JP2002522513A - 哺乳動物細胞を形質導入する方法およびそれに関連する産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明によって、細胞を形質導入する方法が提供され、この方法は、その中に細胞を有する可撓性閉鎖培養容器を提供する工程、およびこの細胞を、多機能性化学部分の存在下でウイルスベクターと接触させる工程を包含する。機能性タンパク質をそれが必要な被験体に送達する方法もまた提供され、この方法は、本発明の方法に従って哺乳動物細胞を形質導入する工程、および該細胞をそれが必要な被験体に導入する工程を包含する。細胞を形質導入するための細胞培養システムもまた提供され、このシステムは、可撓性閉鎖培養容器およびその中に多機能性化学部分を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａ
ｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｅｓｅａｓｅｓによって出資されたプロジェク
ト番号Ｚ０１ ＡＩ ００６４４およびＺ０１ ＡＩ ００６４５の下、米国政
府の支援によって行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

【０００２】 （発明の背景） 本発明は、一般的にはエキソビボ遺伝子治療、およびより詳細には、ウイルス
ベクターで細胞を形質導入するための改善された方法に関する。

【０００３】 患者細胞内への治療遺伝子の導入は、遺伝性遺伝障害、癌、感染性疾患および
免疫障害のようなヒト疾患の処置のための、有望なアプローチである。治療遺伝
子を導入するための１つのアプローチは、個体から標的細胞集団を単離する工程
、細胞が培養物中に維持される間にその細胞内に治療遺伝子を移入させる工程、
形質導入された細胞について試験および選択する工程、次いで被験体にその遺伝
子操作した細胞を再導入する工程を包含する。この手順（エキソビボ遺伝子治療
として公知である）は、臨床的に適切な数の培養細胞における高レベルの遺伝子
移入および遺伝子発現を達成することが現在可能でないことによって、制限され
ている。

【０００４】 遺伝子の細胞内への移入は、多くの物理学的および生物学的方法によって達成
され得る。純粋なＤＮＡは、エレクトロポレーションまたは直接的マイクロイン
ジェクションの後、あるいはこのＤＮＡがカチオン性脂質またはリン酸カルシウ
ムと複合体化される場合に、細胞に進入する。しかし、これらの方法は、一般的
に、臨床的使用には非常に非効率的でありかつ労力を要する。

【０００５】 臨床適用のための遺伝子移入のより効率的な方法は、異種遺伝子のキャリアと
して作動するように遺伝子操作されるウイルスベクターによる、細胞の形質導入
を伴う。このウイルスベクターの選択は、所望の標的細胞型および形質導入アプ
ローチに依存する。例えば、改変されたアデノウイルスおよびアデノ関連ウイル
スは、非常に高い力価で生成され得、そして標的細胞において一過的に高レベル
の遺伝子発現を提供する。複製欠損レトロウイルスもまた、主にその宿主染色体
ＤＮＡ内への安定な組み込みが所望される細胞を形質導入するために、臨床的に
使用される。この移入された遺伝子は忠実に複製され、そしてこのレトロウイル
ス形質導入細胞の子孫において発現される。特定の細胞型に対する親和性を有す
る他のウイルス、および操作されたハイブリッドウイルスもまた、エキソビボ遺
伝子治療適用において使用される。

【０００６】 遺伝子治療は、被験体内へ導入される細胞の全てまたは大部分が所望の遺伝的
改変を含む場合に、最も有益である。しかし、細菌をウイルスベクターで形質導
入するための現代のストラテジーは、この目標を達成していない。形質導入効率
を改善する１つの手段は、培養された標的細胞とウイルスベクターとを密接に近
位にさせることである。例えば、標的細胞のウイルス産生細胞との同時培養を使
用して、非常に効率的な遺伝子移入が達成されている。しかし、同時培養は、被
験体に導入される細胞を他の細胞に曝露させることの安全性についての懸念、お
よびこのような同時培養システムにおける感染の再現性についての懸念を生じる
。

【０００７】 今日までの細胞のエキソビボ培養および形質導入は一般に、硬質の、ガス非透
過性である、従来のポリスチレンから作製された培養プレートおよび培養フラス
コの使用を含む。従来のポリスチレン培養容器は、培養培地中に溶解したガスの
調節および培養培地のｐＨの調節のための開放システムに、必然的に連結される
。代表的に、これらの従来の培養容器は、調節された濃度のＯ₂およびＣＯ₂で充
填されたインキュベーター中で維持され；この培養容器のキャップまたはふたは
、周囲のガス混合物を受け入れるために、容器主部から外（ｏｆｆｓｅｔ）され
、従って環境に対して開放されねばならない。結果として、この細胞培養物は、
この環境からの混入に曝露される。

【０００８】 従って、エキソビボ遺伝子治療適用のために細胞を形質導入するための、改善
された方法の必要性が存在する。本発明はまた、この必要性を満たし、そして関
連する利点も提供する。

【０００９】 （発明の簡単な説明） 本発明に従って、細胞を形質導入する方法を提供し、この方法は、その中に細
胞を有する可撓性閉鎖培養容器（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｃｌｏｓｅｄ ｃｕｌｔｕ
ｒｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を提供する工程、および多機能性化学部分（ｍｕｌ
ｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｉｅｔｙ）の存在下で、
この細胞をウイルスベクターと接触させる工程を包含する。本発明の方法は、閉
鎖された流体通過システム中で臨床的に適切な数の哺乳動物細胞を効率的に形質
導入するために有用である。機能的タンパク質をそれを必要とする被験体に送達
する方法もまた提供し、この方法は、本発明の方法に従って哺乳動物細胞を形質
導入する工程、およびこの細胞をそれを必要とする被験体内に導入する工程を包
含する。

【００１０】 別の実施態様に従って、細胞を形質導入するための容器システムを提供し、こ
のシステムは、可撓性閉鎖培養容器、およびその容器中に多機能性化学部分を備
える。本発明のシステムは、閉鎖された流体通過システム中で哺乳動物細胞を形
質導入するための、本明細書中に記載の方法において有用である。

【００１１】 （発明の詳細な説明） 本発明に従って、哺乳動物細胞を形質導入する方法が提供され、その方法は、
その中に細胞を有する可撓性閉鎖培養容器を提供する工程、およびその細胞を多
機能性化学部分の存在下でウイルスベクターと接触させる工程を包含する。多機
能性化学部分を可撓性閉鎖培養容器中に取り込むことによって、本発明の方法は
、臨床的に安全な環境において異種遺伝子のウイルス形質導入効率を増大させる
手段を有利に提供する。

【００１２】 本明細書で使用される句「多機能性化学部分」は、少なくとも１つの「ウイル
ス結合ドメイン」および必要に応じて他の機能性ドメイン（例えば、培養容器な
どへの付着を媒介するドメイン）に連結した少なくとも１つの「細胞表面結合ド
メイン」を有する実質的に純粋な化学部分をいう。多機能性化学部分は、ウイル
スベクターおよび標的細胞を同時に局在させるために機能し、これは、多機能性
化学部分の非存在下での形質導入効率に対してウイルスの形質導入効率を増大さ
せる。多機能性化学部分は、コーティングなどによって、本発明の可撓性の閉鎖
した培養容器に付着され得るか、またはウイルス形質導入の前または間に培養培
地へ添加される。

【００１３】 本発明の方法において使用されるその可撓性閉鎖培養容器は、閉鎖流体路シス
テムにおいて臨床的に意味のある数の哺乳動物細胞を効率的に形質導入する利点
を提供する。可撓性閉鎖培養容器システムはまた、有利に、培養培地が容器を介
して連続的に還流されることを可能にする。例えば、新鮮な培地を徐々に添加す
るか、または所望でない産物を、その中に培養された細胞を妨害せずに希釈する
ことは有用であり得る。細胞の過剰な操作を最小化することによって、それらの
生存性および移植の可能性は改善され得る。同様に、そのウイルス上清は、その
容器を介して、可撓性閉鎖容器の表面およびその中にある細胞とのウイルスの接
触を最小にするために連続的に還流され得る。所望であれば、これらの溶液は、
所定の流速でそのシステムによって自動的に汲み上げられ得る。

【００１４】 本明細書で使用される句「可撓性閉鎖培養容器」は、ポリスチレンの内部増殖
表面を有する気体浸透性閉鎖容器をいう。このタイプの容器は、ＰＬ２４１７容
器（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｏｕｎｄ Ｌａｋｅ，ＩＬ
）によって例示され、ＰＣＴ ＵＳ９５／１３９４３（これは、本明細書中でそ
の全体が参考として援用される）に記載される。

【００１５】 可撓性容器の内部表面は、好ましくは、約０．０００４インチの厚さを有する
ポリスチレンの超薄層である。その外部表面は、約０．００６〜約０．００８イ
ンチの厚さを有するポリマー材料またはポリマー材料の混合物から構成される。
このような容器は、好ましくは、以下の物理的特性を有する：約１０，０００〜
３０，０００ｐｓｉの曲げ率；約９〜１５Ｂａｒｒｅｒｓの酸素透過性；約４０
〜８０Ｂａｒｒｅｒｓの二酸化炭素透過性；約１０〜１００Ｂａｒｒｅｓの窒素
透過性；２０ｇ ｍｉｌ／１００ｉｎ²／日を超えない水蒸気通気率；およびＡ
ＳＴＭ Ｄ１００３に従ってＨａｚｏｍｅｔｅｒによって測定される約０．１％
〜１０％の範囲内の光学的清澄性。その容器はまた、照射滅菌に耐え得る。

【００１６】 接着性細胞培養のために、増殖表面は、好ましくは、約４０ダイン／ｃｍより
大きい表面エネルギーを有する。最も接着性の細胞は、負に荷電した増殖表面を
必要とするが、正に荷電した表面を必要とするものもある。接着性細胞培養のた
めの可撓性培養容器は、それゆえ、負に荷電したか、または正に荷電した表面の
いずれかを有し得る。

