JPWO2009119793A1 - 遺伝子導入細胞の製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明により、（１）フィブロネクチンまたはそのフラグメントおよびＣＤ３リガンドを含む容器内でＴ細胞および／またはＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養する工程、および（２）所望の遺伝子を保持するベクターを工程（１）の容器に添加する工程、を包含することを特徴とする、所望の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法が提供される。前記両工程を同一容器で実施することにより、高効率での遺伝子導入が達成される。

Description

本発明は、医療分野において有用な、所望の遺伝子が導入されたＴ細胞を含有する細胞集団を製造する方法に関する。

生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。

Ｔ細胞は、末梢ではＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを有するＣＤ４Ｔ細胞またはＣＤ８マーカーを有するＣＤ８Ｔ細胞が大部分を占める。ＣＤ４Ｔ細胞の大部分は、ヘルパーＴ細胞（以下、Ｔ_Ｈと記載する）と呼ばれ、抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与し、抗原刺激によりそれぞれ異なる種類のサイトカインを産生するＴｈ１型あるいはＴｈ２型に分化する。ＣＤ８Ｔ細胞の大部分は、抗原刺激により、細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞［Ｔｃ：細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、別名：キラーＴ細胞、以下、ＣＴＬと記載することがある］に分化する。

外科手術、化学療法、放射線療法に次ぐ第４のがんの治療法として、免疫療法が近年関心を集めている。免疫療法は本来ヒトが有する免疫力を利用するため、患者への肉体的負担が他の治療法と比べて軽いと言われている。免疫療法には体外で誘導したＣＴＬや末梢血リンパ球等から種々の方法で拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞などを移入する療法、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法、Ｔｈ１細胞療法、さらにこれら細胞に種々の効果を期待できる遺伝子を体外で導入して体内に移入する免疫遺伝子治療法などが知られている。

細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）には、主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ；以下、ＭＨＣと略す）によってコードされる主要組織適合遺伝子複合体分子（ＭＨＣ分子、ヒトの場合、ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎと呼ばれ、以下、ＨＬＡと略す）と抗原ペプチドとの結合物である複合体を特異的なＴ細胞レセプター（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、ＴＣＲと略す）によって認識し、その複合体を細胞表面に提示している細胞を傷害することのできるものがある。

目的の抗原を認識するＴＣＲ遺伝子を、ＣＴＬをはじめとするＴ細胞に導入することにより、目的の抗原に特異的な細胞傷害活性を付与することが期待できる。これに基づき、ＭＡＲＴ１（非特許文献１）、ｇｐ１００（非特許文献２）およびｍＨＡＧ ＨＡ−２抗原（非特許文献３）など、様々な抗原を標的としたＴＣＲ遺伝子による遺伝子治療が試みられている。さらに、Ｔ細胞に導入するレセプターとして、ヒト由来のＴＣＲ、ヒト以外の生物由来のＴＣＲ、目的の抗原を認識する抗体の抗原認識部位、ＴＣＲと会合して抗原認識複合体を形成する分子群（例えばＣＤ３）、Ｔ細胞表面抗原（例えばＣＤ８、ＣＤ２８）、およびこれらの一部を組み合わせたキメラレセプターをコードする遺伝子による遺伝子治療が試みられている。

フィブロネクチンは動物の血液中、細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。体外で誘導したＣＴＬや末梢血リンパ球等からＩＬ−２および抗ＣＤ３抗体の作用により拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞を移入する免疫療法において、体外で誘導した抗原特異的ＣＴＬを拡大培養する際に細胞傷害活性をいかに維持するか、リンパ球を体外でいかに効率よく拡大培養できるか等の問題について、フィブロネクチンまたはそのフラグメントを使用することによる効果が検討されてきた（例えば、特許文献１〜３）。

近年、免疫療法では、すでに終末分化したエフェクターＴ細胞よりも、より未分化な状態のナイーブＴ細胞やセントラルメモリーＴ細胞を生体に投与した方がはるかに高い治療効果が期待できると報告されている（例えば非特許文献４、５）。さらに、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法などは、例えば体内にＣＴＬの前駆体となるナイーブＴ細胞が少ないと考えられるがんが進行した患者では充分な効果が期待できないことが多い。
国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット 国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット 国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１６３巻、第５０７−５１３頁（１９９９） ジャーナル オブ イムノロジー、第１７０巻、第２１８６−２１９４頁（２００３） ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０３巻、第３５３０−３５４０頁（２００３） ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．）、第１１５巻、第１６１６−１６２６頁（２００５） ジャーナル オブ イムノロジー、第１７５巻、第７３９−７４８頁（２００５）

本発明の目的は、細胞医療による疾患の治療に有用な、所望の遺伝子が導入された細胞集団を簡便に製造する方法、並びにより高効率で所望の遺伝子が導入された細胞集団を製造する方法を提供することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、フィブロネクチンまたはそのフラグメントおよびＣＤ３リガンドを含む容器内で培養した細胞集団に対して、同一容器内で所望の遺伝子を保持するベクターを導入する操作を行った場合には、従来に比べて遺伝子導入効率が向上することを見出し、本発明を完成させた。

