活性(％)＝[(各孔的测定值-最小释放量)/(最大释放量-最小释放量)]×100
上式中最小释放量指仅含靶细胞的孔中钙荧光素释放量，即靶细胞的钙荧光素自然释放量。另外，最大释放量指向靶细胞中加入终浓度达0.05％的细胞表面活性剂Triton X-100(Nakalai Tesque制造)使细胞完全破碎时的钙荧光素释放量。结果如表25所示。表中，[E/T]表示效应细胞与靶细胞细胞数的比值(效应细胞/靶细胞)。
表25
如表25所示，用不含血清的培养基或含低浓度血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，LAK细胞的细胞杀伤活性高。另外，即使改变基本培养基也能发挥该效果。也就是说，该结果表明，备纤连蛋白适用于应用不含血清的培养基或含低浓度血清的培养基的LAK细胞培养。
实施例26应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(通过反复刺激进行扩大培养)-1
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例2-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。只是将其使用的培养基变更为含1％人AB血清的AIM V培养基。结果如表26所示。
表26
如表26所示，用含低浓度血清(1％)的AIM V培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，与对照组相比，反复使用固化了各纤连蛋白片段及抗CD3抗体的培养器材的组中，LAK细胞的扩大培养率高。该扩大培养率远远高于LAK细胞诱导的初期及中期反复使用只固化了抗CD3抗体的培养器材的组中的扩大培养率。也就是说，该结果表明，在LAK细胞诱导的初期及中期，通过应用各纤连蛋白片段及抗CD3抗体进行刺激，即使应用含低浓度血清的培养基也可以高扩大培养率进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例27应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(通过反复刺激进行扩大培养)-2
(1)抗人CD3抗体及FN片段的固定化
以下的实验中使用的培养器材(容器)上固化了抗人CD3抗体及FN片段。即，将含有抗人CD3抗体(终浓度5μg/mL)的PBS1.9mL(用12孔板时)或2mL(应用12.5cm2培养瓶时)均摊到12孔培养板或12.5cm2细胞培养瓶(Falcon制造)中。此时，在FN片段添加组中，添加制造例1中描述的各纤连蛋白片段(FNfr)，使其终浓度为10μg/mL(用12孔板时)或25μg/mL(应用12.5cm2培养瓶时)。设立不添加FNfr的作对照。
将这些培养器材室温培养5小时后，保存在4℃，直到使用时。使用之前，将含有抗体、FNfr的PBS从培养器材中吸去，用PBS将各孔洗涤2次，用AIM V培养基洗涤1次用于各实验。
(2)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到1％AIM V中，使其浓度达5×105细胞/mL，然后铺到实施例27-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养板或固化了抗人CD3抗体及FNfr的培养板中，1mL/孔，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养板在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第2天、第3天添加含1000U/mL IL-2的1％AIM V，1mL/孔。培养开始后第4天，将培养液移到未经任何固化的25cm2培养瓶中(Falcon制造)，再添加1％AIM V7mL，添加终浓度达500U/mL的IL-2。到培养开始第7天，将用1％AIM将细胞浓度调整为2×105细胞/mL的培养液的一部分移到未经任何固化的新培养瓶中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。到培养开始第9天，将用1％AIM将细胞浓度调整为2×105细胞/mL的培养液的一部分移到用与实施例27-(1)同样的方法制备的固化了抗人CD3抗体的培养瓶或固化了抗人CD3抗体及FNfr的培养瓶(只是用于固化的抗人CD3抗体的浓度为0.5μg/mL)中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始第12天，再次将用适宜的1％AIM V将细胞浓度调整为2×105细胞/mL的培养液的一部分移到未经任何固化的新培养瓶中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。相同条件下进行n＝3的扩大培养，其均值±标准差的各结果示于表27中。
表27
平均值±标准偏差
如表27所示，用含低浓度血清(1％)的AIM V培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，与对照组相比，反复使用固化了各纤连蛋白片段及抗CD3抗体的培养器材的组中，LAK细胞的扩大培养率高。该扩大培养率远远高于LAK细胞诱导的初期及中期反复使用只固化了抗CD3抗体的培养器材的组中LAK细胞的扩大培养率。也就是说，该结果表明，在LAK细胞诱导的初期及中期，通过应用各纤连蛋白片段及抗CD3抗体进行刺激，即使应用含低浓度血清的培养基也可以高扩大培养率进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例28应用无血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中CD8阳性细胞含有率(通过反复刺激进行扩大培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例2-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。将此时使用的培养基变成不含人AB血清的AIM V。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表28所示。
表28
如表28所示，用不含血清的AIM V培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养后LAK细胞团中CD8阳性细胞含有率增高。即应用含低血清浓度的培养基诱导LAK细胞时，通过与纤连蛋白片段共存，可在提高LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的同时进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例29应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中CD8阳性细胞含有率(通过反复刺激进行扩大培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例2-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。将此时使用的培养基变成含1％人AB血清的AIM V。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表29所示。
表29
如表29所示，用含低浓度血清的AIM V培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养后LAK细胞团中CD8阳性细胞含有率增高。即该结果表明，应用含低浓度血清的培养基诱导LAK细胞时，通过与纤连蛋白片段共存，可在提高LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的同时进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例30应用无血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中IL-2受体(IL-2R)表达的诱导
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例2-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。将此时使用的培养基变成不含人AB血清的AIM V。
(2)LAK细胞中IL-2R表达率的测定
用与实施例3-(2)同样的方法测定IL-2R表达阳性细胞的含有率。结果如表30所示。该表中IL-2R表达阳性细胞的含有率(％)以IL-2R表达率(％)表示。
表30
如表30所示，用不含血清的AIM V培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养后LAK细胞表面上IL-2R表达率增高。即该结果表明，应用不含血清的培养基进行LAK细胞诱导时，通过与纤连蛋白片段共存，可边提高IL-2R表达率边进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例31应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中IL-2受体(IL-2R)表达的诱导(通过反复刺激进行扩大培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例2-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。将此时使用的培养基变成含1％人AB血清的AIM V。
(2)LAK细胞中IL-2R表达率的测定
用与实施例3-(2)同样的方法测定IL-2R表达阳性细胞的含有率。结果如表31所示。该表中IL-2R表达阳性细胞的含有率(％)以IL-2R表达率(％)表示。
表31
如表31所示，用含低浓度血清的AIM V培养基进行LAK细胞诱导的初期及中期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养中LAK细胞表面上IL-2R表达率增高。也就是说，该结果表明，应用含低浓度血清的培养基进行LAK细胞诱导时，通过与纤连蛋白片段共存，可边提高IL-2R表达率边进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例32应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞团中CD8阳性细胞含有率
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例1-(3)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。将此时使用的培养基变成含1％人AB血清的AIM V。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表32所示。
表32
如表32所示，用含低浓度血清的AIM V培养基进行LAK细胞诱导的初期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，培养中LAK细胞中CD8阳性细胞含有率增高。也就是说，该结果表明，应用含低浓度血清的培养基诱导LAK细胞时，通过与纤连蛋白片段共存，可在提高LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的同时进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例33应用无血清/低血清培养基的LAK细胞培养体系中细胞杀伤活性的测定
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例1-(3)或实施例2-(1)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。将其使用的培养基变更为含0％或1％人AB血清的XVIVO10、XVIVO20或、AIM V培养基。
(2)培养的LAK细胞的细胞杀伤活性的测定
用与实施例25-(2)同样的方法测定培养后第15天的LAK的细胞杀伤活性。结果如表33所示。
表33
如表33所示，用不含血清的培养基或含低浓度血清的培养基进行LAK细胞诱导的初期或者初期及中期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，LAK细胞的细胞杀伤活性高。另外，即使改变基本培养基也能发挥该效果。该结果表明，各纤连蛋白适用于应用不含血清的培养基或含低浓度血清的培养基的LAK细胞培养。
实施例34应用低血清培养基(XVIVO)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(应用细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行培养)
(1)抗人CD3抗体及FN片段的固定化
以下的实验中使用的培养器材(细胞培养用CO2气体透过性培养袋)上固化了抗人CD3抗体及FN片段。即，将含有抗人CD3抗体(终浓度5μg/mL)的PBS 20mL均摊到85cm2细胞培养用CO2气体透过性培养袋(Baxter制造)中。此时，在FN片段添加组中，添加制造例1中描述的各纤连蛋白片段(FNfr)，使其终浓度为42.5μg/mL。设立不添加FNfr的作对照。
将这些培养器材室温培养5小时后，保存在4℃，直到使用时。使用之前，将含有抗体、FNfr的PBS从培养器材中吸去，用PBS将各袋洗涤2次，用含1％人AB血清的XVIVO培养基(以下略作1％XVIVO)洗涤1次用于各实验。