【００１７】 従来的な組織培養ディッシュにおけるＯ₂およびＣＯ₂の交換は、特に大きな培
養ディッシュにおいて、全く効率的ではないが、これは、そうでなければ、臨床
的に意味のある数の細胞を含有し得る。本発明の１つの利点は、可撓性閉鎖培養
容器の気体の透過性が、気体の非常に効率的な交換を提供することである。これ
により、従来の培養容器に比べて、より高い細胞の生存性およびより迅速な細胞
増殖が可能になる。

【００１８】 従来の平板組織培養ディッシュは、可撓性ではなく、それゆえ、このようなデ
ィッシュ中の培養物は、そのディッシュの表面およびその上にある細胞が覆われ
ることを確実にするために大容量の培地を必要とする。特に、本発明の形質導入
手順のために、培養容器中でのウイルス上清溶液の容量を最小化することが所望
される場合は、従来的なディッシュは不利である。その閉鎖培養容器の可撓性は
、有利にも、その中にある培地またはウイルス上清の容量が最小化されることを
可能にする。例えば、可撓性閉鎖培養容器の増殖表面は、数ミリメートルの液体
で覆われる必要があるのみであり、その後、その容器中の空気は、滅菌的に引か
れ得、その細胞が十分に覆われることを確実にする。

【００１９】 １つの実施態様において、全細胞収集物および所望であれば予備選択は、閉鎖
流体路システム（例えば、ＣＳ３０００／ＩＳＯＬＥＸ３００ｉ（Ｂａｘｔｅｒ
Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ））において行われ、これ
は、次いで、細胞を可撓性の培養容器に移すためにその容器に無菌的に連結され
る。本明細書で使用される用語「閉鎖流体路システム」は、構成要素のアセンブ
リをいい、その各々は、周囲の環境に対して閉鎖されており、その構成要素間で
滅菌的連結をもたらすための手段を用いて提供される。多機能性化学部分、細胞
懸濁液、ウイルスベクター、および培養培地は、図１に示されるような滅菌連結
ポートおよび滅菌チュービングシステムを介して、その可撓性培養容器に添加ま
たはそこから除去され得る。あるいは、ポートの他の構成もまた、本発明の可撓
性培養容器に関連して本明細書中で意図される。例えば、細胞および／またはウ
イルスベクターを有する培地が、容器の内部表面での多機能性化学ドメインとの
静的インキュベーションおよび相互作用のために、同じポートに進入し、そして
排出する場合、チュービングを有するたった１つのポートのみが存在し得る。チ
ュービングは、細胞および／またはウイルスベクターを有する培地のポンプおよ
び／またはリザーバーにシールまたは滅菌的に連結され得る。

【００２０】 さらに、形質導入した細胞のサンプルは、分析のための滅菌連結ポートを介し
て無菌的に容器から排出され得る。細胞形質導入後に、注入可能培地（例えば、
ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ ＩＶ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｕｎ
ｄ Ｌａｋｅ，ＩＬ））への濃縮が、滅菌連結ポートを介して無菌的に行われ得
、そしてその洗浄され、濃縮された細胞が、その細胞を環境に曝すことなく、ま
たはその患者をその細胞に曝すことなく、患者の静脈内ラインを介して直接注入
され得る。

【００２１】 本明細書で使用される用語「連結された」または「連結」は、多機能性化学部
分をいう場合、効率的な形質導入のために標的細胞およびウイルスベクターが同
時に局在するように細胞表面結合ドメインとウイルス結合ドメインとの間の作動
可能な連結をいう。特定の細胞表面結合ドメインおよびウイルス結合ドメインに
依存して、その連結は、連結アームの反対側の末端に２つ以上の反応性基を有す
る薬剤を使用して、化学的架橋によって達成され得る。これらの架橋剤は、細胞
表面およびウイルス結合ドメインフラグメントにある官能基と反応し、安定な共
有結合を形成する。適切な架橋試薬は、当該分野で公知であり、そして容易に商
業的に入手可能である。

【００２２】 ２以上のペプチドサブユニットを含む多機能性化学部分はまた、細胞結合ドメ
インおよびウイルス結合ドメインを単一のポリペプチド鎖上にコードする核酸配
列の発現によって組換え生成され得る。多機能性化学部分はまた、当該分野で公
知の方法によって直接合成され得る。

【００２３】 １つの実施態様では、細胞表面結合ドメインおよびウイルス結合ドメインは、
可撓性培養容器の表面へのそれらの独立した結合によって「連結」され、その結
果、この容器の表面は、多機能性化学部分として機能する。この細胞表面結合ド
メインおよびウイルス結合ドメインは、各ドメインがこの容器の表面に結合され
る限り、この容器に連続してかまたは一緒にかのいずれかで結合され得る。この
細胞表面結合ドメインおよびウイルス結合ドメインの各々は、各ドメインが互い
に充分に近くに存在してウイルスベクターおよび細胞を同時に局在させる（ｃｏ
−ｌｏｃａｌｏｚｅ）ように機能するのに充分な量で、この容器の表面に結合さ
れる。

【００２４】 本明細書中で使用される場合、語句「細胞表面結合ドメイン」とは、細胞の表
面に結合し、その結果、その細胞表面結合ドメイン以外のドメインがその細胞表
面の極めて近くに存在し、そしてそのドメインを１以上の他の表面との相互作用
に利用し得る能力を有する部分をいう。その細胞表面への結合は、例えば、細胞
膜脂質、またはその細胞表面に存在するタンパク質もしくは糖タンパク質への結
合であり得る。例えば、その結合は、その細胞表面上のレセプター（例えば、イ
ンテグリン、増殖因子およびサイトカインのレセプターなど）への結合を介して
であり得る。

【００２５】 例示的な細胞表面結合ドメインは、増殖因子およびサイトカイン（例えば、Ｅ
ＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、インスリン、ＩＧＦ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、Ｇ
−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン、インターロイキン、ＴＮＦなど、
ならびにそれらの細胞表面結合フラグメントおよびアナログ）のような細胞表面
結合分子；細胞外マトリクスタンパク質（例えば、フィブロネクチン、コラーゲ
ン、ラミニン、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）、トロンボスポンジ
ン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）、フォンビルブラント因子、フィブリノー
ゲン、テネイシン、オステオポンチンなど、およびそれらの細胞表面結合フラグ
メントおよびアナログ）；細胞表面分子に結合する抗体および抗体フラグメント
；レクチン；ならびに細胞−細胞接着分子（例えば、カドヘリン、ファスシクリ
ン（ｆａｓｃｉｃｌｉｎ）およびＩＣＡＭなど、ならびにそれらの細胞結合フラ
グメントおよびアナログ）、に存在する。

【００２６】 細胞表面結合分子の特定の細胞表面結合ドメインは、特徴付けられており、そ
して本発明の方法において用いられ得る。例えば、多くの細胞外マトリクス接着
タンパク質は、細胞表面インテグリンとのそれらの相互作用を媒介するＡｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含む（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：
４９１−４９７（１９８７））。この配列を含むペプチドは、細胞表面結合フラ
グメントである。細胞外マトリクスタンパク質における他の細胞結合ドメイン（
例えば、トロンボスポンジンのアミノ末端由来のＴＳＰＮ１８組換えフラグメン
トおよびＴＳＰＮ２８組換えフラグメント（Ｉｎｃａｒｄｏｎａら，Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２：４３１−４４２（１９９６））；コラーゲンペプ
チドモチーフＤＧＥＡ（Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．，１６：２７３−２８３（１
９９７））；ラミニンのペンタペプチドＹＩＧＳＲ（Ｇｒａｆら，Ｃｅｌｌ，４
８：９８９−９９６（１９８７））など）もまた認識される。

【００２７】 本発明の好ましい細胞表面結合ドメインは、フィブロネクチンの細胞表面結合
フラグメントである。フィブロネクチンのいくつかのフラグメントは、細胞の表
面上のインテグリンに結合する。フィブロネクチンの例示的な細胞表面結合フラ
グメントは、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＲＧＤＳ）を含みそして必
要に応じて配列Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（ＰＨＳＲＮ）を含む
フラグメントである。このようなフラグメントはまた、９番目および１０番目の
フィブロネクチンＩＩＩ型反復の全てまたは一部を含み得る。フィブロネクチン
の細胞表面結合フラグメントはまた、選択的にスプライシングされたＩＩＩＣＳ
領域内のＶＬＡ−４（α４β１）インテグリン結合部位ＣＳ−１（セグメント−
１を連結する）であり得るか、またはこれに由来する、トリペプチドｌｅｕ−ａ
ｓｐ−ｖａｌ（ＬＤＶ）を含有する細胞結合フラグメントであり得る（Ｗａｙｎ
ｅｒら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１６：４８９−４９７（１９９２））。
フィブロネクチンのさらなる細胞結合フラグメントは、ＶＬＡ−５（α５β１）
インテグリンに結合するＮ末端マトリクスアセンブリ部位である（Ｈｏｃｋｉｎ
ｇら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４１：２４１−２５３（１９９８））。本
発明の細胞表面結合フラグメントは、フィブロネクチンのこれらの細胞結合ドメ
インのうちの１以上を含み得る。

【００２８】 多機能性化学部分はまた、ウイルス結合ドメインを含む。本明細書中で使用さ
れる場合、用語「ウイルス結合ドメイン」とは、ウイルスの表面に結合し、その
結果、そのウイルス結合ドメイン以外のドメインがそのウイルス表面の極めて近
くに存在し、そしてこのドメインを１以上の他の表面との相互作用に利用し得る
、部分をいう。例示的なウイルス結合ドメインは、以下のようなウイルス結合分
子において見出される：ウイルスレセプター分子（例えば、ＨＩＶについてのレ
セプターであるＣＤ４；ＥＢＶについてのレセプターであるＣＲ２（Ｓｉｎｈａ
ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５３１１−５３２０（１９９３）））；両種
向性マウス白血病ウイルスについてのレセプターであるＧＬＶＲ−２またはＰｉ
ｔ２（ｖａｎ Ｚｅｉｊｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，９１：１１６８−１１７２（１９９４），Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，７１：４５６４−４５７０（１９９７））；コクサッキーウイルスおよびア
デノウイルスについてのレセプターであるＣＡＲ（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎら，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７５：１３２０−１３２３（１９９７）など）ならびにそのウイ
ルス結合フラグメント；ｅｎｖ遺伝子産物のようなウイルス表面分子に結合する
、抗体および抗体フラグメント；ヘパラン硫酸；ならびに細胞外マトリクス分子
のヘパリン結合ドメイン。別の例示的なウイルス結合ドメインは、ヒトフィブロ
ネクチンの高親和性ヘパリン結合ドメインＩＩ（ＦＮ ＩＩＩ型反復１２、１３
、１４）およびそのウイルス結合フラグメントである。