すなわち本発明は、
［１］下記工程を包含することを特徴とする、所望の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法；
（１）フィブロネクチンまたはそのフラグメントおよびＣＤ３リガンドを含む容器内でＴ細胞および／またはＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養する工程、および
（２）所望の遺伝子を保持するベクターを工程（１）の容器に添加する工程、
［２］工程（２）において、ベクターがレトロウイルスベクターである［１］の方法、
［３］工程（２）において、ベクターの添加後にベクターと細胞の接触頻度を物理的に高める操作が実施される［１］の方法、
［４］遠心力の付加または容器の内容物の撹拌によりベクターと細胞の接触頻度を物理的に高める［３］の方法、
［５］工程（２）で得られた遺伝子導入された細胞集団を培養する工程をさらに包含する、［１］の方法、
［６］工程（２）で得られた遺伝子導入された細胞集団より任意の亜細胞集団を分離する工程をさらに包含する［１］の方法、
［７］［１］〜［６］いずれかの方法により得られる、所望の遺伝子が導入された細胞集団、
［８］［１］〜［６］いずれかの方法により得られる、所望の遺伝子が導入された細胞集団を有効成分として含有する医薬、
［９］被験体に、［１］〜［６］いずれかの方法により得られる、所望の遺伝子が導入された細胞集団を有効量投与する工程を含む疾患の治療方法または予防方法、および
［１０］医薬の製造のための、［１］〜［６］いずれかの方法により得られる、所望の遺伝子が導入された細胞集団の使用、
に関する。

本発明の製造方法により、所望の遺伝子が導入された細胞を高い比率で含有する集団が提供される。当該製造方法により得られる細胞集団は、細胞医療による疾患の治療に極めて有用である。

ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子導入の効率を示す図である。 ＡｃＧＦＰ遺伝子導入の効率を示す図である。

本発明において、「Ｔ細胞」とは、Ｔリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球のうち胸腺に由来する細胞を意味する。Ｔ細胞には、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、キラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、α鎖およびβ鎖からなるＴＣＲを発現するαβＴ細胞、γ鎖およびδ鎖からなるＴＣＲを発現するγδＴ細胞が含まれる。また、Ｔ細胞に分化する能力を有する「Ｔ細胞の前駆細胞」も本発明に使用することができる。「Ｔ細胞および／またはＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団」としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球等が例示される。また、Ｔ細胞を含有する血球系細胞由来の種々の細胞集団を本発明に使用できる。これらの細胞はＩＬ−２などのサイトカインにより生体内（イン・ビボ）または生体外（エクス・ビボ）にて活性化されていても良い。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたもの、例えば本発明の方法により得られたＴ細胞集団をそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。また、例えば生体から得られた上記のＴ細胞集団の製造に使用される細胞から種々の誘導操作や分離操作を経て得られた細胞集団、例えば、ＰＢＭＣ等の細胞をＣＤ８^＋もしくはＣＤ４^＋細胞に分離して得られたいずれかの細胞集団を使用することもできる。なお、本発明の細胞集団の製造方法では、前記細胞を含有する材料、例えば、末梢血液、臍帯血等の血液や、血液から赤血球または血漿等の成分を除去したもの、骨髄液等を使用することができる。

本発明において、「フィブロネクチン」およびそのフラグメントは、天然から得られたもの、または人為的に合成されたもの、すなわち非天然のもののいずれでもよい。フィブロネクチンおよびそのフラグメントは、例えば、ルオスラーティ Ｅ．ら〔Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２５６巻、第１４号、第７２７７〜７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。ここで、本明細書に記載された実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントとは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。上記のフィブロネクチンおよびそのフラグメントは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して本発明に使用することができる。さらに、フィブロネクチンフラグメントは単一の分子を使用してもよく、構造の異なる複数のフラグメントを組み合わせて使用してもよい。

なお、フィブロネクチンは多くのスプライシングバリアントの存在が知られているが、本発明に使用されるフィブロネクチンは、本発明の所望の効果を発現するものであれば、いずれのバリアントであってもよい。例えば、血漿由来のフィブロネクチンの場合、細胞結合ドメインの上流に存在するＥＤ−Ｂと呼ばれる領域、細胞結合ドメインとヘパリン結合ドメインとの間に存在するＥＤ−Ａと呼ばれる領域が欠失していることが知られているが、このような血漿由来のフィブロネクチンも本発明に使用することができる。

本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメント、ならびに該フラグメントの調製に関する有用な情報は、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、第２８４〜２９１頁（１９９１）、ＥＭＢＯ ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、第４巻、第７号、第１７５５〜１７５９頁（１９８５）、およびバイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、第４９３６〜４９４１頁（１９８６）等より得ることができる。また、フィブロネクチンをコードする核酸配列およびフィブロネクチンのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７にて開示されている。

フィブロネクチンのドメイン構造は７つに分けられており、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれている。これらの各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列はＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型と呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型は７１〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７〜４０％である。フィブロネクチン中には１４個のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０と称する）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５アミノ酸からなるＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する。本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメントは、ＩＩＩ−７、８、９、１１、１２、１３、ＣＳ−１のいずれかのドメインを含むフラグメントであればよく、さらに複数のドメインが繰り返し連結されたフラグメントであってもよい。例えば、ＶＬＡ−５へのリガンドを含む細胞接着ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、ＶＬＡ−４へのリガンドであるＣＳ−１ドメイン等を含有するフラグメントが本発明に使用される。前記フラグメントとしては、例えば前記のＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１１０巻、２８４〜２９１頁（１９９１）に記載されたＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、ならびにこれらの誘導体や改変物が例示される。前記のＣＨ−２９６はレトロネクチン（登録商標）の名称で市販されている。

以下、本発明を具体的に説明する。
１．本発明の製造方法
本発明は、以下の工程を包含する、所望の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法に関する：
（１）フィブロネクチンまたはそのフラグメントおよびＣＤ３リガンドを含む容器内でＴ細胞を含有する細胞集団を培養する工程、および
（２）所望の遺伝子を保持するベクターを工程（１）の容器に添加する工程。
なお、本願明細書では前記の（１）の工程を第１の工程、（２）の工程を第２の工程、と記載することがある。