(2)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到1％XVIVO中，使其浓度达1×106细胞/mL，然后将细胞悬液加到实施例34-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的细胞培养用CO2气体透过性培养袋，或固化了抗人CD3抗体及FNfr的细胞培养用CO2气体透过性培养袋中，10mL/袋，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将细胞培养用CO2气体透过性培养袋在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第2天添加含1000U/mL IL-2的1％XVIVO，20mL/袋。培养开始第4天，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第6天添加1％XVIVO，30mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第8天，将培养液的一部分适当稀释后，移到未经任何固化的85cm2细胞培养用CO2气体透过性培养袋中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始第11、13天，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。结果如表34所示。
表34
如表34所示，用含低浓度(1％)血清的培养基(XVIVO10)与细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的细胞培养用CO2气体透过性培养袋的组中，LAK细胞的扩大培养率高。该结果表明，各纤连蛋白片段适用于应用含低浓度血清的培养基与细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行的LAK细胞培养。
实施例35应用低血清培养基(XVIVO10)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(培养瓶与细胞培养用CO2气体透过性培养袋联合应用进行培养)
(1)抗人CD3抗体及FN片段的固定化
以下的实验中使用的培养器材(25cm2培养瓶)上固化了抗人CD3抗体及FN片段。即，将含有抗人CD3抗体(终浓度5μg/mL)的PBS6mL均摊到25cm2培养瓶(Corning制造)中。此时，在FN片段添加组中，添加制造例1中描述的各纤连蛋白片段(FNfr)，使其终浓度为42.5μg/mL。设立不添加FNfr的作对照。
将这些培养器材室温培养5小时后，保存在4℃，直到使用时。使用之前，将含有抗体、FNfr的PBS从培养器材中吸去，用PBS将培养瓶洗涤2次，用含1％人AB血清的XVIVO10培养基(以下略作1％XVIVO10)洗涤1次用于各实验。
(2)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到1％XVIVO10中，使其浓度达1×106细胞/mL，然后将细胞悬液加到实施例35-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养瓶，或固化了抗人CD3抗体及FNfr的培养瓶中，3mL/瓶，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养瓶在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第1天或第2天添加含1000U/mL IL-2的1％XVIVO10，7mL/瓶。以下根据抗CD3抗体±CH-296刺激时间产生2种培养方法：(i)培养开始后第4天，将培养液移到未经任何固化的85cm2细胞培养用CO2气体透过性培养袋中，添加1％XVIVO10，20mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2。再在培养开始后第6天添加1％XVIVO10，30mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2(抗CD3抗体±CH-296刺激时间为4天)。(ii)培养开始第4天或第5天，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第6天将培养液移到未经任何固化的85cm2细胞培养用CO2气体透过性培养袋中，然后添加1％XVIVO10，50mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2(抗CD3抗体±CH-296刺激时间为6天)。两条件下均在培养开始后第8天，将培养液的一部分适当稀释后，移到未经任何固化的85cm2细胞培养用CO2气体透过性培养袋中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始第11、13天，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。结果如表35所示。
表35
如表35所示，用含低浓度(1％)血清的培养基(XVIVO10)联合应用培养瓶及细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养瓶的组中，LAK细胞的扩大培养率高。该结果表明，各纤连蛋白片段适用于应用含低浓度血清的培养基、联合应用培养瓶及细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行的LAK细胞培养。
实施例36应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(培养瓶与细胞培养用CO2气体透过性培养袋联合应用进行培养)
(1)抗人CD3抗体及FN片段的固定化
与实施例35-(1)同样，将抗人CD3抗体及FN片段固化到以下实验中使用的培养器材(25cm2培养瓶)上。使用之前，将含有抗体、FNfr的PBS从培养器材中吸去，用PBS将培养瓶洗涤2次，用含1％人AB血清的AIM V培养基(以下略作1％AIM V)洗涤1次用于各实验。
(2)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到1％AIM V中，使其浓度达1×106细胞/mL，然后将细胞悬液加到实施例36-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养瓶，或固化了抗人CD3抗体及FNfr的培养瓶中，3mL/瓶，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养瓶在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第1天添加含1000U/mLIL-2的1％AIM V，7mL/瓶。培养开始后第4天，将培养液移到未经任何固化的85cm2细胞培养用CO2气体透过性培养袋中，添加1％AIMV，20mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始第6天添加1％AIM V，30mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第8天，将培养液的一部分适当稀释后，移到未经任何固化的85cm2细胞培养用CO2气体透过性培养袋中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始第11、13天，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。结果如表36所示。
表36
如表36所示，用含低浓度(1％)血清的培养基(AIM V)联合应用培养瓶及细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养瓶的组中，LAK细胞的扩大培养率高。该结果表明，各纤连蛋白片段适用于应用含低浓度血清的培养基、联合应用培养瓶及细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行的LAK细胞培养。
实施例37应用低血清培养基(XVIVO10)的LAK细胞团中CD8阳性细胞的含有率(应用细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例34-(2)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表37所示。
表37
如表37所示，应用含低浓度(1％)血清的培养基(XVIVO10)与细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行LAK细胞诱导的初期，使用固化了各纤连蛋白片段的细胞培养用CO2气体透过性培养袋的组中，培养后LAK细胞团中CD8阳性细胞含有率增高。该结果表明，各纤连蛋白片段适用于应用含低浓度血清的培养基及细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行的LAK细胞培养。
实施例38应用低血清培养基(XVIVO10)的LAK细胞团中CD8阳性细胞的含有率(联合应用培养瓶及细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例35-(2)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表38所示。
表38
如表38所示，应用含低浓度(1％)血清的培养基(XVIVO10)联合应用培养瓶及细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养瓶的组中，培养后LAK细胞中CD8阳性细胞含有率增高。该结果表明，各纤连蛋白片段适用于应用含低浓度血清的培养基、联合应用培养瓶及细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行的LAK细胞培养。
实施例39应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(培养开始时、传代时的浓度)
确认LAK细胞培养体系中培养开始时、传代时的细胞浓度对扩大培养率的影响。
设定培养开始时的细胞浓度为0.5×106细胞/mL及1×106细胞/mL。培养第4天的传代细胞的浓度设定为0.025×106细胞/mL及0.05×106细胞/mL。培养第7、9和11天的传代细胞的浓度设定为0.2×106细胞/mL及0.5×106细胞/mL。下表39-1中显示了上述模式。
表39-1
*细胞浓度(×106cells/mL)
(1)抗人CD3抗体及FN片段的固定化
以下的实验中使用的培养器材上固化了抗人CD3抗体及FN片段。即，将含有抗人CD3抗体(终浓度5μg/mL)的PBS 1mL均摊到24孔培养板中。此时，在FN片段添加组中，添加制造例1中描述的各纤连蛋白片段(CH-296)，使其终浓度为25μg/mL。设立不添加CH-296的作对照。
将这些培养器材室温培养5小时后，保存在4℃，直到使用时。使用之前，将含有抗人CD3抗体、CH-296的PBS从培养器材中吸去，用PBS将各孔洗涤2次，RPMI培养基洗涤1次用于各实验。
(2)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到含1％人AB血清的AIMV中，按细胞浓度模式1、2、3进行培养的部分细胞浓度调为0.5×106细胞/mL，按细胞浓度模式4、5、6进行培养的部分细胞浓度调为1×106细胞/mL。然后将细胞悬液加到(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养板，或固化了抗人CD3抗体及CH-296的培养板中，1mL/孔，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养瓶在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第2、3天添加含1000U/mL IL-2的1％AIM V，1mL/孔。
培养开始后第4天，用含1％人AB血清的AIM V稀释细胞(液量最大6mL)，按细胞浓度模式1、4进行培养的部分稀释为0.025×106细胞/mL，按细胞浓度模式2、3、5、6进行培养的部分稀释为0.05×106细胞/mL。将稀释的培养液分别移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中。各部分中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始后第7、9、11天，用含1％人AB血清的AIM V稀释细胞(液量最大6mL)，按细胞浓度模式1、2、4、5进行培养的部分稀释为0.2×106细胞/mL，按细胞浓度模式3、6进行培养的部分稀释为0.5×106细胞/mL。将稀释的培养液分别移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中。各部分中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。各实验进行3次。其平均值显示于表39-2。
表39-2
如表39-2所示，培养开始时及传代时各种细胞浓度下的LAK细胞培养中，无论在哪一种细胞浓度组中，与对照组(仅用抗CD3抗体刺激)相比，应用CH-296及抗CD3抗体刺激的组中均可获得高扩大培养率。也就是说，对应于诸状况下可变化的培养开始时及传代时的细胞浓度，通过CH-296的刺激，很明显可以高扩大培养率诱导、培养LAK细胞。
实施例40应用低血清培养基(AIM V)培养的LAK细胞团中CD8阳性细胞的含有率(培养开始时、传代时的浓度)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例39同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表40所示。
表40