【００２９】 細胞表面結合ドメインまたはウイルス結合ドメインは、細胞結合活性またはウ
イルス結合活性がそれぞれ維持される限り改変され得る。このような改変として
は、例えば、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸の、付加
、欠失または置換が挙げられ得る。天然の細胞表面結合ドメインまたはウイルス
結合ドメインの構造的アナログ（例えば、ペプチド模倣物）もまた、細胞結合活
性またはウイルス結合活性が維持される限り、生成され得、そして本発明の範囲
内に含まれ得る。

【００３０】 細胞表面結合ドメインまたはウイルス結合ドメインは、このようなドメインを
含む分子のタンパク質分解または化学的切断、およびこの分子の単離によって生
成され得る。細胞表面結合ドメインまたはウイルス結合ドメインはまた、このよ
うなドメインをコードする核酸配列を含む適切なベクターを用いて組換え生成さ
れ得る。細胞表面結合ドメインまたはウイルス結合ドメインはまた、当該分野で
公知の合成方法によって直接合成され得る。

【００３１】 細胞形質導入に適切な好ましい多機能性部分は、細胞表面結合ドメインおよび
ウイルス結合ドメインの両方を含む、細胞外マトリクス分子またはそれ由来のフ
ラグメントである。例示的な多機能性部分は、ヒトフィブロネクチンであり、そ
のアミノ酸配列は、Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔら，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．，４（７
）：１７５５−１７５９（１９８５）に示される。フィブロネクチンは、血漿か
ら精製され得るか、組換えによって生成され得るかまたは商業的に入手され得る
。フィブロネクチンの１以上のウイルス結合ドメインおよび１以上の細胞表面結
合ドメインを含む、フィブロネクチンの「多機能性フラグメント」もまた本発明
の範囲内に含まれる。これらのフラグメントは、組換えによって、またはフィブ
ロネクチンのタンパク質分解によって生成され得る。

【００３２】 フィブロネクチンの多機能性フラグメントには、フィブロネクチンの３０／３
５ｋＤａカルボキシ末端キモトリプシンフラグメントのようなフラグメントが含
まれる（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：７２７７−
７２８１（１９８１）；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．８２：８０３−８３１（１９８２））。フィブロネクチンの多機能性フラグ
メントにはまた、ＣＨ−２９６、Ｈ−２９６およびＣＨ−２７１フラグメントの
ような組換え的に産生されたフラグメントが含まれる（Ｈａｎｅｎｂｕｒｇら、
Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：８７６−８８２）。フィブロネクチンフ
ラグメントＣＨ−２９６は、ヒトフィブロネクチンのアミノ酸１６９０〜１９８
５に組換え的に融合されたアミノ酸１２３９〜１５１５からなる。フィブロネク
チンフラグメントＨ−２９６は、ヒトフィブロネクチンのアミノ酸１６９０から
１９８５からなる。フィブロネクチンフラグメントＣＨ−２７１は、ヒトフィブ
ロネクチンのアミノ酸１６９０〜１９６０に組換え的に融合されたアミノ酸１２
３９〜１５１５からなる。フィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６、Ｈ−２
９６、およびＣＨ−２７１の配列は、米国特許第５，１９８，４２３号（これは
、その全体が参考として本明細書中に援用される）に示される。

【００３３】 本明細書中で使用される場合、用語「細胞」とは、培養物中に維持され得、か
つウイルスベクターを用いて形質転換され得る哺乳動物細胞をいう。この用語は
、初代細胞および樹立された細胞株の両方を含むことが意図される。本発明の好
ましい細胞は、ヒト細胞であり、そして任意の関連する組織起源であり得る。遺
伝子形質転換のために適切な標的細胞には、自己複製の能力を有する種々の組織
由来の前駆細胞（ケラチノサイト、線維芽細胞、肝細胞、および筋芽細胞を含む
）が含まれる。特に好ましい細胞は、ヒト造血細胞（例えば、造血幹細胞、リン
パ球、樹状細胞、および単球）である。

【００３４】 句「造血細胞」とは、血液および免疫細胞であるか、またはそれらになるよう
に分化する細胞をいう。そのような細胞には、例えば、幹細胞（例えば、ＣＤ３
４＋幹細胞を含む多能性造血幹細胞）、リンパ系幹細胞、および骨髄性幹細胞が
含まれる。句「造血幹細胞」はまた、本明細書中で使用される場合、前駆細胞お
よび未成熟細胞（例えば、Ｔ細胞前駆体およびＢ細胞前駆体、顆粒球−単球前駆
体、好酸球前駆体、好塩基球前駆体、巨核球前駆体および赤血球前駆体）を含む
。本発明の造血細胞にはまた、成熟細胞（例えば、Ｂリンパ球およびＴリンパ球
、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、ならびに肥満細胞）が含
まれる。特に好ましい造血細胞は、リンパ系細胞、樹状細胞、および単球である
。

【００３５】 造血細胞は、種々の組織および液体の供給源（例えば、胚性卵黄嚢、胎児肝臓
、脾臓、胸腺、リンパ、骨髄、臍帯血および末梢血を含む）から得られ得る。好
ましい造血細胞の供給源は、アフェレーシスによって得られた末梢血である。樹
状細胞もまた、皮膚のような非リンパ系の器官から得られ得る。

【００３６】 本発明の方法による細胞の形質転換は、選択されていない細胞集団中で実行さ
れ得る。あるいは、特定の細胞型が、形質転換の前に選択的に富化されて、必要
とされるウイルスの量を減少させ得、そして選択されていない集団に対して形質
転換の速度を増大させ得る。その表面上に特異的なタンパク質を発現する細胞は
、特異的な結合剤（例えば、特異的抗体のような）との相互作用によって、容易
に単離され得る。例として、ＣＤ３４＋造血幹細胞は、これらの細胞の表面上の
ＣＤ３４＋抗原の存在によって、形質転換の前に選択的に富化され得、これらの
細胞は、ＣＤ３４＋モノクローナル抗体を用いて標的化され得る。ＣＤ３４＋細
胞選択のための種々の手段が、以下の特許文献中に記載される：米国特許第５，
５３６，４７５号；同第５，２４０，８５６号；同第５，４１１，８６３号など
。

【００３７】 本発明の方法によって形質転換され得る細胞はさらに、特定の細胞系統（例え
ば、樹状細胞）に沿って培養中に分化され得る細胞を含む。例えば、単核細胞は
、樹状細胞の増殖および分化を促進するために、密度勾配遠心分離によって白血
球搬出産物から単離され得、そして造血成長因子（例えば、ＩＬ−４、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ、またはＴＮＦ−α）の存在下で培養され得る。

【００３８】 本発明の方法による形質転換は、添加物（例えば、多機能性化学部分の存在下
において細胞の形質転換の効率を増強させる、硫酸デキストランまたは「ポリカ
チオン」）の存在下で行われ得る。本明細書中で使用される場合、用語「ポリカ
チオン」とは、正に荷電した組成物（例えば、ポリカチオン性脂質、プロタミン
硫酸、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリブレン、キトサン、ポリ
（エチレンイミン）、塩基性基（例えば、アミン）を組み込んでいるポリマーな
ど）を含む。適切なポリカチオンおよびその濃度は、当業者により決定されて、
形質転換効率を最大化し、そして細胞毒性を最小化し得る。好ましいポリカチオ
ンはプロタミンであり、これは、０．５μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌとの間、よ
り好ましくは約６μｇ／ｍｌの濃度で使用され得る。

【００３９】 本発明の方法による細胞形質転換は、無血清で動物タンパク質を含まない培地
中で実行され得る。この無血清で動物タンパク質を含まない基本培地は、Ｘ−Ｖ
ＩＶＯ １０またはＸ−ＶＩＶＯ １５（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋ
ｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のような製品として販売されている培地、造血幹細胞
−ＳＦＭ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）であり得
るか、または哺乳動物細胞培養に都合のよい任意の処方の培地であり得る。無血
清培地は、以下の特許文献に記載されている：ＷＯ ９５／００６３２；米国特
許第５，４０５，７７２号；ＰＣＴ ＵＳ９４／０９６２２。無血清基本培地は
、臨床グレードのヒト血清アルブミンを約０．５〜５．０％、通常約１．０％（
ｗ／ｖ）の濃度で含み得る。ヒト血清由来の臨床グレードのアルブミン（例えば
、ＢＵＭＩＮＡＴＥ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｙｌａｎｄ，Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ）
）は、他の血清成分から非常に高度に精製かつ単離されているので、本明細書中
では無血清とみなされる。

【００４０】 無血清でありかつ動物タンパク質を含まない培地処方物は、ウシ胎仔血清（Ｆ
ＣＳ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中に存在するような動物タンパク質
を含まない。これらは、細胞培養における伝統的な添加物である。動物タンパク
質の不在は、細胞の、外来タンパク質（これは、細胞の免疫機能に有害な影響を
与えるか、またはさもなくばそれらの性質を変える）との接触を排除する。動物
タンパク質を含まない培地処方物はまた、被験体に、高度に免疫原性の動物タン
パク質を回帰させる危険（これは、アナフィラキシー的なショックおよび死を引
き起こし得る）を排除する。