本発明の方法により製造される細胞集団は、所望の遺伝子が導入されたＴ細胞を含む細胞集団である。導入される所望の遺伝子に特に限定は無く、遺伝子を導入する目的に応じて適宜選択すればよい。特に限定はされないが、酵素、抗体、構造タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、毒素、蛍光タンパク質等のポリペプチドをコードする遺伝子、アンチセンス核酸またはＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡをコードする遺伝子等を本発明の方法で導入することができる。本発明の一態様として、所望の抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子が例示される。

前記の「所望の抗原を認識するレセプター」は、目的の抗原を特異的に認識するタンパク質を意味する。所望の抗原を認識するレセプターとしては、ヒト由来のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）、ヒト以外の生物由来のＴＣＲ等が例示される。ＴＣＲとしては、α鎖およびβ鎖からなるヘテロダイマー、γ鎖およびδ鎖からなるヘテロダイマーが知られているが、本発明においていずれも好適に使用できる。さらに、これらのＴＣＲの抗原認識部位または所望の抗原を認識する抗体の抗原認識部位と、ＴＣＲと会合して抗原認識複合体を形成する分子群（例えば、ＣＤ３ζ）、Ｔ細胞表面抗原（例えば、ＣＤ８、ＣＤ２８）、およびこれらの一部から選択される１つ以上のコンポーネントとを組み合わせたキメラレセプター（リコンビナントＴＣＲ）も、所望の抗原を認識するレセプターとして好適に使用できる。当該レセプターは、１つの分子から構成されるレセプター、複数の分子から構成されるホモダイマー、ヘテロダイマーのレセプターであっても良い。１つの分子から構成されるレセプターとして、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）の抗原認識部位を有するレセプターも好適に使用できる。特に限定はされないが、所望の抗原を認識するレセプターは、所望の抗原を認識する細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナルを伝達する細胞内ドメインから構成され、さらに、ヒンジまたはリンカードメインを含んでいてもよい。本発明において、所望の抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子は外来遺伝子であり、前記遺伝子が導入されるＴ細胞において本来存在もしくは発現していない遺伝子である。すなわち、「所望の抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子」とは本発明に使用されるＴ細胞に人為的に導入される遺伝子のことを意味し、前記のＴ細胞と同種または異種由来のものも包含される。前記のレセプター遺伝子が導入されたＴ細胞を含む細胞集団は、所望の抗原を認識するＴ細胞を含有している細胞集団である。当該細胞集団は、レセプターをコードする遺伝子が導入されていない細胞集団と比較して、所望の抗原に対する特異性の高い細胞集団であり、所望の抗原の刺激を受けた際に素早く反応することができる。さらに、本発明の製造方法の工程に、所望の抗原、公知のタンパク質、サイトカイン類、ケモカインまたはその他の成分を加えてもよく、また、分離もしくは単離工程を加えて、細胞集団を誘導、培養もしくは単離することができ、さらにこれらの細胞を含有する細胞集団を製造する方法も本発明の方法に含まれる。

本発明の細胞集団の製造方法において、好適には総培養日数を４〜１４日間とすることが好ましい。なお、「総培養日数とは前記の（１）および（２）の工程、ならびにこれら両工程に加えて、例えば細胞数の増加を目的として実施される培養の工程を含めた期間である。総培養日数が４〜１４日間である場合、得られる細胞集団は、細胞増殖率が向上し、ナイーブＴ様細胞の比率が増加し、ＩＦＮ−γ産生量が向上した細胞集団であり、細胞医療分野への使用に極めて適している。なお、総培養日数が４日未満の場合は、一般的な免疫療法での使用に十分な細胞数を得ることができない。本発明において、総培養日数は、より好適には５〜１４日間、さらに好適には７〜１４日間であることが好ましい。

本発明の細胞集団の製造方法において、第１の工程は、Ｔ細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンまたはそのフラグメントおよびＣＤ３リガンドを含有する容器中で培養する工程である。本工程は、培養開始時から少なくとも１日以上、より好ましくは２〜７日、さらに好ましくは２〜５日実施される。なお、本発明において前記の有効成分の存在下での培養は、この第１の工程のみに限定されるものではなく、必要に応じ、所望の遺伝子が導入された細胞について実施してもよい。

本発明において、フィブロネクチン、そのフラグメント、またはそれらの混合物の培養中の濃度としては、特に限定はなく、例えば０．００１〜５００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜５００μｇ／ｍＬが好適である。

本発明において、ＣＤ３リガンドは、ＣＤ３に結合活性を有する物質であれば特に限定はないが、例えば抗ＣＤ３抗体であってもよく、特に好適には抗ＣＤ３モノクローナル抗体が挙げられ、例えばＯＫＴ３［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２０６巻、第３４７−３４９頁（１９７９）］が例示される。ＣＤ３リガンドの培地中の濃度に特に限定はないが、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用する場合、例えば０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬであることが好適である。

また、本発明においては、必要に応じて、ＣＤ２８リガンド等のその他の副刺激因子を添加して、細胞に副刺激を与えることもできる。副刺激因子としては、所望の抗原、ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ（ＧＩＴＲＬ）、抗ＣＤ２８抗体、ＣＤ８０、Ｂ７−１、Ｂ７−２等が例示される。

本発明の細胞集団の製造方法において使用される培地は、前記の有効成分を含有していれば特に限定はなく、Ｔ細胞の拡大培養に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができる。例えば、市販の培地を適宜選択して使用することができる。これらの培地はその本来の構成成分以外に、サイトカイン類、適当なタンパク質、その他の成分を含んでいてもよい。サイトカイン類としては、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ等が例示される。好適には、ＩＬ−２を含有する培地が使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度に特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０^５Ｕ／ｍＬ、より好適には１〜１×１０^４Ｕ／ｍＬであってもよい。また、適当なタンパク質としては、例えば抗ＩＬ−４抗体が例示される。また、これらのほかに、レクチン等のリンパ球刺激因子を添加することもできる。さらに、γδＴ細胞活性化因子を添加して、所望の遺伝子を導入する細胞を導入前に活性化してもよいが、導入後に活性化してもよい。前記γδＴ細胞活性化因子は、γδＴ細胞の活性化作用、増殖促進作用を有するものであれば特に限定はされないが、例えば、パミドロネート、ゾレドロネートなどのビスホスフォン酸系の化合物、イソペンテニルピロリン酸、２−メチル−３−ブテニル−１−ピロリン酸などのピロリン酸モノエステル系化合物、ホスホハロヒドリン類、ホスホエポキシド類等であってもよい。当該成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。