如表40所示，培养开始时及传代时各种细胞浓度下的LAK细胞培养中，无论在哪一种细胞浓度组中，与对照组(仅用抗CD3抗体刺激)相比，应用CH-296及抗CD3抗体刺激的组中LAK细胞中CD8阳性细胞含有率增高。也就是说，对应于诸状况下可变化的培养开始时及传代时的细胞浓度，通过CH-296的刺激，很明显可在提高LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的同时进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例41应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(高浓度、高密度培养)
LAK细胞培养体系中，若能最低限度的减少最终培养液量和最终培养面积，可降低培养基、材料和劳力。确认高浓度、高密度下培养细胞时对扩大培养率的影响。
设定传代时不降低细胞浓度和细胞密度的组(普通培养组)、培养第7、10天传代时细胞浓度分别为普通培养组1.8倍和6倍的组(高浓度培养组，但细胞密度与浓度的比例相同，为1.8倍和6倍)、培养第7、10天传代时细胞浓度分别为普通培养组的1.3倍和2.5倍且细胞密度分别为3.9倍和7.5倍的组(高浓度、高密度区)。下面表41-1中显示了各组中传代时细胞浓度和细胞密度。
表41-1
(1)抗人CD3抗体及FN片段的固定化
以下的实验中使用的培养器材上固化了抗人CD3抗体及FN片段。即，将含有抗人CD3抗体(终浓度5μg/mL)的PBS 1.9mL均摊到12孔培养板中。此时，在FN片段添加组中，添加制造例1中描述的各纤连蛋白片段(CH-296)，使其终浓度为25μg/mL。设立不添加CH-296的作对照。
将这些培养器材室温培养5小时后，保存在4℃，直到使用时。使用之前，将含有抗人CD3抗体、CH-296的PBS从培养器材中吸去，用PBS将各孔洗涤2次，RPMI培养基洗涤1次用于各实验。
(2)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到含1％人AB血清的AIMV中，各培养组的细胞浓度均为0.33×106细胞/mL，然后将细胞悬液加到实施例41-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养板，或固化了抗人CD3抗体及CH-296的培养板中，3mL/孔，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养瓶在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。
培养开始后第4天，用含1％人AB血清的AIM V稀释细胞(液量最大6mL)，各普通培养组的细胞浓度达0.05×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始后第7天，用含1％人AB血清的AIM V稀释细胞(液量最大6mL)，普通培养组的细胞浓度达0.1×106细胞/mL，高浓度培养组的细胞浓度达0.18×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中。另外，用含1％人AB血清的AIM V(液量最大9mL)将高浓度高密度区的细胞稀释为0.13×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始后第10天，用含1％人AB血清的AIM V稀释细胞(液量最大6mL)，普通培养组的细胞浓度达0.15×106细胞/mL，高浓度培养组的细胞浓度达0.893×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中。另外，用含1％人AB血清的AIM V(液量最大9mL)将高浓度高密度区的细胞稀释为0.38×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始后第11天向各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。各实验进行2次。其平均值显示于表41-2。
表41-2
如表41-2所示，普通培养组或高浓度培养组或高浓度高密度培养组中的任一组中，与对照组(仅用抗CD3抗体刺激)相比，应用CH-296及抗CD3抗体刺激的组中均可获得高扩大培养率。即，能降低培养基、材料和劳力的高浓度高密度培养中，通过CH-296的刺激，可明显观察到对扩大培养的效果。
实施例42应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞团中CD8阳性细胞的含有率(高浓度、高密度培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例41同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表42所示。
表42
如表42所示，普通培养组或高浓度培养组或高浓度高密度培养组中的任一组中，与对照组(仅用抗CD3抗体刺激)相比，应用CH-296及抗CD3抗体刺激的组中LAK细胞中CD8阳性细胞含有率增高。也就是说，该结果表明，能降低培养基、材料和劳力的高浓度高密度培养中，通过CH-296的刺激，可在明显提高LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的同时，诱导、培养LAK细胞。
实施例43应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(血清浓度0％、0.15％、5％→0.1％)
LAK细胞培养中，1次采血30mL的话，可获得大约15mL血浆。考虑到最终在10L培养基中进行培养，所以血浆的浓度为0.15％。另外，从血浆浓度5％开始培养时，第4天以后进行细胞传代、稀释时，培养基中血浆浓度达0.1％。确认LAK细胞培养体系中血清浓度的影响。
培养开始时分别设定含人AB血清0％、0.15％或5％的组。将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到含各浓度人AB血清的AIM V中，使细胞浓度为0.33×106细胞/mL，然后将细胞悬液加到实施例41-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养板，或固化了抗人CD3抗体及CH-296的培养板中，3mL/孔，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养瓶在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。
培养开始后第4天，分别用含0％、0.15％人AB血清的AIM V稀释细胞，使用含0％、0.15％人AB血清的AIM V培养的组中细胞浓度最大达0.05×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中(液量2.5mL)。用含0.1％人AB血清的AIM V(液量6mL)将用含5％人AB血清的AIM V培养的组中的细胞稀释成0.05×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中(液量2.5mL)。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始后第7天，用含相同浓度血清的AIM V将用含0％、0.15％人AB血清的AIM V培养的组中的细胞稀释成0.11×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的25cm2培养瓶中(液量最大12.6mL)。用含0.1％人AB血清的AIM V将用含5％人AB血清的AIM V培养的组中的细胞稀释成0.11×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的25cm2培养瓶中(液量最大12.6mL)。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第10天，用含相同浓度血清的AIM V将用含0％、0.15％人AB血清的AIM V培养的组中的细胞稀释成0.22×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的25cm2培养瓶中(液量最大12.6mL)。用含0.1％人AB血清的AIM V将用含5％人AB血清的AIM V培养的组中的细胞稀释成0.6×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的25cm2培养瓶中(液量最大12.6mL)。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。各实验进行2次。其平均值显示于表43。
表43
如表43所示，在应用含各血清浓度的AIM V培养基进行LAK细胞的培养中，无论在哪一血清浓度组，与对照组(仅用抗CD3抗体刺激)相比，应用CH-296及抗CD3抗体刺激的组中可获得高扩大培养率。也就是说，假定30mL血量的血清浓度下进行LAK细胞培养的过程中，由于CH-296和抗CD3抗体的刺激，可明显提高扩大培养率。此外，此时的培养中细胞处于高浓度、高密度，通过CH-296的刺激，即使在这样的条件下也能明显提高扩大培养率，所以可确认CH-296的有效性。
实施例44应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(血清浓度3％→1％→0％→0％、3％→1％→0.1％→0％、3％→0.5％→0.2％→0.2％(最终培养液量的一半)、3％→0.5％→0.2％→0.05％)
以与实施例43同样的观点考虑从30mL血液所得血浆浓度，确认LAK细胞培养体系中血清浓度的影响。
开始培养时人AB血清浓度为3％，设定培养第4天用含1％或0.5％人AB血清的AIM V培养基稀释细胞组、第7天用含0％、0.1％或0.2％人AB血清的AIM V培养基稀释细胞组、第10天用含0％、0.05％或0.2％人AB血清的AIM V培养基稀释细胞组。下面表44-1中显示了上述模式。
表44-1
*表示稀释细胞培养液的培养基中所含人AB血清浓度
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到含3％人AB血清的AIMV中，使细胞浓度为0.33×106细胞/mL，然后将细胞悬液加到实施例41-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养板，或固化了抗人CD3抗体及CH-296的培养板中，3mL/孔，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养瓶在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。
培养开始后第4天，用含1％人AB血清的AIM V稀释细胞(液量6mL)，使按血清浓度模式1及2培养的组中细胞浓度达0.05×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中。用含0.5％人AB血清的AIM V(液量6mL)将按血清浓度模式3及4培养的组中的细胞稀释成0.058×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始后第7天，用不含人AB血清的AIM V稀释细胞(液量12.6mL)，使按血清浓度模式1培养的组中细胞浓度达0.28×106细胞/mL，用含0.1％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将按血清浓度模式2培养的组中的细胞稀释成0.28×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。用含0.2％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将按血清浓度模式3及4培养的组中的细胞稀释成0.48×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第10天，用不含人AB血清的AIM V稀释细胞(液量12.6mL)，使按血清浓度模式1和2培养的组中细胞浓度达0.51×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。用含0.2％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将按血清浓度模式3培养的组中的细胞稀释成0.839×106细胞/mL，另外，用含0.05％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将按血清浓度模式4培养的组中的细胞稀释成0.43×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。各实验进行2次。其平均值显示于表44-2。
表44-2
如表44-2所示，在应用含各血清浓度的AIM V培养基进行LAK细胞的培养中，无论在哪一血清浓度组，与对照组(仅用抗CD3抗体刺激)相比，应用CH-296及抗CD3抗体刺激的组中可获得高扩大培养率。也就是说，假定30mL血量的血清浓度下进行LAK细胞培养的过程中，CH-296和抗CD3抗体的刺激，比单独用抗CD3抗体刺激明显提高扩大培养率。此外，此时的培养中细胞处于高浓度、高密度，通过CH-296的刺激，即使在这样的条件下也能明显提高扩大培养率，所以可确认CH-296的有效性。
实施例45应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例36-(2)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。结果如表45所示。
表45
如表45所示，应用含低浓度(1％)血清的培养基(AIM V)、联合应用培养瓶及细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养瓶的组中，LAK细胞的扩大培养率高。该结果表明，备纤连蛋白片段适用于应用含低浓度血清的培养基、联合应用培养瓶及细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行的LAK细胞培养。