【００４１】 本明細書中で使用される場合、用語「形質転換する」とは、「ウイルスベクタ
ー」中に含まれる特定の核酸配列の、細胞への導入をいう。本発明の方法による
形質転換は、多機能性化学部分の存在下で、細胞をウイルスベクターと接触させ
る工程を包含し、その結果、ウイルス核酸が細胞に侵入し、そしてそこで発現さ
れ得る。ウイルスに基づくシステムは、比較的高いレベルの異種核酸を種々の細
胞に導入し得る利点を提供する。

【００４２】 哺乳動物細胞を形質転換するために適切なウイルスベクターは、当該分野で周
知である。これらのウイルスベクターには、例えば、単純疱疹ウイルスベクター
（例えば、米国特許第５，６７２，３４４号および同第５，５０１，９７９号）
、ワクシニアウイルスベクター（例えば、Ｐｉｃｃｉｎｉら、Ｍｅｔｈ．ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５４５−５６３（１９８７））；Ｂ型肝炎に基
づくベクター（例えば、Ｃｈａｉｓｏｍｃｈｉｔら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
，４：１３３０−１３４０（１９９７））；サイトメガロウイルスベクター（例
えば、Ｍｏｃａｒｓｋｉら、Ｖｉｒａｌ−ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｙ．Ｇｌｕｚｍａｎ
およびＳ．Ｈ．Ｈｕｇｈｅｓ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８
８，７８〜８４頁）；アデノウイルスベクター（例えば、米国特許第５，７３１
，１７２号および同第５，７０７，６１８号）；アデノ関連ウイルスベクター（
例えば、米国特許第５，７４１，６８３号；同第５，４７８，７４５号；および
同第５，７５６，２８３号）；レンチウイルスベクター（例えば、Ｎａｌｄｉｎ
ｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１１３８２−１
１３８８（１９９６））；パルボウイルスベクター（例えば、米国特許第５，５
８５，２５４号）；レトロウイルスベクター（例えば、米国特許第４，４０５，
７１２号；同第４，６５０，７６４号；同第５，６８６，２７９号；同第５，５
９１，６２４号；同第５，６９３，５０８号；同第５，７４７，３２３号；同第
５，６６７，９９８号；同第５，６７２，５１０号；同第５，５８０，７６６号
および同第５，７１６，８２６号）などが挙げられる。

【００４３】 本発明の方法に特に好ましいウイルスベクターは、複製欠陥レトロウイルスベ
クターである。レトロウイルスベクターに移入された遺伝子は、染色体ＤＮＡに
組み込まれ、従って子孫細胞において忠実に複製されそして発現される。これら
のベクターは、宿主ゲノムにおける受容されない遺伝子欠損または遺伝子再配列
のない、広い範囲の標的細胞型における安定な遺伝子組み込みを媒介し得る。複
製欠陥レトロウイルスベクターは、遺伝的にｇａｇ、ｐｏｌまたはｅｎｖの遺伝
子配列を含まず、そして標的細胞の形質導入後、子孫ウイルスを産生し得ない。
複製欠陥レトロウイルスベクターは、広宿主性の（アンホトロピックな）ウイル
ス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ））に由来し得る
。特に好ましいウイルスベクターは、ＭＦＧＳレトロウイルスベクター（Ｃｅｌ
ｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能；Ｗｅｉｌら
、Ｂｌｏｏｄ，８９：１７５４〜１７６１（１９９７））。

【００４４】 レトロウイルスベクターは、完全なウイルス粒子を作製するのに必要なｇａｇ
、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質を生成するように遺伝的に改変されている特定
の「パッケージング」細胞株にパッケージされる。目的の遺伝子はレトロウイル
スベクターＤＮＡに挿入され、このベクターは、組換え複製欠陥レトロウイルス
をパッケージしかつ落とす細胞のクローンを得るためにパッケージング株にトラ
ンスフェクトされる。複製欠陥レトロウイルスのためのパッケージング細胞株は
、ＣＲＩＰパッケージングプラスミドを含み得る。例えば、Ψ−ＣＲＩＰ ＮＩ
Ｈ ３Ｔ３ マウス繊維芽細胞株（Ｄａｎｏｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：６４６０〜６４６４（１９８８））。好ましいパッ
ケージング細胞株は、広宿主性２９３−ＳＰＡヒト胚性腎細胞パッケージング株
である（Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒａｐｙ，８：１４５９〜１
４６７（１９９７））。

【００４５】 本発明のウイルスベクターはまた、偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）ウイルスの
生成のためにパッケージされ得る。このようなハイブリッドウイルスは、カプシ
ドに封入される１つの型のウイルスの核酸および特定のタンパク質成分、または
異なる型のウイルスの外部被膜（ｃｏａｔ）を含む。偽型ウイルスは２つ以上の
ウイルスの有用な特徴との組み合わせで有利である。例えば、標的細胞内のクロ
ーニングまたは複製に特に影響を受けやすいウイルス核酸は、増強した堅牢性ま
たは特定の細胞向性を提供するウイルス被膜内にパッケージされ得る。偽型ウイ
ルスの特定の例は、水疱性口内炎ウイルス−Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープでパ
ッケージされたレトロウイルスベクターである。

【００４６】 本発明の別の実施態様に従って、細胞を形質転換するための容器システムが提
供される。このシステム可撓性閉鎖培養容器、およびその中に多機能性化学部分
を備える。その中に多機能性化学部分を有する可撓性閉鎖培養容器は、例えば、
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のような水性緩衝液中で調製され得る。多機
能性化学部分を含有する溶液は、容器の増殖する表面をカバーするのに十分な量
で可撓性の培養容器に適用され得、そして室温かまたは３７℃で数時間インキュ
ベートされ得る。可撓性の培養容器をコーティングするため、適切な濃度の多機
能性化学部分は、約１μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは、約１０μ
ｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの間である。この溶液は、必要に応じてインキュベ
ーション後に除去され得る。あるいは、多機能性化学部分は、形質転換手順の前
にまたはその間に、細胞培養培地またはウイルス上清に添加され得る。

【００４７】 本発明の別の実施態様に従って、機能的なタンパク質を、それが必要な被験体
に送達するための方法が提供される。この方法は、本発明の方法に従って、その
中に細胞を有する可撓性閉鎖培養容器内で細胞を形質転換する工程、および形質
転換した細胞をそれが必要な被験体に導入する工程、を包含する。

【００４８】 代表的に、それが必要な被験体は、例えば、遺伝欠陥、感染、新生物形成、免
疫機能の変化、組織損傷などにより特徴付けられる異常な疾患状態である「病理
症状」を有する患者である。従って、機能的なタンパク質をそれが必要な被験体
に送達する本発明の方法に従って、病理症状は適切な遺伝子を形質導入した導入
細胞を患者に導入することにより処置され得る。例えば、遺伝子欠損は、欠損遺
伝子の野生型コピーをコードする核酸配列を導入した細胞を、被験体に導入する
ことにより処置され得る。これらの核酸配列は、遺伝子欠損を補償する構造タン
パク質または酵素のようなタンパク質を発現する。治療遺伝子は、それ自体が影
響される細胞型に送達される必要はない。例えば、種々の酵素を発現しそして分
泌するように操作されている細胞は、身体の種々の領域に再移植されて分泌産物
を生成し得る。

【００４９】 本発明の方法により処置され得る代表的な遺伝子欠損としては、例えば、アデ
ノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損またはプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（
ＰＮＰ）欠損により生じる重篤な複合免疫不全、ｐｈｏｘサブユニット遺伝子欠
損により生じる慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、インシュリン欠損により生じる糖尿病
、ＬＤＬレセプター欠損により生じる高コレステロール血症、第ＩＸ因子欠損に
より生じる血友病、ならびにグロビン遺伝子欠損により生じるサラセミアおよび
貧血が挙げられる。

【００５０】 新生物形成もまた、本発明の方法により処置され得る。新生物的な細胞増殖の
阻害の原因である遺伝子を発現する遺伝的に改変した細胞が導入され得る。この
ような遺伝子は、ｐ５３およびＲｂのような腫瘍サプレッサーであり得；癌遺伝
子発現を阻害するアンチセンス分子またはリボザイム分子をコードし得；腫瘍に
対する薬物感受性を誘導し得；腫瘍に対する免疫応答を増大し得；または細胞傷
害性産物をコードし得る。例えば、細胞は、Ｆａｓ−発現腫瘍の殺傷のためにＦ
ａｓリガンドで形質導入され得る。腫瘍細胞はまた、化学療法剤の引き続く投与
による殺傷に対して腫瘍細胞を感受性にさせる遺伝子で形質導入され得る。例え
ば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）は、腫瘍細胞に導入され
得、そしてこの患者はガンシクロビルで全身的に処置され得る。「バイスタンダ
ー（傍観）効果」は、形質導入した腫瘍細胞および形質導入していない腫瘍細胞
の両方の殺傷を提供する。腫瘍細胞はまた、サイトカイン遺伝子（例えば、ＩＬ
−２およびＧＭ−ＣＳＦ）で形質導入され得、ワクチンとして被験体に注射され
抗腫瘍免疫応答を増強し得る。

【００５１】 特定の細胞型の特徴であるタンパク質またはそのペプチドフラグメントは、抗
原提示細胞により適切に提示される場合、免疫系により認識され得る。例えば、
細胞は腫瘍特異的分子で形質導入され、その分子を保有する新生物細胞の排除の
ための体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答を開始するため個体に戻され得
る。同様に、ウイルスおよび他の病原因子により感染された細胞の特徴であるタ
ンパク質またはペプチドは、特徴であるタンパク質またはペプチドをコードする
ウイルス−ベクターでの形質導入後に免疫系に適切に提示され得る。