さらに、培地中に血清または血漿を添加してもよい。これらの培地中への添加量に特に限定はないが、０容量％〜２０容量％が例示され、また培養段階に応じて使用する血清または血漿の量を変更することができる。例えば、血清または血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清または血漿の由来は、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、安全性の観点から自己由来のものが好適に使用される。

本発明において使用される培養開始時の細胞数に特に限定はないが、例えば好適には１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１０^２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１０^３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってもよい。また、培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃かつ５％ＣＯ_２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液を新鮮な培地を加えて希釈するか、培地を交換するか、もしくは細胞培養用器材を交換することができる。

本発明の細胞集団の製造方法において使用される細胞培養用器材に特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ_２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量の細胞集団を製造する場合、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれにおいても実施することができるが、得られる細胞集団の安全性の観点から、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。

なお、フィブロネクチンもしくはそのフラグメントおよびＣＤ３リガンド、その他の副刺激因子、上記培地中に含まれる適当なタンパク質、サイトカイン類、またはその他の成分は培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材料は、細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。前記の各種成分を培養用器材または細胞培養用担体に固定化する場合、好適には、培養時の使用培地量に対する当該成分の量の割合が前記成分を培地中に溶解して用いる際の濃度と同様の割合となるように調整されるが、所望の効果が得られればこの割合に限定されるものではない。

フィブロネクチンもしくはそのフラグメント、ＣＤ３リガンド、またはその他の成分の固相への固定化方法としては、特に限定はないが、例えば、適当な緩衝液の中でこれらの物質を固相と接触させることにより固定化することができる。

また、フィブロネクチンのフラグメントの固相への固定化については、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載の方法によっても固定化を実施することができる。

前記の種々の成分または本発明にて使用される有効成分を固相に固定化する場合、本発明の方法によりＴ細胞集団を培養した後で、該Ｔ細胞集団と固相とを分離するだけで前記の有効成分等を除去することができ、該Ｔ細胞集団への有効成分等の混入を防ぐことができる。

本発明の細胞集団の製造方法において、第２の工程は、第１の工程を実施している容器に所望の遺伝子を保持するベクターを添加し、当該遺伝子を細胞に導入する工程である。すなわち、第１の工程および第２の工程は容器を交換することなく、同一の容器内で実施される。ベクターの添加は１回に限定されるものではなく、第２の工程のうちで複数回ベクターを添加してもよい。ベクターの添加は、容器中の培養液にベクターを含有する溶液を添加する、ベクターを含有する培地で容器中の培地を交換する等、適切な方法で実施すればよい。

なお、細胞に導入する所望の遺伝子の数に限定はなく、１個の遺伝子であっても良く、数個の遺伝子を含む複数の遺伝子であっても良い。例えば、導入する細胞に応じてＴ細胞表面抗原をコードする遺伝子などの適当な遺伝子を、同時に、前もって、もしくは後で導入することができる。例えば、γδＴ細胞にαβＴＣＲ遺伝子を導入する場合、当該遺伝子に加えてＣＤ８をコードする遺伝子を導入することが好ましい。

本発明において、所望の遺伝子を保持するベクターに特に限定はなく、公知のベクターから適切なものを選択して使用することができる。例えば、ウイルスベクターを使用する方法、非ウイルスベクターを使用する方法のいずれを本発明にて使用してもよい。それらの方法の詳細について、すでに多くの文献が公表されている。

前記ウイルスベクターに特に限定はなく、遺伝子導入方法に通常使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクター等が使用される。特に好適には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際にレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）などの遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。

非ウイルスベクターとして、本発明を限定するものではないが、例えば、プラスミドベクターを使用し、これをリポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用して導入する方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、またはパーティクルガン法などで導入する方法を使用することができる。

本発明において、所望の遺伝子は、フィブロネクチンまたはそのフラグメントおよびＣＤ３リガンドの存在下で細胞に導入される。本発明に使用されるフィブロネクチンまたはそのフラグメントは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターによる遺伝子導入効率を向上させる作用を有している。また、レトロウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に、該ベクター中の外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂または増殖中の細胞に感染しうることから、本発明における製造の工程において遺伝子導入を行うのに特に好適である。

所望の遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下で発現されるようにベクターまたはプラスミド等に挿入して使用することができる。また、遺伝子の効率のよい転写を達成するために、プロモーターまたは転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列および／またはターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、相同組換えにより導入対象のＴ細胞の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に前記の遺伝子を配置してもよい。

第２の工程は、第１の工程の開始から一定期間経過後に実施してもよいが、第１の工程の開始と同時に実施してもよい。後者の場合、フィブロネクチンまたはそのフラグメントおよびＣＤ３リガンドを含む容器に、Ｔ細胞を含有する細胞集団および所望の遺伝子を保持するベクターが同時に添加される。本発明を特に限定するものではないが、本発明の好適な態様において、少なくとも１日以上、より好ましくは１〜７日、さらに好ましくは２〜５日第１の工程を実施した後で、第２の工程が実施される。第２の工程は、特に本発明を限定するものではないが、通常１〜３日、好ましくは１〜２日実施される。