实施例46应用新分离的PBMC和含有自身血浆的培养基的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(应用含0.5％自身血浆的AIMV培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行培养)
(1)PBMC的分离及保存
用采血用注射器从获得承诺的健康人供者实施30mL采血，然后将血液500×g离心20分钟，回收自身血浆和棕黄层。用PBS稀释回收的棕黄层，然后覆加到Ficoll-paque(Pharmacia)上，500×g离心20分钟。用吸管回收中间层的末梢血单核细胞(PBMC)，洗涤。将采集的新鲜PBMC用苔盼兰染色法算出活细胞数，用于各实验。
将收集的自身血浆在56℃下灭活30分钟，然后800×g离心30分钟，将上清液用作灭活的自身血浆(下文中简称作自身血浆)。
(2)抗人CD3抗体及FN片段的固定化
以下实验中使用的培养器材(25cm2培养瓶)与实施例35-(1)同样地固化了抗人CD3抗体及FN片段。使用之前，将含有抗体、FNfr的PBS从培养器材中吸去，用PBS将各培养瓶洗涤2次，用AIM V培养基洗涤1次用于各实验。
(3)LAK细胞的诱导和培养
将实施例46-(1)中制备的新鲜分离的PBMC悬浮到含有0.5％自身血浆的AIM V(以下略作0.5％自身血浆AIM V)中，使其浓度达1×106细胞/mL，然后将细胞悬液加到实施例46-(2)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养瓶或固化了抗人CD3抗体及FNfr的培养瓶中，3mL/瓶，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养瓶在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第1天添加含1000U/mL IL-2的0.5％自身血浆AIM V，7mL/瓶。培养开始后第4天，将培养液移到未经任何固化的85cm2的细胞培养用CO2气体透过性培养袋(Optisite袋或X-Fold袋Baxter制造)中，然后添加0.5％自身血浆AIM V，20mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第6天添加0.5％自身血浆AIM V，30mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第8天，将培养液的一部分适当稀释后，移到未经任何固化的85cm2的细胞培养用CO2气体透过性培养袋(Optisite袋或X-Fold袋Baxter制造)中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第11、13天添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始第15天用苔盼兰染色法算出活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。结果如表46所示。
表46
如表46所示，应用含低浓度(0.5％)自身血浆的培养基(AIM V)、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行LAK细胞诱导的初期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养瓶的组中，无论使用哪种细胞培养用CO2气体透过性培养袋LAK细胞的扩大培养率均高。这表明各纤连蛋白片段适用于应用含低浓度血浆的培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行的LAK细胞培养。
实施例47应用新分离的PBMC和含有自身血浆的培养基的LAK细胞团中CD8阳性细胞比率的测定(应用含0.5％自身血浆的AIMV培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例46-(3)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。培养开始第15天，用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表47所示。
表47
如表47所示，应用含低浓度(0.5％)自身血浆的培养基(AIM V)、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行LAK细胞诱导的初期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养瓶的组中，无论使用哪种细胞培养用CO2气体透过性培养袋LAK细胞团中CD8细胞阳性比率高。该结果表明，各纤连蛋白片段适用于应用含低浓度血浆的培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行的LAK细胞培养。
实施例48应用新分离的PBMC和含有自身血浆的培养基的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(应用含0.5％自身血浆的AIMV培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行培养)
(1)抗人CD3抗体及FN片段的固定化
以下实验中使用的培养器材(25cm2培养瓶)与实施例35-(1)同样地固化了抗人CD3抗体及FN片段。使用之前，将含有抗体、FNfr的PBS从培养器材中吸去，用PBS将各培养瓶洗涤2次，用AIM V培养基洗涤1次用于各实验。
(2)LAK细胞的诱导和培养
将用与实施例46-(1)同样的方法制备的新鲜分离的PBMC悬浮到含有0.5％自身血浆的AIM V(以下略作0.5％自身血浆AIM V)中，使其浓度达1×106细胞/mL，然后将细胞悬液加到实施例48-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养瓶或固化了抗人CD3抗体及FNfr的培养瓶中，3mL/瓶，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养瓶在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第1天添加含1000U/mL IL-2的0.5％自身血浆AIM V，7mL/瓶。培养开始后第4天，将培养液移到未经任何固化的85cm2的细胞培养用CO2气体透过性培养袋(Optisite袋)中，然后添加0.5％自身血浆AIM V，20mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第6天添加0.5％自身血浆AIM V，30mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第8天，将培养液的一部分适当稀释后，移到未经任何固化的85cm2的细胞培养用CO2气体透过性培养袋(Optisite袋)中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第11、13天添加终浓度达500U/mL的IL-2。
此外，同样将培养到第4天的培养液一部分(10mL中7mL)移到未经任何固化的180cm2的细胞培养用CO2气体透过性培养袋中后，添加0.5％自身血浆AIM V，58mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始第6天添加0.5％自身血浆AIM V，65mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第8天，将培养液的一部分适当稀释后，移到未经任何固化的180cm2的细胞培养用CO2气体透过性培养袋(Optisite袋)中，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第11、13天添加终浓度达500U/mL的IL-2。此时，还设定培养开始第11天添加130mL 0.5％自身血浆/AIM V的体系。培养开始第15天用苔盼兰染色法算出活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。结果如表48所示。
表48
如表48所示，应用含低浓度(0.5％)自身血浆的培养基(AIM V)、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行LAK细胞诱导的初期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养瓶的组中，LAK细胞的扩大培养率高，而与细胞培养用CO2气体透过性培养袋的培养面积、培养方法、最终培养量无关。该结果表明各纤连蛋白片段适用于应用含低浓度血浆的培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行的LAK细胞培养。
实施例49应用新分离的PBMC和含有自身血浆的培养基的LAK细胞团中CD8阳性细胞比率的测定(应用含0.5％自身血浆的AIMV培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例48-(2)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。培养开始第15天，用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表49所示。
表49
如表49所示，应用含低浓度(0.5％)自身血浆的培养基(AIM V)、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行LAK细胞诱导的初期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养瓶的组中，LAK细胞团中CD8细胞阳性比率高，而与细胞培养用CO2气体透过性培养袋的培养面积、培养方法、最终培养量无关。该结果表明各纤连蛋白片段适用于应用含低浓度血浆的培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行的LAK细胞培养。
实施例50应用新分离的PBMC和含有自身血浆的培养基的LAK细胞培养体系中细胞杀伤活性的测定(应用含0.5％自身血浆的AIM V培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例46-(3)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。
(2)培养的LAK细胞的细胞杀伤活性的测定
用与实施例25-(2)同样的方法测定培养后第15天LAK的细胞杀伤活性。结果如表50所示。
表50
如表50所示，应用含低浓度(0.5％)自身血浆的培养基(AIM V)、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行LAK细胞诱导的初期，与对照组相比，使用固化了各纤连蛋白片段的培养瓶的组中LAK细胞的细胞杀伤活性高。该结果表明各纤连蛋白片段适用于应用含低浓度血浆的培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行的LAK细胞培养。
实施例51应用新分离的PBMC和含有自身血浆的培养基的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(应用含0.5％自身血浆的AIMV培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行培养)
(1)抗人CD3抗体及FN片段的固定化
以下实验中使用的培养器材(25cm2培养瓶)与实施例35-(1)同样地固化了抗人CD3抗体及FN片段。使用之前，将含有抗体、FNfr的PBS从培养器材中吸去，用PBS将各培养瓶洗涤2次，用AIM V培养基洗涤1次用于各实验。
(2)LAK细胞的诱导和培养
将用与实施例46-(1)同样的方法制备的新鲜分离的PBMC悬浮到含有0.5％自身血浆的AIM V(以下略作0.5％自身血浆AIM V)中，使其浓度达5×105细胞/mL(但是，活细胞数的计测用特克溶液进行(关东化学社))，然后将细胞悬液加到实施例51-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养瓶或固化了抗人CD3抗体及FNfr的培养瓶中，3mL/瓶，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养瓶在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。培养开始后第1天添加含1000U/mLIL-2的0.5％自身血浆AIM V，7mL/瓶。培养开始后第4天，将培养液的一部分(10mL中7mL)移到未经任何固化的180cm2的细胞培养用CO2气体透过性培养袋中后，添加0.5％自身血浆AIM V，58mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始第6天添加0.5％自身血浆AIM V，65mL/袋，添加终浓度达500U/mL的IL-2。培养开始后第8天，将培养液的一部分适当稀释后，移到未经任何固化的180cm2的细胞培养用CO2气体透过性培养袋(Optisite袋)中，添加终浓度达500U/mL的IL-2.培养开始后第11、13天添加终浓度达500U/mL的IL-2。此时，还设定培养开始第11天添加130mL不含自身血浆或0.5％自身血浆/AIM V的体系。培养开始第15天用苔盼兰染色法算出活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。结果如表51所示.