【００５２】 多くの化学的治療剤の毒性は、随伴性の白血病減少症および／または血小板減
少症を伴う骨髄剥離に起因し、そして特定の薬物に耐性である造血幹細胞の集団
を作成することが有利である。従って、正常細胞、特に正常造血幹細胞は、伝統
的癌治療法に対する補助剤としての化学的治療剤に対する耐性を付与する遺伝子
で形質導入され得る。例えば、患者細胞は、多薬物耐性（ＭＤＲおよびＭＲＰの
ような）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、メチルグアニンメチルトランスフェラー
ゼ、アルデヒドデビロゲナーゼなどをコードする遺伝子で形質導入され得、そし
て増大した投与量の化学的治療剤が投与され得る。

【００５３】 本発明の方法により処置され得る免疫系の障害は自己免疫障害を含む。多くの
障害が自己免疫機構から生じると考えられており、例えば、慢性関節リウマチ、
多発硬化症、Ｉ型糖尿病，全身性狼瘡エリテマトーデス、重症筋無力症、乾癬お
よび異常性天疱瘡を含む。免疫細胞は、自己抗原に対する寛容を誘導するために
宿主免疫系に適切に提示される自己抗原で形質導入され得、それによってこの自
己免疫疾患を処置する。

【００５４】 本発明の方法により処置され得る免疫系の障害はまた、同種異系細胞または組
織の拒絶により引き起こされる障害を含む。同種異系ＭＨＣ分子は高度に免疫原
性であり、ミスマッチが多すぎる場合、移植された細胞の拒絶の引き金となる。
従って、同種異系細胞の拒絶は、この同種異系細胞を、受容体と一致するＭＨＣ
分子を用いてか、またはミスマッチＭＨＣ分子をブロックする分子で形質導入す
ることにより予防され得る。

【００５５】 感染性の障害は、ウイルス感染、複製またはアセンブリを阻害する遺伝子で形
質導入された細胞を被験体中に導入することにより処置され得る。このような遺
伝子は、例えば、抗ウイルス抗体、ウイルス付着を防ぐ変異体ウイルスレセプタ
ー、抗ウイルスリボザイム、アンチセンス転写物などをコードする。例えば、Ａ
ＩＤＳおよびＨＩＶ−１の症状は、造血幹細胞を、ＨＩＶプロモーターに連結さ
れたＨＩＶ ｇａｇ、ｒｅｖまたはｉｎｔのドミナントネガティブ変異体で形質
導入することにより処置または予防され得る。この形質導入された集団由来の分
化した細胞は、ＨＩＶ感染から保護される。同様の戦略がまた、その他の感染性
疾患を処置または予防するために採用され得る。

【００５６】 心臓血管疾患もまた遺伝子治療法を受け易い。例えば、レシチン：コレステロ
ールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子で形質導入された細胞の導入
は、アテローム性硬化症を低減し得る；そして内皮組織に送達された、酸化窒素
シンターゼをコードする遺伝子、ＦａｓリガンドおよびＧＡＸ（増殖拘束特異的
ホメオボックス）は、再狭窄を予防または処置し得る。

【００５７】 本発明の方法により処置され得る症状は、造血系の障害を特に含む。造血細胞
は単離するのが簡単で、そして造血系を再増殖するために分裂および分化し得る
幹細胞の集団を含む。本明細書で用いられるとき、用語「造血障害」は、造血細
胞に影響する障害を含み：ホジキンおよび非ホジキンＢおよびＴ細胞リンパ腫お
よび白血病のような新形成；サラセミア、ファンコーニ貧血、アデノシンデアミ
ナーゼ（ＡＤＡ）欠乏、Ｘ連鎖重篤合併免疫不全症候群（Ｘ−ＳＣＩＤ）、慢性
肉芽腫症（ＣＧＤ）、ゴシュ病、フルラー症候群、鎌状赤血球症など；ＡＩＤＳ
のような感染性障害；および化学的治療および放射線処置により引き起こされる
造血および免疫機能不全を含む。

【００５８】 慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）は、血液好中球白血球が抗微生物性の過酸化水素を産
生しないことにより引き起こされる免疫系の遺伝性欠損である。ＣＧＤ患者血液
好中球は、過酸化水素の化学的前駆体であるスーパーオキシドの産生に必要なＮ
ＡＤＰＨオキシダーゼ酵素における欠陥を有する。食細胞ＮＡＤＰＨオキシダー
ゼは、いくつかのタンパク質サブユニットからなる。サブユニットのいずれか１
つの産生に影響する遺伝的変異は、ＣＧＤを有する患者を生じる。ＣＧＤの２つ
の最も一般的な形態は、ｇｐ９１^phoxオキシダーゼサブユニットタンパク質をコ
ードする遺伝子中の欠陥から生じるＸ連鎖変種、およびｐ４７^phoxオキシダーゼ
サブユニットタンパク質をコードする遺伝子中の欠陥から生じる常染色体性の劣
性変種である。造血ＣＤ３４＋幹細胞は、循環性血液好中球を生じるので、ＣＧ
Ｄ患者ＣＤ３４＋幹細胞が、欠けているオキシダーゼサブユニットを産生するこ
とを可能にするために採用された本発明の方法は、ＣＧＤのオキシダーゼ欠陥を
矯正し得る。なぜなら、機能的に矯正された好中球が、増殖および分化によって
遺伝子が矯正された幹細胞から産生されるからである。

【００５９】 本発明の方法により形質導入された細胞は、この症状を効果的に処置するため
にその必要のある被験体中に導入される。この形質導入された細胞は、同一個体
またはＭＨＣ一致個体から先に得られ得る。細胞の被験体中への導入は、一般に
、注入溶液中の細胞の静脈内注入によって達成される。好適な注入溶液は、１％
ヒト血清アルブミンを含む、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ注入溶液（Ｂａｘｔｅｒ Ｈ
ｅａｌｔｈＣａｒｅから入手可能）である。

【００６０】 ここで、本発明を、以下の非制限的実施例への参照により詳細に記載する。本
明細書に記載されるすべての米国特許およびすべての刊行物は、それに対する参
照によりそれらの全体が本明細書中に援用される。

【００６１】 （実施例Ｉ） （多機能性化学的成分の存在下の可撓性容器中のＣＤ３４＋細胞の形質導入） この実施例は、ヒト細胞が、多機能性化学的成分の存在下で、可撓性の閉鎖培
養容器中で効率的に形質導入され得ることを示す。

【００６２】 フィブロネクチンフラグメンでコートされたおよびコートされていない、可撓
性の閉鎖培養容器および従来の培養プレートにおいてヒト造血幹細胞を形質導入
する効率を比較した。詳細には、以下の４つの培養容器条件を比較した：１）フ
ィブロネクチンフラグメントでコートされたガス透過性の可撓性プラスチック容
器；２）コートされていないガス透過性の可撓性プラスチック容器；３）フィブ
ロネクチンフラグメントでコートされた従来のハードプラスチック組織培養プレ
ート；および４）コートされていない従来のハードプラスチック組織培養プレー
ト。培養ベッセルの表面をコートするために用いた多機能性の化学的成分は、Ｃ
Ｈ−２９６と称されるフィブロネクチンの組換えヒトカルボキシル末端フラグメ
ントであった（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｃｏ．；米国特許第５，１９８，４
２３号を参照のこと）。用いたＢａｘｔｅｒ ＰＬ２４１７ガス透過性の可撓性
プラスチック培養容器は、１２０ｍｌのサイズであった（完全に膨張して１２０
ｍｌを保持する側面あたり１５ｃｍ×７．５ｃｍ表面積）。

【００６３】 多機能性化学部分ＣＨ−２９６を、１００μｇ／ｍｌの濃度でＨＥＰＥＳ緩衝
液を加えたリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２〜７．４のＰＢＳ）中に溶解し
、そしてこの溶液の１０ｍｌを２２ゲージ針および２０ｃｃのシリンジを用いて
ＰＬ２４１７容器へと導入した。室温での一晩のインキュベーションによって、
ＣＨ−２９６フィブロネクチンフラグメントが静電引力によってＰＬ２４１７容
器の内部表面をコーティングすることが可能になった。その時点でＣＨ−２９６
フィブロネクチンフラグメント溶液を除去し、そしてその容器を３０分間１５ｍ
ｌの２％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングした。次いで、この容器をＨ
ＥＰＥＳ緩衝液を含む４０ｍｌのハンクス緩衝化生理食塩水（ＨＢＳＳ）を用い
て３回洗浄した。６ウェルの従来の硬プラスチック組織培養プレート（３５ｍｍ
直径のウェル）を、フィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６を伴うＰＢＳの
溶液５ｍｌを用いて同時に処理して、その表面のコーティング、続いてブロッキ
ングおよび洗浄をさせた。コントロールとして、コーティングされていないＰＬ
２４１７可撓性ガス透過性容器または６ウェルの従来の組織培養プレートを同様
にブロッキングおよび洗浄した。

【００６４】 上記の条件を初期の実験において用いたが、以下の研究は、類似の結果が得ら
れ得ることを実証した：１．）ＨＥＰＥＳを含まないが２０μｇ／ｍｌ〜１００
μｇ／ｍｌのＣＨ−２９６を含むＰＢＳ溶液を用いてコーティングする場合；２
．）コーティング時間が２時間〜一晩ある場合；および３．）ブロッキング溶液
がＨＥＰＥＳを伴うＨＢＳＳ中の２％ウシ血清アルブミンの代わりに、ＰＢＳ中
の１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ある場合。

【００６５】 初期の形質導入効率実験は、末梢血から幹細胞を動員するために顆粒球コロニ
ー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，Ａｍｇｅｎ）を５または６回の一日用量で処置した正
常ドナーの末梢血から得られた、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を用いて行われた。
続きの実験において、末梢血ＣＤ３４＋幹細胞を、Ｘ連鎖ｇｐ９１^phox欠損慢性
肉芽腫疾患として知られる遺伝性免疫欠損を伴う患者から同様に得た。ボランテ
ィアまたは患者を、Ｇ−ＣＳＦ動員の５日目または６日目にアフェレーシス手順
にかけて、ＣＳ３０００ Ｐｌｕｓ血球分離器（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃ
ａｒｅ、Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）を用い
て幹細胞について富化した単核細胞画分を採取した。このアフェレーシス生成物
を、ＣＤ３４＋抗原に対して指向されたモノクローナル抗体を用いて、製造業者
の指示に従ってＩＳＯＬＥＸ３００ＳＡ免疫磁性幹細胞選択系デバイス（Ｂａｘ
ｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｄｅｅｒｆ
ｉｅｌｄ，ＩＬ）を用いて、抗体選択手順に供した。この精製したＣＤ３４＋細
胞を、１０％のＤＭＳＯ／９０％ウシ胎仔血清中で、使用するまで液体窒素上の
蒸気相において凍結保存した。