さらに、第２の工程にて、細胞とウイルスの接触頻度の向上を目的として、ベクターの添加後にベクターと細胞の接触頻度を物理的に高めるような操作を実施してもよい。例えば、容器に遠心力を付加することにより容器底面に細胞およびベクターを移動せしめたり、容器の内容物を撹拌することによってベクターと細胞の接触頻度を高めることができる。内容物の撹拌は、好適には、容器を振動させるかあるいは揺らすことで実施できる。本操作により、細胞への遺伝子導入効率はさらに向上する。好適な態様として、ベクターの添加された容器への遠心力の付加が例示される。付加する遠心力は、細胞が過度のダメージを受けず、かつ遺伝子導入効率が向上する範囲であれば特に限定はないが、通常２５０〜２０００×ｇ、好適には５００〜１５００×ｇである。また、遠心力を付加する時間は、３〜１２０分、特に５〜６０分が好適である。

本発明の方法は、遺伝子導入が望まれるＴ細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンまたはそのフラグメントおよびＣＤ３リガンドを含む容器内で培養し、次いで同一の容器内で前記細胞集団への遺伝子導入を実施することを特徴とする。従来、適切な刺激因子の存在下で細胞の前培養を実施した後で、細胞を他の容器に移して遺伝子導入が実施されてきた。本発明により、移送による細胞の逸失や不必要な刺激を避けることができ、かつ遺伝子導入の効率を向上させることができる。特に、細胞培養用バッグのような閉鎖系の培養容器を使用する遺伝子導入に本発明の方法は好適である。

本発明の細胞集団の製造方法は、第３の工程として、第２の工程で得られた遺伝子導入細胞を培養する工程をさらに包含してもよい。すなわち、第２の工程終了後にベクターを除去し（例えば、ベクターを含有しない培地に交換し）、細胞の培養を継続することができる。

前記の工程は、通常の細胞培養の方法、例えば公知のＴ細胞の培養方法により実施すればよい。前記の第１の工程と同一の条件、あるいは前記方法にて有効成分として使用するフィブロネクチンまたはそのフラグメントおよびＣＤ３リガンドの使用を除いて第１の工程で使用するものと同様の条件で細胞の培養を行ってもよい。

さらに、本発明の製造方法は、各工程の前または後に、細胞集団を任意の亜細胞集団に分離する工程を包含することもできる。たとえば、前述のとおり本発明の有効成分の存在下で培養して得られた細胞集団には高比率にナイーブＴ様細胞が含有されている。そのため、所望の表面抗原マーカーを発現する細胞をさらに分離、取得することにより、ナイーブＴ様細胞もしくはナイーブＴ様細胞をさらに高含有するＴ細胞集団を取得することができる。また、本発明の製造方法の第２の工程の後で、所望の遺伝子を発現する細胞を分離、取得してもよい。分離操作としては、特に限定はないが、例えばセルソーター、磁気ビーズ、カラム等を用いて公知の手法で分離することが出来る。また、適切な手段がある場合、レセプター遺伝子が導入された細胞からなる亜細胞集団を選択してもよい。

また、本発明の方法により製造された細胞集団からＴ細胞をクローン化することにより、安定したＴ細胞として維持することもできる。また、本発明の方法により得られた細胞集団を用いて、さらに本発明の方法または公知の方法により培養することで新たに細胞集団を得ることもできる。

本発明の方法により得られる細胞集団は、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２ＬもしくはＣＣＲ７を発現する細胞、すなわち未分化なＴ細胞であるナイーブＴ様細胞を高比率に含有している。当該細胞集団の細胞傷害活性は公知のイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での試験により評価することもできるが、本発明により得られるＴ細胞集団は前述のとおり未分化なナイーブＴ様細胞を高比率に含むことから、本発明の製造方法により得られる細胞集団はこのような評価系において必ずしも高い細胞傷害活性を示すものではない。

さらに、本発明の方法により得られる細胞集団は、従来の方法で作製される細胞集団と比較して、移殖された生体内での生存性に優れ、同種または異種の抗原に対する生体内での高い活性を保持している。したがって、本発明の方法は、フィブロネクチンまたはそのフラグメントによる刺激および所望の遺伝子の導入工程を含む、養子免疫療法のための新規のＴ細胞拡大培養方法であり、本発明の方法により得られる遺伝子導入Ｔ細胞は、生体内へ有効に移植され保持される。すなわち、本発明の方法は、移植された生体内で、長期に渡り、高濃度にて持続可能で、より有用な細胞医療用の細胞集団の提供を可能とし、Ｔ細胞に基づく全ての遺伝子治療方法に広く適用することが可能である。

２．本発明の細胞集団、医薬、治療方法または予防方法、使用
本発明の方法により製造される細胞集団は、導入された遺伝子に応じて所望の効果を発揮しうる細胞集団である。また、従来の方法で作製された細胞集団と比べて、所望の遺伝子を保持する割合が高い。例えば、所望の抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子が導入された細胞集団は、導入されたレセプター遺伝子によりコードされるレセプターが認識する抗原を提示する細胞に対して細胞傷害活性を示すことから、種々の疾患の治療に有用である。前記の細胞集団を投与される疾患としては、特に限定はないが、例えば、がん（白血病、固形腫瘍など）、肝炎、ウイルス（インフルエンザウイルス、ＨＩＶなど）、細菌（結核菌、ＭＲＳＡ、ＶＲＥなど）、真菌（アスペルギルス、カンジダ、クリプトコッカスなど）が原因である感染性疾患が例示される。また、本発明の方法により製造される細胞集団は、骨髄移植または放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注等にも利用できる。