表51
如表51所示，应用含低浓度(0.5％)自身血浆的培养基(AIM V)、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2CO2气体透过性培养袋进行LAK细胞诱导的初期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养瓶的组中，LAK细胞的扩大培养率高，而与细胞培养用CO2气体透过性培养袋的培养面积、培养方法、最终培养量无关。该结果表明各纤连蛋白片段适用于应用含低浓度血浆的培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行的LAK细胞培养。
实施例52应用新分离的PBMC和含有自身血浆培养基的LAK细胞团中CD8阳性细胞比率的测定(应用含0.5％自身血浆的AIM V培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行培养)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例51-(2)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。培养开始第15天，用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表52所示。
表52
如表52所示，应用含低浓度(0.5％)自身血浆的培养基(AIM V)、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行LAK细胞诱导的初期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养瓶的组中，LAK细胞团中CD8细胞阳性比率高，而与细胞培养用CO2气体透过性培养袋的培养面积、培养方法、最终培养量无关。该结果表明各纤连蛋白片段适用于应用含低浓度血浆的培养基、联合应用培养瓶和细胞培养用CO2气体透过性培养袋进行的LAK细胞培养。
实施例53应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中IL-2受体(IL-2R)表达的诱导
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例1-(3)同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。将其使用的培养基变更为含1％人AB血清的AIM V培养基。
(2)LAK细胞中IL-2R表达率的测定
用与实施例3-(2)同样的方法测定IL-2R表达阳性细胞的含有率。结果如表53所示。该表中IL-2R表达阳性细胞的含有率(％)以IL-2R表达率(％)表示。
表53
如表53所示，应用含低浓度血清的AIM V培养基进行LAK细胞诱导的初期，使用固化了各纤连蛋白片段的培养器材的组中，可诱导培养中的LAK细胞表面上IL-2R表达率增高。也就是说，该结果表明，应用含低浓度血清的培养基诱导LAK细胞时，通过与纤连蛋白片段共存，可边提高IL-2R表达率边进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例54纤连蛋白突变体蛋白质的表达(CH-296Na)
(1)CH-296Na表达载体的构建
应用序列号27、28中合成的DNA引物(分别为Primer CH-296Na1和Primer CH-296Na2)，以CH-296表达载体pCH102为模板进行PCR反应，用限制性酶NdeI和HindIII处理所得DNA片段。另一方面，制备pCold14ND2载体，它是从国际公布第99/27117号公报的实施例5中记载的pCold04按该公报中实施例4的方法制备的翻译起始密码子处有NdeI位点的载体。将上述DNA片段插入到pCold14ND2载体的NdeI-Hind III限制性酶切位点，获得载体pCold14ND2-CH-296。接下来，以pLF2435载体为模板，pLF2435载体具有编码纤连蛋白细胞结合功能域的一部分到C末端的cDNA，应用序列号28、29的合成的DNA引物(分别为Primer CH-296Na2和Primer CH-296Na3)进行PCR反应，用限制性酶BamH I和HindIII处理所得DNA片段。将所得DNA片段与用用限制性酶BamH I和HindIII处理pCold14ND2-CH-296所得片段进行连接，制成CH-296Na表达载体。
(2)CH-296Na的表达、纯化
应用实施例54-(1)制备的pCold14ND2-CH-296Na转化大肠杆菌BL21，在含1.5％(w/v)琼脂的LB培养基(含氨苄西林50μg/ml)上使转化体生长。将生成的菌落接种到30mL LB液体培养基(含氨苄西林50μg/ml)中，37℃培养一晚。将所有菌体接种到3L LB培养基中，37℃培养到对数生长期。培养时，使用5L体积的小型发酵罐(Biott制造)，150rpm，Air＝1.0L/min条件下进行。培养后，冷却到15℃，然后添加终浓度1.0mM的IPTG，15℃24小时诱导表达。其后，离心，收集菌体，再悬浮到4倍菌体体积的细胞裂解液[50mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，1mM DTT，1mM PMSF，50mM NaCl]中。通过超生破碎使菌体破碎，离心(11000rpm，20分钟)，分离上清的提取液和沉淀。用2L buffer A[50mM Tris-HCl(pH 7.5)，50mM NaCl]]对之进行透析，再用其中40mL如下通过离子交换层析进行纯化。
即，用树脂体积为100mL的SP-Sepharose(AmershamPharmacia)装柱(Φ4cm 20cm)，用buffer A饱和，用透析后的样品。用300mLbuffer A洗柱，然后依次用buffer B[50mM Tris-HCl(pH7.5)，200mM NaCl]、buffer C[50mM Tris-HCl(pH7.5)，300mM NaCl]]、bufferD[50mM Tris-HCl(pH 7.5)，500mM NaCl]]各200mL对柱进行洗脱，获得级分1～6，每级分大约100mL。所得各级分进行10％SDS-PAGE，结果分出主要包含分子量约71kD的目的蛋白质的级分，回收该级分2、3(约200mL)，用2L的buffer A进行透析。
接下来，用树脂体积为50mL的Q-Sepharose(AmershamPharmacia)装柱(Φ3cm 16cm)，用buffer A饱和，用透析后的样品。用200mL buffer A洗柱，然后依次用buffer E[50mM Tris-HCl(pH7.5)，140mM NaCl]、bufferB、buffer C各150mL对柱进行洗脱，获得级分1～5，每级分大约100mL。所得各级分进行10％SDS-PAGE，结果分出仅主要包含目的蛋白质的级分，回收该约100mL的级分1，用2L的buffer F[50mM碳酸钠缓冲液pH9.5]进行透析。
其后，用Centricone-10(Milipore)进行4倍浓缩浓缩到25mL，用10％SDS-PAGE进行验证，可检测出分子量约71kD的目的蛋白质大约呈单一条带，此为CH-296Na。其后，使用MicroBCA试剂盒(Pierce制造)测定蛋白质浓度，为3.8mg/mL。
实施例55应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(血清浓度5％→1％→0％→0％、5％→1％→0.05％→0.05％、3％→1％→0.05％→0.05％、3％→1％→0.1％→0.05％、1％→1％→0.1％→0.05％)
以与实施例43同样的观点考虑从30mL血液所得血浆浓度，确认LAK细胞培养体系中血清浓度的影响。
开始培养时人AB血清浓度为5％，设定含有3％或1％的组，分别设定如下面表54所示的用含人AB血清的AIM V培养基稀释的细胞组。如下面表54所示，还分别设定各传代日变更传代浓度的组。
表54血清浓度模式
*细胞传代浓度：(×106cells/mL)
*表中的血清浓度是指培养开始第0天开始时的浓度、以后稀释中使用的培养基中包含的血清浓度
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到含5％、3％或1％人AB血清的AIM V中，使细胞浓度为0.33×106细胞/mL，然后将细胞悬液加到实施例41-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养板，或固化了抗人CD3抗体及CH-296的培养板中，3mL/孔，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养板在5％CO2CO2中37℃培养(培养第0天)。