【００６６】 フィブロネクチンフラグメントでコーティングしたＰＬ２４１７可撓性ガス透
過性容器中でのＣＤ３４＋細胞の形質導入効率の初期研究のために、ＭＦＧＳ−
ｇｐ９１^phox両栄養性レトロウイルスベクターを使用した。ＭＦＧＳレトロウイ
ルスベクター骨格は、以前に記載されており、そして種々の臨床的な遺伝子治療
設定において使用されている（例えば、Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ ９
４：１２１３３−１２１３８、１９９７を参照のこと）。このレトロウイルスベ
クターは、２９３ ＳＰＡパッケージング細胞株を用いて生成された。この細胞
株は、ウイルスパッケージングタンパク質（ｇａｇ，ｐｏｌおよび両栄養性エン
ベロープ）を産生するように操作されたヒト胚性腎臓細胞株である（Ｄａｖｉｓ
ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１４５９−１４６７，１９９
７を参照のこと）。ＭＦＧＳ−ｇｐ９１^phoxレトロウイルスベクターを、１２時
間かけて、１％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充したＸ−ＶＩＶＯ １０
培地（無血清の動物タンパク質を含まない培地、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒから
入手可能）中で２９３−ＳＰＡ両栄養性パッケージング株のコンフルエントなプ
ロデューサー細胞層から収集し、そしてこれをＶｅｃｔｏｒ Ｓｕｐｅｒｎａｔ
ａｎｔ（ＶＳＮ）と命名した。このＶＳＮは、以下に記載するすべての実施例／
実験において使用するベクターである。

【００６７】 特に、ＭＦＧＳ−ｇｐ９１^phoxベクターは、食細胞血球ＮＡＤＰＨオキシダー
ゼ酵素のサブユニットの一つであるヒトｇｐ９１^phoxのコード配列を含む（Ｌｉ
、Ｆ、ら、Ｂｌｏｏｄ ８４：５３、１９９４を参照のこと）。このベクターは
、Ｘ連鎖慢性肉芽腫性疾患として知られる遺伝性免疫欠損のｇｐ９１^phoxタンパ
ク質欠損形態を処置するための遺伝子治療のための臨床適用のために特に設計さ
れた。これはまた、簡便なマーカー遺伝子である。なぜなら、ＦＩＴＣ結合体化
抗ｇｐ９１^phoxモノクローナル抗体（抗体７Ｄ５）をフローサイトメトリーアッ
セイにおいて使用してこのレトロウイルスベクターで首尾よく形質導入した細胞
の表面上のマーカーとしてこの治療タンパク質の発現を検出し得るからである。

【００６８】 Ｘ連鎖ＣＧＤを有する患者は、遺伝子欠損を有し、成熟し分化した食細胞（例
えば、好中球）がｇｐ９１を生成しないことをもたらし、それゆえ殺菌性オキシ
ダント、スーパーオキシドおよび過酸化水素を生成することができないことが公
知である。ＭＦＧＳ−ｇｐ９１^phoxレトロウイルスベクターでの、ｇｐ９ｌ^phox 欠損Ｘ連鎖ＣＧＤを有する患者からのＣＤ３４＋細胞のＭＦＧＳ−ｇｐ９１^phox 両栄養性レトロウイルス形質導入は、フローサイトメトリーを使用して培養され
たＣＤ３４＋細胞におけるｇｐ９１^phox発現を検出することか、または形質導入
されたＣＤ３４＋細胞から分化した好中球におけるオキシダーゼ活性化（オキシ
ダント生成）のフローサイトメトリーアッセイを用いることによって評価され得
る。しかし、形質導入された正常ＣＤ３４＋細胞においてでさえ、抗体標識およ
びフローサイトメトリーによって検出されるｇｐ９１^phoxの初期の発現を、マー
カーとして使用して、このレトロウイルスベクターによる首尾よい形質導入を示
し得る。これは、このタンパク質が、骨髄性細胞の分化後期においてのみ生成さ
れ、そして通常、培養の最初の９〜１０日の間は、正常なＣＤ３４＋細胞の表面
でさえ存在しないからである。

【００６９】 実験「０日目」の午後に、凍結した正常なヒトＣＤ３４＋細胞（上記のように
入手し、そして保存した）を解凍し、そして１％ ＨＳＡおよび以下のヒト組換
え増殖因子を補充したＸ−ＶＩＶＯ １０培地１５ｍｌ中に再懸濁した：（１０
μｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ、１００μｇ／ｍｌ Ｐｉｘｙｋｉｎｅ［インターロイ
キン３／顆粒球コロニー刺激因子｛ＧＭ−ＣＳＦ｝融合タンパク質、Ｉｍｍｕｎ
ｅｘ Ｃｏｒｐから］、１００μｇ／ｍｌ ｆｌｔ３−リガンド［ｆｌｔ３Ｌ、
Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐから］、および１００μｇ／ｍｌ幹細胞因子［ＳＣＦ
、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから］）。この培地は、本実施例および他の実施例に
おいて、「標準的なＣＤ３４＋細胞培地」と命名する。培地を伴う細胞を、標準
的な組織培養フラスコ中で３７℃の組織培養インキュベーター中、１０％ＣＯ₂
においてインキュベートした。翌朝（実験「１日目」）、ＣＤ３４＋細胞を、低
速遠心分離によってスピンダウンし、そして形質導入培地中に懸濁した。この培
地は、５０％の標準的なＣＤ３４＋細胞培地および５０％ ＶＳＮ（すなわち、
上記の２９３−ＳＰＡパッケージング株によって採取されたＭＦＧＳ−ｇｐ９１ ^phox ベクター上清）からなり、それには、６μｇ／ｍｌの臨床等級プロタミンが
添加されていた。１２０ｍｌの大きさのＰＬ２４１７可撓性容器を用いた実験の
部分について、３．５×１０⁶ ＣＤ３４＋細胞を伴う２０ｍｌの形質導入培地
を、２つの可撓性容器の各々に配置した（フィブロネクチンフラグメントＣＨ−
２９６コーティング対非コーティング）。比較のために、０．５×１０⁶細胞を
伴う５ｍｌの形質導入培地を、６ウェルの標準的な組織培養プレートの２つのウ
ェルの各々に配置した（フィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６コーティン
グ対非コーティング）。

【００７０】 「１日目」形質導入の６時間後、可撓性容器またはプレートのウェルの内容物
を取り出し、そして４サンプルを各々、スピンダウンしてその細胞を回収し、一
方で形質導入培地を捨てた。この細胞を、もとの容量と等量（ウェルのサンプル
については５ｍｌ、および可撓性容器のサンプルについては２０ｍｌ）の容量の
標準的なＣＤ３４＋細胞培地中に一晩再懸濁し、そして一晩のインキュベーショ
ンのためにもとの培養容器へと戻した。翌朝、各容器の内容物を取り出し、そし
て遠心分離し、その細胞を、それぞれ同じ容量の形質導入培地中に再懸濁し、そ
して形質導入培地を有する細胞を、「２日目」の６時間の形質導入のためにそれ
ぞれもとの培養容器へと戻した。「２日目」の形質導入の終わりに、その細胞を
、「１日目」についてと全く同様に処理し、ここで、それら細胞を形質導入培地
から取り出し、そしてもとの容量の標準的なＣＤ３４＋細胞培地中に再懸濁し、
それぞれもとの容器中で一晩インキュベートした。この形質導入プロセスを「３
日目」に反復し、次いでその細胞を標準的なＣＤ３４＋細胞培地中に、「６日目
」の分析まで放置した。すべての形質導入、一晩培養および続く形質導入後の培
養を、１０％ＣＯ₂で３７℃の組織培養インキュベーター中で行った。

【００７１】 「６日目」に、その形質導入されたＣＤ３４＋細胞を洗浄し、そしてＦＩＴＣ
結合体化抗ヒトｇｐ９１^phoxモノクローナル抗体で標識した。蛍光フローサイト
メトリー分析によって、フィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６コーティン
グしたＰＬ２４１７可撓性培養容器中の細胞の８２％が組換えｇｐ９１^phoxを発
現したが、一方で、コーティングしていないＰＬ２４１７可撓性培養容器におけ
る細胞は２７％しか組換えｇｐ９１^phoxを発現しなかったことが明らかになった
。したがって、可撓性のプラスチック製ガス透過性の培養容器中でトランスフェ
クションを行うことの固有の不確定性のために、フィブロネクチンコーティング
した可撓性培養容器対コーティングしていない可撓性培養容器における形質導入
率において３倍という驚くべき増加が存在した。これは、効率よい形質導入のた
めのフィブロネクチンの重要性を示唆する。同様に、６ウェルプレートのフィブ
ロネクチンフラグメントコーティングしたウェルにおいて培養した細胞の８６％
は、組換えｇｐ９１^phoxを発現し、そしてこれは、コーティングしていないウェ
ルにおいて見出されたものと比較して２倍を超える形質導入率の増加を提示した
。