さらに本発明は、上記の細胞集団を有効成分として含有する医薬組成物（治療剤）を提供する。当該細胞集団を含有する前記治療剤は、免疫療法への使用に適している。免疫療法においては、患者の治療に適したＴ細胞が、例えば注射や点滴により患者の静脈、動脈、皮下、腹腔内等に投与される。当該治療剤は、前述の疾患またはドナーリンパ球輸注での使用において非常に有用である。当該治療剤は、例えば、本発明の方法により調製された当該Ｔ細胞集団を有効成分として、公知の非経口投与に適した有機または無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合し、点滴剤、注射剤として、製薬分野で公知の方法に従い調製できる。なお、治療剤における本発明の細胞集団の含有量、治療剤の投与量、および当該治療剤に関する諸条件は公知の免疫療法に従って適宜決定できる。例えば、医薬における本発明のＴ細胞集団の含有量は、特に限定はないが、例えば、好適には１×１０^３〜１×１０^１１ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１×１０^４〜１×１０^１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１×１０^５〜１×１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってもよい。また、本発明の医薬の投与量は、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０^６〜１×１０^１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、１×１０^７〜５×１０^１１ｃｅｌｌｓ／日、さらに好ましくは１×１０^８〜２×１０^１１ｃｅｌｌｓ／日であってもよい。さらに、当該治療剤による免疫療法と、公知の薬剤投与による薬剤治療、放射線治療または外科的手術による治療との併用を行なうこともできる。

さらに、本発明は当該細胞集団を有効成分として含有する診断薬を提供する。たとえば、患者から得られた細胞を本発明の診断薬により解析、スクリーニングすることにより治療効果の推測、有効な導入遺伝子の選択などが可能である。

本発明はまた、被験体に、前述の方法により得られる細胞集団の有効量を投与することを含む、疾患の治療方法または予防方法を提供する。本明細書中において被験体に特に限定はないが、好ましくは本発明の方法により製造されるＴ細胞集団を投与される前記疾患の生体（例えば、ヒト患者、非ヒト動物）を示す。なお、Ｔ細胞レセプターをコードする遺伝子が導入された細胞集団を有効成分とする本発明の治療剤は、前記細胞集団の発現するＨＬＡ分子と同一または３座不一致までのＨＬＡ分子を発現する被験体に投与される。

また、本明細書中における有効量は、前記Ｔ細胞集団を上記被験体に投与した場合に、該Ｔ細胞集団を投与していない被験体と比較して、治療もしくは予防効果を発揮する該Ｔ細胞集団の量である。具体的な有効量は、投与形態、投与方法、使用目的および被験体の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではないが、好ましくは、上記の医薬と同様にすればよい。投与方法にも限定はなく、例えば、上記の医薬と同様に、点滴または注射等により投与すればよい。

また、本発明は、前述の本発明の製造方法により得られる細胞集団に対して、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つの刺激因子により刺激を与えることにより、活性化されたＴ細胞を含む細胞集団を製造することができる。さらに本発明は、前記の製造方法で得られた細胞集団を提供する。このようにして得られる活性化されたＴ細胞を含む細胞集団は、前述の製造方法により得られるＴ細胞集団と同様に医薬組成物の有効成分として使用できる。ここで刺激因子による刺激は、刺激因子により前述の本発明の製造方法により得られる細胞集団が活性化されるものであれば特に限定はないが、例えば、本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団と刺激因子の共存下で培養を実施することによって上記刺激を与えてもよい。

本明細書において、抗原を提示しうる能力を有する細胞としては、抗原提示細胞として一般に使用される細胞であれば特に限定はないが、例えば、樹状細胞、γδＴ細胞、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、線維芽細胞、ランゲルハンス細胞、およびこれらのうちの少なくとも１種の細胞を含む細胞集団、特に好適には、樹状細胞、γδＴ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、およびこれらのうちの少なくとも１種の細胞を含む細胞集団が例示される。また、当該抗原を提示しうる能力を有する細胞の由来は、投与される患者にとって自己または非自己のいずれでも良いが、自己由来であることが好ましい。なお、本明細書において、抗原を提示しうる能力を有する細胞とは、抗原を提示しうる能力を有するが、抗原を提示していない細胞を意味する。

本明細書において、抗原の提示された細胞としては、前記抗原を提示しうる能力を有する細胞に人為的に適当な抗原が付加された細胞、前記抗原を発現する遺伝子が導入された細胞、もしくは生体より採取した際に既に抗原を提示している細胞のいずれも使用することができる。

本明細書において、提示される抗原としては、抗原提示細胞上にペプチドが提示されるか、もしくはＴ細胞により認識されＴ細胞を効率よく活性化できるものであれば特に限定はないが、例えばペプチド、糖ペプチド、腫瘍細胞抽出物、腫瘍細胞超音波処理物および腫瘍細胞熱水処理物、ウイルスなどの核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、細菌、タンパク質等が例示される。

また、ここでＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンドの具体例としては、前述されたＣＤ３リガンドおよびＣＤ２８リガンドが例示される。なお、本発明の製造方法で得られる細胞集団に対して、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体による共刺激を与えることで、サイトカイン産生能を有する活性化されたリンパ球集団を製造することができる。

本明細書において、サイトカインとは、Ｔ細胞に作用し活性化できるものであれば特に限定はないが、例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ−２７等が例示され、細胞性免疫を増強させる観点から、特に好適には、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２が例示される。

本明細書において、ケモカインとしては、Ｔ細胞に作用し遊走活性を示すものであれば特に限定はないが、例えばＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２１、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ１２、ＩＰ−１０、ＭＩＧが例示される。

本明細書において、サイトカインを産生する能力を有する細胞としては、前述のサイトカインを産生しうる能力を有する細胞であれば特に限定はないが、例えば、細胞性免疫を増強させるという観点からはＴｈ１細胞が例示される。