培养开始后第4天，用含1％人AB血清的AIM V稀释细胞(液量6mL)，使按血清浓度模式1-1、2-1及3-1培养的组中细胞浓度达0.1×106细胞/mL，按血清浓度模式1-2、2-2培养的组中细胞浓度达0.2×106细胞/mL，按血清浓度模式3-2及3-3培养的组中细胞浓度达0.05×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第7天，用不含人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将按血清浓度模式1-1培养的组中的细胞稀释成0.321×106细胞/mL，用含0.05％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将按血清浓度模式1-2及2-1培养的组中的细胞稀释成0.321×106细胞/mL，分别用含0.1％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)分别将按血清浓度模式2-2及3-1培养的组中的细胞稀释成0.321×106细胞/mL，将按血清浓度模式3-2培养的组中的细胞稀释成0.417×106细胞/mL，将按血清浓度模式3-3培养的组中的细胞稀释成0.23×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的新25cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第10天，用不含人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将按血清浓度模式1-1培养的组中的细胞稀释成0.873×106细胞/mL，用含0.05％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)分别将按血清浓度模式1-2培养的组中的细胞稀释成0.841×106细胞/mL，将按血清浓度模式及2-1培养的组中的细胞稀释成0.746×106细胞/mL，将按血清浓度模式2-2及3-1培养的组中的细胞稀释成0.643×106细胞/mL，将按血清浓度模式3-2培养的组中的细胞稀释成1.214×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的新25cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。各实验进行2次。其平均值显示于表55。
表55
如表55所示，在应用含各血清浓度的AIM V培养基进行LAK细胞的培养中，无论在哪一血清浓度组还是在任一传代浓度组，与对照组(仅用抗CD3抗体刺激)相比，应用CH-296及抗CD3抗体刺激的组中可获得高扩大培养率。也就是说，假定30mL血量的血清浓度下进行LAK细胞培养的过程中，CH-296和抗CD3抗体的刺激，比单独用抗CD3抗体刺激明显提高扩大培养率。此外，此时的培养中细胞处于高浓度、高密度，通过CH-296的刺激，即使在这样的条件下也能明显提高扩大培养率，所以可确认CH-296的有效性。
实施例56应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(IL-2浓度：100U/mL→150U/mL→150U/mL→300U/mL、200U/mL→300U/mL→300U/mL→400U/mL、1000U/mL→500U/mL→500U/mL→500U/mL)
确认LAK细胞培养体系中IL-2浓度的影响。
培养开始时及传代时如添加的IL-2浓度按下面表56-1设定。
表56-1
*IL-2浓度(U/mL)
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到含3％人AB血清的AIMV中，使细胞浓度为0.33×106细胞/mL，然后将细胞悬液加到实施例41-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养板，或固化了抗人CD3抗体及CH-296的培养板中，3mL/孔，添加终浓度达100U/mL、200U/mL或1000U/mL的IL-2.将培养板在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。
培养开始后第4天，用含1％人AB血清的AIM V(液量6mL)将备组的细胞均稀释为0.1×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中。IL-2浓度模式1中添加终浓度达150U/mL的IL-2，IL-2浓度模式2中添加终浓度达300U/mL的IL-2，IL-2浓度模式3中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第7天，用含0.05％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将各组的细胞均稀释为0.262×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。IL-2浓度模式1中添加终浓度达150U/mL的IL-2，IL-2浓度模式2中添加终浓度达300U/mL的IL-2，IL-2浓度模式3中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第10天，用含0.05％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将各组的细胞均稀释为0.585×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。IL-2浓度模式1中添加终浓度达300U/mL的IL-2，IL-2浓度模式2中添加终浓度达400U/mL的IL-2，IL-2浓度模式3中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。各实验进行2次。其平均值显示于表56-2。
表56-2
如表56-2所示，在传代时各种IL-2浓度下进行的LAK细胞培养中，无论在哪一IL-2浓度组，与对照组(仅用抗CD3抗体刺激)相比，应用CH-296及抗CD3抗体刺激的组中可获得高扩大培养率。也就是说，即使改变IL-2的浓度，CH-296和抗CD3抗体的刺激，比单独用抗CD3抗体刺激更明显提高扩大培养率。此外，此时的培养中细胞处于高浓度、高密度，设想血清浓度为采血30mL、总培养液量为10L，通过CH-296的刺激，即使在这样的条件下也能明显提高扩大培养率，所以可确认CH-296的有效性。
实施例57应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞团中CD8阳性细胞的含有率(对IL-2浓度的探讨)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例56同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞的含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表57所示。
表57
如表57所示，在培养开始时、传代时改变IL-2浓度的任一组中，与对照组(仅用抗CD3抗体刺激)相比，应用CH-296及抗CD3抗体刺激的组中可诱导LAK细胞中CD8细胞阳性比率增高。也就是说，即使改变IL-2的浓度，通过CH-296的刺激，可边明显提高导LAK细胞中CD8阳性细胞含有率边进行LAK细胞的诱导、培养。
实施例58应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(培养开始初期浓度的探讨)
设想采血30mL、最终培养液量约10L时的LAK细胞培养体系中，确认培养开始时的细胞初期浓度对扩大培养率的影响。
设定培养开始初期细胞浓度为0.083×106细胞/mL、0.167×106细胞/mL或0.33×106细胞/mL的各组。
(1)抗人CD3抗体及FN片段的固定化
以下的实验中使用的培养器材上固化了抗人CD3抗体及FN片段。即，将含有抗人CD3抗体(终浓度5μg/mL)的PBS 1.9mL或4.8mL分别均摊到12孔细胞培养板或6孔细胞培养板(Falcon制造)中。此时，在FN片段添加组中，添加制造例1中描述的各纤连蛋白片段(CH-296)，使其终浓度为25μg/mL。设立不添加CH-296的作对照。
将这些培养器材室温培养5小时后，保存在4℃，直到使用时。使用之前，将含有抗人CD3抗体、CH-296的PBS从培养器材中吸去，用PBS将各孔洗涤2次，RPMI培养基洗涤1次用于各实验。
(2)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到含3％人AB血清的AIMV中，使细胞浓度分别为0.083×106细胞/mL、0.167×106细胞/mL或0.33×106细胞/mL，然后将按0.083×106细胞/mL或0.167×106细胞/mL开始培养的组加到实施例58-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的6孔培养板，或固化了抗人CD3抗体及CH-296的6孔培养板中，7.5mL/孔，将按0.33×106细胞/mL开始培养的组加到实施例58-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的12孔培养板，或固化了抗人CD3抗体及CH-296的12孔培养板中，3mL/孔，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养板在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。
培养开始后第4天，用含1％人AB血清的AIM V(液量6mL)将各组的细胞均稀释为最大0.1×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第7天，分别用含0.05％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将按0.083×106细胞/mL开始培养的组稀释为0.227×106细胞/mL，将按0.167×106细胞/mL开始培养的组稀释为0.276×106细胞/mL，将按0.33×106细胞/mL开始培养的组稀释为0.465×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第10天，分别用含0.05％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将按0.083×106细胞/mL开始培养的组稀释为0.58×106细胞/mL，将按0.167×106细胞/mL开始培养的组稀释为0.75×106细胞/mL，将按0.33×106细胞/mL开始培养的组稀释为0.79×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。各实验进行2次。其平均值显示于表58。