【００７２】 同じ可撓性容器および条件を用いたいくつかの続きの研究は、ＰＬ２４１７可
撓性容器のフィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６でのコーティングがコー
ティングされていないバッグ中において見られた結果よりも３〜７倍高い形質導
入率を一貫してもたらすことを実証した。フィブロネクチンフラグメントで増強
された形質導入の同様の結果が、臨床的に適用可能なより大きな１リットルサイ
ズのＰＬ２４１７可撓性容器（１７ｃｍ×２２．５ｃｍが研究された）をフィブ
ロネクチンフラグメントでコーティングした場合に得られた。これらの研究室で
の研究において、１リットルのサイズのバッグを２０μｇ／ｍｌのフィブロネク
チンフラグメントＣＨ−２９６を含有する４０ｍｌのＰＢＳを用いて２〜６時間
室温でコーティングし、そして１％の臨床等級のＨＳＡを含有する６０ｍｌのＰ
ＢＳを用いて３回洗浄した。

【００７３】 上記の詳細な実験において記載される条件を用いて、形質導入培地中へのプロ
タミンの含有は、驚くべきことに、最大の形質導入をもたらした。形質導入期間
の間にプロタミンの含有させないと、フィブロネクチンフラグメントでの容器の
コーティングの形質導入増強効果は顕著に減少した。例えば、フィブロネクチン
コーティングした容器を用いた２つの実験において（ここで、条件は、形質導入
培地中に６μｇ／ｍｌのプロタミンを含むかまたは含まないことを除いて、上記
で詳述した実験と同一である）、形質導入率は、第一の実験においてプロタミン
ありで７１％に対して、プロタミンなしでは５３％であり、そして第二の実験に
おいてプロタミンありで９０％に対して、プロタミンなしでは１６％であった。
したがって、形質導入培地の液体相へのプロタミンの含有は、予想外に、ＰＬ２
４１７可撓性プラスチック製容器における形質導入の増強においてフィブロネク
チンフラグメントＣＨ−２９６を用いた培養容器のコーティングの効果との相乗
効果を実証した。

【００７４】 （実施例ＩＩ） （臨床試験） 以下の実施例は、多機能性化学部分の存在下でのガス透過性可撓性培養容器中
でのエキソビボで形質導入した患者細胞が、遺伝子治療適用において使用され得
ることを実証する。

【００７５】 実施例Ｉにおいて概説した前臨床研究は、フィブロネクチンフラグメントＣＨ
−２９６に対応する多機能性化学部分を有するＰＬ２４１７可撓性容器のコーテ
ィングがレトロウイルス形質導入を大いに増強し得ることを示したことから、本
発明の方法を使用して、Ｘ連鎖ｇｐ９１^phox欠損形態のＣＧＤのための遺伝子治
療の臨床試験を実施した。この臨床試験は現在実施中であり、そしてこの試験の
結果は公開されていない。

【００７６】 Ｘ連鎖ｇｐ９１^phox欠損形態のＣＧＤを伴う３人の患者に、８つの１日の皮下
容量の骨髄増殖因子である顆粒球マクロファージコロニー刺激因子５μｇ／ｋｇ
およびｆｌｔ３Ｌ ５０μｇ／ｍｌ（両方の増殖因子を、Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏ
ｒｐ．から得た）を投与した。８日目および９日目において、患者にアフェレー
シス手順を受けさせ、１５リットルをＣＳ３０００血球分離機で実施例Ｉに概説
するように処理した。ＣＤ３４＋細胞を、アフェレーシス生成物から、完全自動
化ＩＳＯＬＥＸ ３００ｉ免疫磁性プロセッサ（Ｎｅｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅ
ｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を製造業者の指示にしたがって用
いて分離した。分離したＣＤ３４＋細胞（これは、平均８０〜９０％の純度であ
り、そして各アフェレーシス調製物から合計１５０〜３００×１０⁶細胞を数え
る）を直ぐに約１２０ｍｌの臨床的ＣＤ３４＋細胞培地（１％ＨＳＡおよび以下
のヒト組換え増殖因子：５０μｇ／ｍｌ Ｐｉｘｙｋｉｎｅ ［Ｉｍｍｕｎｅｘ
Ｃｏｒｐ］、１００μｇ／ｍｌ ｆｌｔ３Ｌ ［Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ］
、および５０μｇ／ｍｌ ＳＣＦ ［Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ］を補充した
Ｘ ＶＩＶＯ １０培地と規定される）中に懸濁した。したがって、この臨床的
ＣＤ３４＋細胞培地は、実施例Ｉに記載される標準的なＣＤ３４＋細胞培地に、
増殖因子の濃度におけるわずかないくらかの変動およびＧ−ＣＳＦを含まないこ
とを除いて非常に類似していた。

【００７７】 この細胞を、フィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６コーティングした１
リットルサイズのＰＬ２４１７可撓性プラスチック製容器中で一晩インキュベー
トした（コーティングを、実施例Ｉの最終パラグラフにおけるように実施した）
。翌朝、少量のアリコートの細胞を、形質導入効率を後に分析するためのネガテ
ィブコントロールとして役立たせるために形質導入のない培養のために取り出し
た。バルクな細胞について、１００〜２００×１０⁶の患者のＣＤ３４＋細胞の
アリコートを、遠心分離し、そして約１２０ｍｌの臨床的形質導入培地（ＶＳＮ
および臨床的ＣＤ３４＋細胞培地の比が９０：１０であり、そして最終的な臨床
形質導入培地の増殖因子含量が臨床的なＣＤ３４＋細胞形質導入培地におけるも
のと同一であることを除いて実施例Ｉに記載されるのと同様に調製した）中に再
懸濁した。各々１２０ｍｌの細胞のアリコートをフィブロネクチンフラグメント
ＣＨ−２９６コーティングした１リットルのサイズのＰＬ２４１７容器中に配置
し、そして６〜７時間インキュベートさせて、形質導入を起こさせた。この容量
をこのサイズの可撓性容器中で用いることは、わずか３〜４ｍｍの深さである液
体層を有利に生じ、これは、レトロウイルスベクターおよび細胞とＰＬ２４１７
容器の内部コーティング表面との相互作用を最大化する。形質導入の終わりに、
各バッグの内容物を取り出し、そしてプールし、遠心分離し、そして等容量の臨
床的なＣＤ３４＋細胞培地中に再懸濁した。次いで、同じ患者からの第二のアフ
ェレーシスに由来するＣＤ３４＋細胞を、１回のサイクルの形質導入を受けた第
一のアフェレーシスからの細胞とともにプールした。各々１２０ｍｌのプールし
た細胞を形質導入のために使用されたコーティングされたＰＬ２４１７バッグに
戻し、そして一晩インキュベートした。翌朝、この細胞を計数し、遠心分離し、
そして約１２０ｍｌの臨床的な形質導入培地中に１００〜２００×１０⁶細胞の
アリコートで再懸濁した。各１２０ｍｌのアリコートをフィブロネクチンフラグ
メントＣＨ−２９６コーティングしたＰＬ２４１７可撓性プラスチック製容器中
に配置し、そして初日の形質導入と同様に６〜７時間インキュベートした。さら
なる新鮮な細胞のプールへの添加がなかったことを除いて、そのプロセスを、３
日目および４日目に反復した。

【００７８】 ４回目の形質導入の最後に、その形質導入した細胞の小さなアリコートを遠心
分離し、標準的なＣＤ３４＋細胞培地中に再懸濁し、そしてさらなる培養のため
に取り出して、後の形質導入効率の分析および形質導入した患者ＣＤ３４＋幹細
胞からの培養物中において分化した好中球の機能的修正の評価を可能にする。バ
ルクな形質導入自己系ＣＤ３４＋幹細胞を、１％ ＨＳＡを含有するＰｌａｓｍ
ａｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ、Ｈｙｌａｎｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）中で数回洗
浄し、そして６０ｍｌの滅菌シリンジ中の約５０ｍｌのこの液体中に再懸濁した
。滅菌性を確認するための安全性試験の後、この細胞を、各患者へと静脈投与し
た。

【００７９】 上記実施例Ｉにおけるように、組換えｇｐ９１^phoxによる表面発現のフローサ
イトメトリーにより決定されるような形質導入効率を、最後の形質導入の２〜３
日後に決定した。分析を、遺伝子治療処置として患者に投与された細胞のバルク
から培養物中にとっておいた形質導入ＣＤ３４＋細胞の小さなアリコートにおい
て行った。これを、形質導入手順を受けることなく培養にとっておいた同じ患者
の細胞のサンプルに対して比較した。わずかにより複雑なフローサイトメトリー
分析を、表現型始原幹細胞の形質導入の効率を評価するために行った。高レベル
の表面ＣＤ３４抗原および低レベルのＣＤ３８抗原を発現する細胞の群は、コロ
ニー形成細胞および始原幹細胞のバルクを含有することが知られている。

【００８０】 形質導入されたまたは形質導入されない患者ＣＤ３４＋細胞を、ＣＤ３４抗原
、ＣＤ３８抗原およびｇｐ９１^phox（これらの各々は異なる蛍光プローブを伴う
）に対する抗体で標識することにより、「３色」フローサイトメトリー分析を行
うことが可能である。ここでは、ｇｐ９１^phoxタンパク質を発現する始原細胞（
ＣＤ３４明、ＣＤ３８暗）のパーセントが評価され得る。この分析を、患者番号
１に対して図３に、患者番号２に対して図４に、そして患者番号３に対して図５
に示す。各図について、４つのドットプロットパネルを示す。各場合において、
左の２つのパネルは、形質転換されていない細胞であり、右の２つのパネルは、
臨床的に調製された形質導入細胞である。上方のパネルにおいて、分析は、ＣＤ
３８（縦軸）およびＣＤ３４（これらの細胞を横軸に表現）を示す。細胞のクラ
スターの右下の角に見られる小さい四角形中の細胞は、ｇｐ９１^phoxタンパク質
発現について分析された表現型始原細胞である。始原細胞のこの選択された群の
この分析を、下方のパネル中に示す。下方のパネル中のドットプロットは、横軸
のｇｐ９１^phox発現に対する縦軸の細胞サイズ（側方散乱）をプロットする。下
方のパネル中の縦線の右側に対する細胞は、ｇｐ９１^phox陽性と定義される。形
質導入されていない集団において、この線は、約１．２％陽性のバックグラウン
ドを可能にするように設定される。