本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団に対して抗原刺激を負荷することで、極めて細胞傷害活性が高く、抗原認識能も高い有用な抗原特異的ＣＴＬを誘導することができる。また、当該培養は上記刺激因子の他、前述のフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物や、Ｔ細胞の培養に使用される公知成分の存在下で実施することができる。このようにして製造されたＴ細胞集団は、生体内で長期に渡り生存することができ、治療効果が高く極めて有用なＴ細胞集団となる。

なお、本明細書において細胞または細胞集団の製造は、細胞または細胞集団の培養と同義であり、当該細胞または細胞集団の誘導（活性化）、維持、拡大培養の各工程、もしくはこれらを組み合わせた工程を包含する工程を指す。

以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については２００１年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．）に記載の方法によった。

実施例１ ＺｓＧｒｅｅｎ発現レトロウイルスベクターによる遺伝子導入細胞調製
（１）ウイルスベクターの作製
ＺｓＧｒｅｅｎ発現レトロウイルスベクターを以下のように作製した。まず、ｐＺｓＧｒｅｅｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、配列番号１記載の塩基配列のＡ２プライマーおよび配列番号２記載の塩基配列のＺｓＧｒｅｅｎプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＺｓＧｒｅｅｎをコードする領域を含む増幅断片を得た。これを文献（ジーン セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００８年２月２１日オンライン版（ＰＭＩＤ： １８２８８２１２）に記載のヒトＴ細胞レセプター発現ベクターＭＳ―ｂＰａのＴＣＲレセプターβサブユニット遺伝子下流に挿入して、ｐＭＳ―ａｂＺを得た。

（２）プロデューサー細胞の作製
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製、Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）に含まれているプラスミドｐＧＰ、ｐＥ−ｅｃｏならびにｐＭＳ−ａｂＺで形質転換された２９３Ｔ細胞よりエコトロピックレトロウイルスを作製した。得られたエコトロピックレトロウイルスをプロデューサー細胞ＰＧ１３（ＡＴＣＣ＃：ＣＲＬ−１０６８６）に３回感染させた後で、限界希釈によってクローンを選択し、ＭＳ−ａｂＺ産生細胞を得た。

（３）ウイルス液の調製
ＭＳ−ａｂＺ産生細胞株培養中の上清を除き、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）５ｍＬで１回洗浄した後で、ＭＳ−ａｂＺ産生細胞をＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ １．５ｍＬで室温にて１分間処理し、１０％ウシ胎児血清および５０単位／ｍＬペニシリン−５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭに懸濁した。φ１００ｍｍ ｄｉｓｈ（イワキ社製）１枚あたり、５×１０^６細胞で播種した。２４時間培養した後で培養上清を除き、新たに、５ｍＭ 酪酸ナトリウムを含む培地８ｍＬをディッシュに添加した。さらに２４時間培養を行い、上清を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過し、−８０℃で保存した。この上清をＭＳ−ａｂＺウイルス液として以降の実験に用いた。

（４）ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子導入細胞の調製
フィブロネクチンフラグメント（レトロネクチン、タカラバイオ社製）を２５μｇ／ｍＬ、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ株式会社）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解した。この溶液を表面処理した（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ）１２ウェルプレートに０．４ｍＬ／ウェルで加え、室温で５時間放置した。その後溶液を除き、ＰＢＳを用いて１ｍＬ／ウェルで２回洗浄した後に、ＲＰＭＩ１６４０を１ｍＬ／ウェル加えて洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固定化プレートを得た。また、遺伝子導入法陽性コントロールとして、遺伝子導入時に細胞を新たな遺伝子導入用ウイルス結合プレートに撒き直す方法（ＲＮ Ｂｉｎｄｉｎｇ法）に使用する細胞のためのプレートを、以下のように作製した。前記のフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３溶液を表面処理した６ウェルプレートに１．２ｍＬ／ウェルで加え、室温で５時間放置した。その後溶液を除き、プレートをＰＢＳを用いて２ｍＬ／ウェルで２回洗浄した後に、ＲＰＭＩ１６４０を２ｍＬ／ウェル加えて洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固定化プレートを得た。

ＲＮ Ｂｉｎｄｉｎｇ法に用いるプレートを以下のように作製した。
フィブロネクチンフラグメントを２０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、この溶液を表面未処理の１２ウェルプレートに１ｍＬ／ウェル加え、４℃で一晩放置した。溶液を除去した後に、プレートをＰＢＳを用いて２ｍＬ／ウェルで２回洗浄し、２倍希釈したＭＳ−ａｂＺウイルス液３ｍＬをウェルに加え、３２℃、２０００×ｇ、２時間遠心した。遠心後、ウイルス液を除去し、１．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）含有ＰＢＳを用いて３ｍＬ／ウェルで２回洗浄し、ウイルス結合プレートを作製した。

ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、０．３×１０^６個／ｍＬとなるように、１％自己血漿、６００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡおよび２．５μｇ／ｍＬファンギゾンを含むＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）に懸濁し、この懸濁液をフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固定化プレートに０．７５ｍＬ／ｃｍ^２となるように加え、培養を開始した。

遺伝子導入操作を下記のように行った。フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固定化プレートに細胞を撒いたのち、第０日目、第１日目、第２日目にＭＳ−ａｂＺウイルス液を２倍希釈となるように各ウェルにそれぞれ加え、そのまま静置もしくは１０００×ｇ、１時間遠心し、さらにそのまま第３日まで培養した。第３日目に細胞を回収し、２×１０^５個／ｍＬとなるように調整し、この細胞液２ｍＬを２４ウェルプレートに撒き直し、ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。

一方、ＲＮ Ｂｉｎｄｉｎｇ法では、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体存在下で３日間培養したＰＢＭＣをそれぞれ１×１０^６／ｃｍ^２、２×１０^６個／ｍＬとなるように調整し、この細胞液２ｍＬをウイルス結合プレートに加えた。プレートを３２℃、１０００×ｇで、１０分間遠心した後に、４時間、３７℃の条件下、ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。培養後の細胞を２×１０^５個／ｍＬとなるように調整し、この細胞液２ｍＬを２４ウェルプレートに撒きＣＯ_２インキュベーター中で培養した。