表58
如表58所示，在以任何浓度开始培养的组中，与对照组(仅用抗CD3抗体刺激)相比，应用CH-296及抗CD3抗体刺激的组中可获得高扩大培养率。也就是说，即使以各种细胞浓度开始进行培养，诱导、培养LAK时，应用CH-296和抗CD3抗体的刺激，比单独用抗CD3抗体刺激更明显提高扩大培养率。此外，设想血清浓度为采血30mL、总培养液量为10L，通过CH-296的刺激，即使在这样的条件下也能明显提高扩大培养率，所以可确认CH-296的有效性。此外，对照组中，扩大培养率随培养开始时细胞初期浓度而有很大变动，而应用CH-296刺激的组中则可获得稳定的扩大培养率，而与培养开始时细胞初期浓度无关。
实施例59应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(刺激时间)
确认LAK细胞培养体系中培养开始时单独应用抗CD3抗体或抗CD3抗体和CH-296的刺激天数对扩大培养率的影响。
设定刺激天数为2天、3天或4天的各组。
将实施例1-(1)中制备的PBMC分别悬浮到含3％人AB血清的AIM V中，使各组的细胞浓度均为0.33×106细胞/mL，然后加到实施例41-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养板，或固化了抗人CD3抗体及CH-296的培养板中，3mL/孔，添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养板在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。
培养开始后第2天或第3天分别将刺激2天的组、刺激3天的组直接移到未经任何固化的新的12孔培养板中。
培养开始后第4天，用含1％人AB血清的AIM V(液量6mL)将各组的细胞均稀释为0.1×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中。各组中分别添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第7天，用含0.05％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将各组的细胞均稀释为0.45×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。各组中分别添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第10天，用含0.05％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将各组的细胞均稀释为0.6×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。各组中分别添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。各实验进行2次。其平均值显示于表59。
表59
如表59所示，从培养开始在各种刺激时间下进行LAK细胞的培养中，在任一刺激时间的组中，与对照组(仅用抗CD3抗体刺激)相比，应用CH-296及抗CD3抗体刺激的组中可获得高扩大培养率。也就是说，即使改变刺激时间，诱导、培养LAK时，应用CH-296和抗CD3抗体的刺激，比单独用抗CD3抗体刺激更明显提高扩大培养率。此外，此时的培养过程中细胞处于高浓度、高密度。另外，设想血清浓度为采血30mL、总培养液量为10L，通过CH-296的刺激，即使在这样的条件下也能明显提高扩大培养率，所以可确认CH-296的有效性。
实施例60应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(CH-296Na)
测定应用FN片段CH-296Na时，LAK细胞培养体系中的扩大培养率。
设定CH-296Na固化到培养板上的组及直接添加到细胞培养液中的组。
(1)抗人CD3抗体及FN片段的固定化
以下的实验中使用的培养器材上固化了抗人CD3抗体及FN片段。即，将含有抗人CD3抗体(终浓度5μg/mL)的PBS 1.9mL均摊到12孔细胞培养板中。此时，在FN片段添加组中，添加实施例54中描述的纤连蛋白片段(CH-296Na)，使其终浓度为28.6μg/mL。设立不添加CH-296Na的作对照。
将这些培养器材室温培养5小时后，保存在4℃，直到使用时。使用之前，将含有抗人CD3抗体、CH-296Na的PBS从培养器材中吸去，用PBS将各孔洗涤2次，RPMI培养基洗涤1次用于各实验。
(2)LAK细胞的诱导和培养
将实施例1-(1)中制备的PBMC分别悬浮到含3％人AB血清的AIM V中，使其细胞浓度为0.33×106细胞/mL，然后加到实施例60-(1)中制备的固化了抗人CD3抗体的培养板，或固化了抗人CD3抗体及CH-296Na的培养板中，3mL/孔。另外，对应于铺到固化了抗人CD3抗体的培养板中的细胞，向将CH-296Na直接添加到细胞培养液中的组中添加终浓度为1μg/mL的CH-296Na。各组中添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养板在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。
培养开始后第4天，用含1％人AB血清的AIM V(液量6mL)将各组的细胞均稀释为0.1×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中。各组中分别添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第7天，分别用含0.05％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将各组的细胞均稀释为0.5×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。各组中分别添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第10天，用含0.05％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将各组的细胞均稀释为0.94×106细胞/mL，然后分别移到未经任何固化的25cm2培养瓶中。各组中分别添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。各实验进行2次.其平均值显示于表60。
表60
如表60所示，与对照组(仅用抗CD3抗体刺激)相比，无论在将CH-296Na固化还是添加在溶液中的任一组中均可获得高扩大培养率。也就是说，诱导、培养LAK时，应用CH-296Na和抗CD3抗体的刺激，比单独用抗CD3抗体刺激更明显提高扩大培养率。另外，设想血清浓度为采血30mL、总培养液量为10L，通过CH-296Na的刺激，即使在这样的条件下也能明显提高扩大培养率，所以可确认CH-296Na的有效性。
实施例61CH-296珠子的制备
使用Dynabeas M-450Epoxy(Dynal)作为固化CH-296的珠子。用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)将2.8×108个Dynabeas M-450Epoxy洗涤3次。将洗净的2.8×108个Dynabeas M-450Epoxy悬浮到0.7mL含CH-296 140μg的PBS中，边轻轻混匀边进行固化反应，4℃进行1晚。除去反应液，用0.7mL含0.1％人血清白蛋白(HAS)的PBS置换3次，然后4℃保存，作为CH-296珠子。
另外，同样处理不含CH-296的珠子作为对照珠子。
实施例62CD3/CH-296珠子的制备
使用Dynabeas M-450Epoxy作为固化CH-296和抗人CD3抗体的珠子。用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)将4×108个Dynabeas M-450
Epoxy洗涤3次。将洗净的4×108个Dynabeas M-450Epoxy悬浮到1mL含CH-296 160μg、抗人CD3抗体32μg的PBS中，边轻轻混匀边进行固化反应，4℃进行1晚。除去反应液，用1mL含0.1％人血清白蛋白(HAS)的PBS置换3次，然后4℃保存，作为CD3/CH-296珠子。
实施例63应用低血清培养基(AIM V)的LAK细胞培养体系中扩大培养率的测定(用FNfr固化珠子进行刺激)
确认应用固化到细胞培养用载体(珠子)上的纤连蛋白片段(CH-296)对LAK细胞培养的效果。
设定用抗CD3抗体固化到珠子上的CD3珠子和未固化任何物质的对照珠子进行刺激的组(CD3珠子组)、用CD3珠子和CH-296固化到珠子上的CH-296珠子进行刺激的组(CD3珠子+CH-296珠子组)、应用抗CD3抗体和CH-296固化到珠子上的CD3/CH-296珠子进行刺激的组(CD3珠子/CH-296珠子组)。