【００８１】 この分析により、患者番号１からの細胞の形質導入は、８２．９％であり（バ
ックグラウンド差し引き後）；患者番号２からは８０．３％であり；そして患者
番号３からは６２．０％であった。これらの臨床スケールでの形質導入率は、Ｍ
ａｌｅｃｈら（１９９７）、前出により報告されるよりも少なくとも３〜５倍高
く、そしてまた臨床設定におけるヒトＣＤ３４＋細胞の形質導入によって報告さ
れた経験のいずれよりも何倍も高い。さらに、ＣＤ３４＋細胞は、臨床スケール
の形質導入レジメの４日目よりも、平均して３．５倍高い増大があった。これに
より、ＣＤ３４＋細胞の最終収量は、９２％を上回る生存度で１〜２×１０⁹細
胞であった。さらに、細胞産物は、患者によって十分に耐性であり、そして全て
のＦＤＡによる安全性試験を通過した。これらのデータは、フィブロネクチンフ
ラグメントＣＨ−２９６被覆ＰＬ２４１７可撓性プラスチック容器が、エクスビ
ボ遺伝子療法の臨床設定において、表現型始原幹細胞の並外れて高い形質導入率
を達成し、一方、同時にこれらの細胞の増殖および生存を助長し、そして患者の
処置のための静脈投与に適した細胞組成物を生じるために使用され得ることを示
す。

【００８２】 予備結果が、利用可能である。これは、ＣＧＤ患者においてこれらのトランス
フェクト細胞の移植を示す。特に、図６において、患者番号２におけるこれらの
形質導入細胞の静脈投与２５日後に、機能的に正常なオキシダーゼ陽性好中球が
、末梢血中で検出され得ることが示される。図６は、ジヒドロローダミン１２３
（ＤＨＲ）フローサイトメトリーアッセイを用いてこの患者由来の末梢血好中球
による過酸化水素生成の分析である。このアッセイの詳細は、Ｍａｌｅｃｈ、Ｈ
Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１２１３３−
１２１３８、１９９７において詳細に記載または言及されている。簡潔には、末
梢血を採血し、赤血球を溶解して血液白血球を得、次いで、ＤＨＲエステルを用
いて５分間ロードする。ＤＨＲは脱エステル化され、従って好中球中に捕獲され
た。次いで、ホルボールミリステートアセテートへの曝露により好中球を刺激し
、過酸化水素を生成した。酸化剤が生成されれば、ＤＨＲが酸化され、その蛍光
の上昇を生じる。ＣＧＤオキシダーゼ陰性好中球は、低い蛍光を示すが、正常な
オキシダーゼ陽性好中球は、このアッセイにおいて高い蛍光を示す。遺伝子療法
後のＣＧＤ患者における小数の高蛍光好中球の出現は、患者の骨髄中に移植され
た、遺伝子補正されたＣＤ３４＋細胞に由来する機能的に正常な好中球の生成の
証拠である。

【００８３】 図６の３つのパネルは、好中球の大きさ特徴を有する細胞（縦軸上に側方分散
）が酸化剤生成（横軸のＤＨＲ蛍光）について分析されるドットブロットを示す
。上方のパネルが、正常なボランティアの末梢血からの好中球を示し、ここでは
ほとんど全ての好中球が非常に蛍光性である（例えば、陽性を規定する縦線のは
るか右側）。中央のパネルは、遺伝子療法前の患者番号２由来の末梢血好中球の
この分析を示す。ここで、全ての細胞が、オキシダーゼ活性の欠失を示す低い蛍
光を示す。形質導入ＣＤ３４＋細胞の投与２５日後に、その患者の末梢血好中球
ほぼ１０００のうち１つが、正常細胞に等しい高い蛍光を示す。このことは、こ
れらの遺伝子療法補正好中球における高いオキシダーゼ活性を示す。従って、Ｃ
Ｄ３４＋細胞のエクスビボでの形質導入の増強のためのフィブロネクチンフラグ
メントＣＨ−２９６被覆ＰＬ２４１７バッグの使用は、処置された患者の末梢血
への移植が可能であり、かつ機能的に補正された好中球の生成の媒介が可能であ
る細胞組成物を生じた。

【００８４】 本発明はいまや、その特定の好ましい実施態様を参照して詳細に記載されてい
るが、改変および変更は、記載され、そして請求される本発明の精神および範囲
内であることが理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、可撓性培養容器１４の平面図１０（上）および側面図１２（下）（尺
度を合わせて画かれていない）を示し、この容器１４は、本実施例において、チ
ュービング１８に接続している２つのポート１６を有し、内部表面２０を横切る
液体培地のゆっくりとした連続的な流れを可能にして、細胞および／またはウイ
ルスベクターとその表面との相互作用を可能にする。

【図２】 図２は、図１の可撓性培養容器１４の側面図１２（尺度を合わせて画かれてい
ない）の高倍率の模式図を示し、これは、標的哺乳動物細胞およびウイルスベク
ターの両方が、このガス透過性可撓性プラスチック培養容器の内部表面２０に示
される化学部分に、どのように結合するかを示す。

【図３】 図３は、「３色」フローサイトメトリー分析の結果を示す。ここで、患者＃１
についてのｇｐ９１^phoxタンパク質を発現する初代細胞（ＣＤ３４（明）、ＣＤ
３８（暗））の％を、実施例ＩＩに記載のように評価した。

【図４】 図４は、「３色」フローサイトメトリー分析の結果を示す。ここで、患者＃２
についてのｇｐ９１^phoxタンパク質を発現する初代細胞（ＣＤ３４（明）、ＣＤ
３８（暗））の％を、実施例ＩＩに記載のように評価した。

【図５】 図５は、「３色」フローサイトメトリー分析の結果を示す。ここで、患者＃３
についてのｇｐ９１^phoxタンパク質を発現する初代細胞（ＣＤ３４（明）、ＣＤ
３８（暗））の％を、実施例ＩＩに記載のように評価した。

【図６】 図６は、実施例ＩＩに記載のように、ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）フ
ローサイトメトリーアッセイを使用した、患者＃２由来の末梢血好中球による過
酸化水素生成の分析を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/02 Ａ６１Ｐ 7/06 7/06 9/00 9/00 17/06 17/06 21/04 21/04 29/00 １０１ 29/00 １０１ 31/12 31/12 35/00 35/00 37/02 37/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA13 BA03 CA53 DC50 NA14 ZA362 ZA542 ZA552 ZA892 ZA942 ZB072 ZB152 ZB262 ZB332 ZC332 ZC352 4C087 AA01 BC83 NA14 ZA36 ZA54 ZA55 ZA89 ZA94 ZB07 ZB15 ZB26 ZB33 ZC33 ZC35

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞を形質導入する方法であって、以下： その中に細胞を有する可撓性閉鎖培養容器を提供する工程；および 該細胞を、多機能性化学部分の存在下でウイルスベクターと接触させる工程、
   を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記多機能性化学部分が、ウイルス結合ドメインに連結され
   た細胞表面結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記連結が、前記可撓性閉鎖培養容器の表面によって提供さ
   れる、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記細胞表面結合ドメインが、フィブロネクチン、コラーゲ
   ン、ビトロネクチン、トロンボスポンジンおよびラミニンの細胞表面結合フラグ
   メントからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 フィブロネクチンの前記細胞表面結合フラグメントが、ＣＢ
   ＤおよびＣＳ−１からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記ウイルス結合ドメインが、フィブロネクチンのウイルス
   結合フラグメント、ウイルスレセプター、およびｅｎｖ遺伝子産物に対する抗体
   からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
7. 【請求項７】 フィブロネクチンの前記ウイルス結合フラグメントが、ヘパ
   リン結合ドメイン（ＩＩＩ_12-14）である、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記多機能性化学部分が、フィブロネクチンまたはその多機
   能性フラグメントである、請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記多機能性フラグメントが、ＣＨ−２９６、Ｈ−２９６お
   よびＣＨ−２７１からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記ウイルスベクターが、単純ヘルペスウイルスベクター
    、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベク
    ター、およびレトロウイルスベクターからなる群より選択される、請求項１に記
    載の方法。
11. 【請求項１１】 前記ウイルスベクターが、偽型ウイルスとしてパッケージ
    ングされる、請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである
    、請求項１０に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記レトロウイルスベクターが、ＭＦＧＳである、請求項
    １２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記細胞が、造血細胞である、請求項１に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記造血細胞が、ＣＤ３４＋幹細胞である、請求項１４に
    記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記細胞が、リンパ球、樹状細胞、または単球である、請
    求項１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記接触工程が、ポリカチオンの存在下で生じる、請求項
    １に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記ポリカチオンが、プロタミンである、請求項１７に記
    載の方法
19. 【請求項１９】 前記接触工程が、血清および動物タンパク質の非存在下で
    生じる、請求項１に記載の方法。
20. 【請求項２０】 細胞を形質導入するための容器システムであって、可撓性
    閉鎖培養容器およびその中に多機能性化学部分を含む、容器システム。
21. 【請求項２１】 前記多機能性化学部分が、ウイルス結合ドメインに連結さ
    れた細胞表面結合ドメインを含む、請求項２０の記載のシステム。
22. 【請求項２２】 前記連結が、前記可撓性閉鎖培養容器の表面によって提供
    される、請求項２１に記載のシステム。
23. 【請求項２３】 前記多機能性化学部分が、フィブロネクチンまたはその多
    機能性フラグメントである、請求項２０に記載のシステム。
24. 【請求項２４】 機能性タンパク質をそれが必要な被験体に送達する方法で
    あって、以下： 請求項１に記載の方法によって細胞を形質導入する工程；および 該細胞をそれが必要な被験体に導入する工程、 を包含する、方法。
25. 【請求項２５】 前記被験体が、遺伝子欠損、免疫障害、造血障害、新形成
    、および感染性疾患からなる群より選択される病理学を有する、請求項２４に記
    載の方法。
26. 【請求項２６】 前記病理学が、慢性肉芽腫症である、請求項２５に記載の
    方法。