将实施例1-(1)中制备的PBMC悬浮到含1％人AB血清的AIMV中，使其细胞浓度为0.33×106细胞/mL，然后加到未经任何固化的12孔培养板中，3mL/孔。CD3珠子组添加CD3珠子(Dynabeas M-450CD3(panT)，Bellitus，DB11113)，1×106/孔；实施例61中制备的对照珠子3.8×106/孔.CD3珠子+CH-296珠子组添加CD3珠子1×106/孔；实施例61中制备的CH-296珠子，0.76×106/孔。CD3珠子/CH-296珠子组添加实施例62中制备的CD3/CH-296珠子，2.3×106/孔。各孔中添加终浓度达1000U/mL的IL-2。将培养板在5％CO2中37℃培养(培养第0天)。
培养开始后第4天，用磁石除去各组培养液中所含各种珠子，用含1％人AB血清的AIM V(液量6mL)将各组的细胞稀释为0.07×106细胞/mL，移到未经任何固化的12.5cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第7天，分别用含1％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将各组的细胞稀释为0.25×106细胞/mL，分别移到未经任何固化的新25cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第10天，用含1％人AB血清的AIM V(液量12.6mL)将各组的细胞稀释为0.685×106细胞/mL，然后移到未经任何固化的新25cm2培养瓶中。各组中添加终浓度达500U/mL的IL-2。
培养开始第15天用苔盼兰染色法计算活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较算出扩大培养率。各实验进行2次。其平均值显示于表61。
表61
如表61所示，用各种珠子进行刺激的LAK细胞培养中，与CD3珠子组相比，用CD3珠子+CH-296珠子、CD3/CH-296珠子进行刺激的组中可获得高扩大培养率。也就是说，应用珠子作细胞培养用载体的LAK细胞培养中，用固化了CH-296和CD3抗体的珠子进行刺激比用单独固化了CD3抗体的珠子进行刺激更明显提高扩大培养率。另外，此时的培养中细胞处于高浓度、高密度，通过用CH-296珠子刺激，即使在这样的条件下也能明显提高扩大培养率，所以可确认CH-296的有效性。
实施例64应用低血清培养基(AIM V)培养的LAK细胞团中CD8阳性细胞的含有率(用FNfr固化珠子进行刺激)
(1)LAK细胞的诱导和培养
用与实施例63同样的方法进行LAK细胞的诱导和培养。
(2)LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的测定
用与实施例4-(2)同样的方法测定CD8阳性细胞的含有率。结果如表62所示。
表62
如表62所示，用各种珠子进行刺激的LAK细胞培养中，与CD3珠子组相比，用CD3珠子+CH-296珠子、CD3珠子/CH-296珠子进行刺激的组中，可诱导培养中的LAK细胞中CD8阳性细胞含有率增加。也就是说，该结果表明，应用珠子作细胞培养用载体的LAK细胞培养中，用固化了CH-296和CD3抗体的珠子进行刺激比用单独固化了CD3抗体的珠子进行刺激，可在更明显提高LAK细胞中CD8阳性细胞含有率的同时进行LAK细胞的诱导、培养。
序列表全文本
SEQ ID NO：1：名为III-8的纤连蛋白部分区域。
SEQ ID NO：2：名为III-9的纤连蛋白部分区域。
SEQ ID NO：3：名为III-10的纤连蛋白部分区域。
SEQ ID NO：4：名为IH-11的纤连蛋白部分区域。
SEQ ID NO：5：名为III-12的纤连蛋白部分区域。
SEQ ID NO：6：名为III-13的纤连蛋白部分区域。
SEQ ID NO：7：名为III-14的纤连蛋白部分区域。
SEQ ID NO：8：名为CS-1的纤连蛋白部分区域。
SEQ ID NO：9：纤连蛋白片段C-274。
SEQ ID NO：10：纤连蛋白片段H-271。
SEQ ID NO：11：纤连蛋白片段H-296。
SEQ ID NO：12：纤连蛋白片段CH-271。
SEQ ID NO：13：纤连蛋白片段CH-296。
SEQ ID NO：14：纤连蛋白片段C-CS1。
SEQ ID NO：15：纤连蛋白片段CHV-89。
SEQ ID NO：16：纤连蛋白片段CHV-90。
SEQ ID NO：17：纤连蛋白片段CHV-92。
SEQ ID NO：18：纤连蛋白片段CHV-179。
SEQ ID NO：19：纤连蛋白片段CHV-181。
SEQ ID NO：20：纤连蛋白片段H-275-Cys。
SEQ ID NO：21：引物12S。
SEQ ID NO：22：引物14A。
SEQ ID NO：23：引物Cys-A。
SEQ ID NO：24：引物Cys-S。
SEQ ID NO：25：纤连蛋白片段CH-296Na。
SEQ ID NO：26：编码纤连蛋白片段CH-296Na的多聚核苷酸。
SEQ ID NO：27：引物CH-296Na1。
SEQ ID NO：28：引物CH-296Na2。
SEQ ID NO：29：引物CH-296Na3。
产业上利用的可能性
根据本发明的细胞毒性淋巴细胞的制备方法，即使在应用无血清/低血清浓度的培养基，也可获得扩大培养率高、能维持高细胞杀伤活性、显著性增加IL-2表达量、提高CD8阳性细胞比率的细胞毒性淋巴细胞。该淋巴细胞适用于例如过继性免疫疗法。因此，可期待本发明的方法为医疗领域的巨大贡献。
Claims (18)
1.一种细胞毒性淋巴细胞的制备方法，其特征在于，它包括应用培养基中血清和血浆的总浓度为0容量％或以上但小于5容量％的培养基，在纤连蛋白或者具有细胞结合功能域、肝素结合功能域中的至少一种功能域且具有细胞附着活性和/或肝素结合活性的纤连蛋白片段存在下，培养末梢血单核细胞或含有所述细胞的材料，进行选自诱导、维持及扩大培养细胞毒性淋巴细胞中的至少一种步骤。
2.权利要求1的方法，其中细胞毒性淋巴细胞，与不存在纤连蛋白或者具有细胞结合功能域、肝素结合功能域中的至少一种功能域且具有细胞附着活性和/或肝素结合活性的纤连蛋白片段的条件下制备的淋巴细胞相比，高表达白细胞介素2受体。
3.权利要求1的方法，其中细胞毒性淋巴细胞，与不存在纤连蛋白或者具有细胞结合功能域、肝素结合功能域中的至少一种功能域且具有细胞附着活性和/或肝素结合活性的纤连蛋白片段的条件下制备的淋巴细胞相比，含有高比率的CD8阳性细胞。
4.权利要求1的方法，与不存在纤连蛋白或者具有细胞结合功能域、肝素结合功能域中的至少一种功能域且具有细胞附着活性和/或肝素结合活性的纤连蛋白片段条件下的细胞毒性淋巴细胞制备方法相比，该方法是扩大培养率高的方法。
5.权利要求1～4任一项中的方法，其中细胞毒性淋巴细胞，与不存在纤连蛋白或者具有细胞结合功能域、肝素结合功能域中的至少一种功能域且具有细胞附着活性和/或肝素结合活性的纤连蛋白片段的条件下制备的淋巴细胞相比，细胞杀伤活性增强或能维持高细胞杀伤活性。
6.权利要求1的方法，其中纤连蛋白或者具有细胞结合功能域、肝素结合功能域中的至少一种功能域且具有细胞附着活性和/或肝素结合活性的纤连蛋白片段固定化到固相上。
7.权利要求6的方法，其中固相为细胞培养用器材或细胞培养用载体。
8.权利要求7的方法，其中细胞培养用器材为平皿、培养瓶、或培养袋，细胞培养用载体为珠子、膜或载玻片。
9.权利要求1的方法，其中细胞毒性淋巴细胞为淋巴因子活化的杀伤细胞。
10.权利要求1的方法，其中纤连蛋白的片段为至少包含序列表中序列号1～8中任一氨基酸序列的多肽。
11.权利要求10的方法，其中纤连蛋白的片段是至少一种如下所示的多肽，即选自具有序列表中序列号9～20及25所示的任一氨基酸序列的多肽。
12.在细胞培养用器材中进行的权利要求1的方法，满足这样的条件：
(a)细胞培养开始时的细胞数与细胞培养用器材培养面积的比率为1细胞/cm2～5×105细胞/cm2，和/或
(b)培养开始时培养基中的细胞浓度为1细胞/mL～5×105细胞/mL。
13.权利要求12的方法，不包括进行细胞培养液稀释步骤。
14.权利要求1的方法，其中在纤连蛋白或者具有细胞结合功能域、肝素结合功能域中的至少一种功能域且具有细胞附着活性和/或肝素结合活性的纤连蛋白片段存在下、在含培养基的细胞培养用器材中进行细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持及扩大培养中至少任何一种的方法中，包含至少一次的细胞培养液稀释步骤、培养基的交换步骤或细胞培养用器材的交换步骤，且至少一次的细胞培养液稀释步骤、培养基的交换步骤或细胞培养用器材的交换步骤之后紧接着的培养条件满足：
(c)细胞培养液中细胞的浓度为2×105细胞/mL～1×108细胞/mL，或
(d)细胞培养液中细胞数与细胞培养用器材培养面积的比率为1×105细胞/cm2～1×108细胞/cm2。
15.权利要求1的方法，其中在纤连蛋白或者具有细胞结合功能域、肝素结合功能域中的至少一种功能域且具有细胞附着活性和/或肝素结合活性的纤连蛋白片段存在下、在含培养基的细胞培养用器材中进行细胞毒性淋巴细胞的诱导、维持及扩大培养中至少任何一种的方法中，包含至少一次的细胞培养液稀释步骤、培养基的交换步骤或细胞培养用器材的交换步骤，且至少一次的细胞培养液稀释步骤、培养基的交换步骤或细胞培养用器材的交换步骤之后培养基中血清及血浆的总浓度与开始培养时相同，或者比开始培养时降低。
16.一种细胞毒性淋巴细胞培养用培养基，其特征在于，它包含纤连蛋白或者具有细胞结合功能域、肝素结合功能域中的至少一种功能域且具有细胞附着活性和/或肝素结合活性的纤连蛋白片段作有效成分、且血清及血浆的总浓度在0容量％或以上但小于5容量％。
17.权利要求1的方法，还包含将外源基因导入细胞毒性淋巴细胞的步骤。
18.权利要求17的方法，应用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或猴病毒导入外源基因。
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