ＰＢＭＣ培養の開始から第７日目に培養細胞を回収し、遺伝子導入率をＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞の割合として測定した。

遺伝子導入率測定の結果を図１に示す。遺伝子導入率は、培養開始第１日目にウイルス液を添加したもので増加が確認され、第２日目に添加したものの方がより増加した。また、ウイルス液添加後に遠心操作を加えることで更に遺伝子導入率が増加した。

実施例２ 繰り返し遺伝子導入の効果
（１）ＡｃＧＦＰ発現ウイルスベクターの調製
ＡｃＧＦＰ発現ベクターＭＴ−ＡｃＧＦＰを以下のように調製した。まず、ｐＩＲＥＳ２−ＡｃＧＦＰ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、配列番号３記載の塩基配列のＡｃＧＦＰ５プライマーおよび配列番号４記載の塩基配列のＡｃＧＦＰ３プライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅断片を得た。これをｐＭＴベクター［ジーン セラピー 第７巻、第７９７−８０４頁（２０００）に記載されるｐＭベクター］のＭｌｕＩ−ＢｇｌＩＩサイトに挿入しｐＭＴ−ＡｃＧＦＰを調製した。

（２）プロデューサー細胞の作製
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製、Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）に含まれているプラスミドｐＧＰ、ｐＥ−ｅｃｏならびにｐＭＴ−ＡｃＧＦＰで形質転換された２９３Ｔ細胞よりエコトロピックレトロウイルスを作製した。得られたエコトロピックレトロウイルスをプロデューサー細胞ＰＧ１３（ＡＴＣＣ＃：ＣＲＬ−１０６８６）に３回感染させた後で、限界希釈にて複数のクローンを取得した。リアルタイムＰＣＲにより培養上清中のウイルスＲＮＡ量を測定した結果、および上清と接触させた培養細胞についてＡｃＧＦＰ発現量を測定した結果を指標にしてクローンを選択し、ＭＴ−ＡｃＧＦＰ産生細胞を得た。

（３）ウイルス液の調製
ＡｃＧＦＰ発現レトロウイルスは実施例１の（３）と同様の方法で調製した。得られた上清をＭＴ−ＡｃＧＦＰウイルス液として以降の実験に用いた。

（４）ＡｃＧＦＰ遺伝子導入細胞の調製
実施例１（４）記載と同様に、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体溶液を表面処理した６ウェルプレートに１．２ｍＬ／ウェルで加え、室温で５時間放置した。その後溶液を除き、プレートをＰＢＳを用いて２ｍＬ／ウェルで２回洗浄した後にＲＰＭＩ１６４０を２ｍＬ／ウェル加えて洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固定化プレートを得た。

ＰＢＭＣを、０．３×１０^６個／ｍＬとなるように、１％自己血漿、６００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡおよび２．５μｇ／ｍＬファンギゾンを含むＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）に懸濁し、この懸濁液をフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固定化プレートに０．７５ｍＬ／ｃｍ^２となるように加えた。

（５）遺伝子導入操作
フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固定化プレートに細胞を撒いたのち、第２日目にＭＴ−ＡｃＧＦＰウイルス液を２倍希釈となるようにウェルに加え、１０００×ｇ、１時間遠心し、そのまま第３日まで培養した。また、２回目の遺伝子導入操作を行う条件では、第３日目と同様の操作を繰り返した。遺伝子導入操作回数１回の条件では第３日目に、２回の条件では第４日目に細胞を回収し、２×１０^５個／ｍＬとなるように調整し、その２ｍＬを２４ウェルプレートに撒き直してＣＯ_２インキュベーター中で培養した。

ＰＢＭＣ培養の開始から第８日目に培養細胞を回収し、遺伝子導入率をＡｃＧＦＰ陽性細胞の割合として測定した。

遺伝子導入率測定の結果を図２に示す。ＡｃＧＦＰ陽性率は、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固定化プレートでは、同一プレートを使用した繰り返しウイルス添加により遺伝子導入率の増加が確認された。

実施例３ レトロウイルスベクターによる遺伝子導入細胞の調製
フィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６［レトロネクチン（登録商標）、タカラバイオ社製］を２５μｇ／ｍＬ、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ株式会社）を５μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれＰＢＳに溶解した。この溶液を表面処理した（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ）１２ウェルプレートに０．４ｍＬ／ウェルで加え、室温で５時間放置した。その後溶液を除き、０．５ｍＬのＰＢＳでウェルを２回洗浄後に、０．５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、ＣＨ−２９６／抗ＣＤ３抗体固定化プレートを得た。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を０．３×１０^６個／ｍＬになるように、１％自己血漿、６００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡおよび２．５μｇ／ｍＬファンギゾンを含むＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製、以下培養用培地と表現）に懸濁し、細胞懸濁液３ｍＬをＣＨ−２９６／抗ＣＤ３抗体固定化１２ウェルプレートに添加して、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養を行った。

比較対照１として、３０ｎｇ／ｍＬ ＯＫＴ３を含む培養用培地にＰＢＭＣを０．３×１０^６個／ｍＬになるように懸濁し、細胞懸濁液３ｍＬを１２ウェルプレートに添加して、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養を行った。
比較対照２として、ＯＫＴ３を５μｇ／ｍＬの濃度で表面処理した１２ウェルプレートに固定化し、ＰＢＭＣを０．３×１０^６個／ｍＬになるように、培養用培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養を行った。
比較対照３として、培養用培地にＰＢＭＣを０．３×１０^６個／ｍＬ、抗ＣＤ３抗体・抗ＣＤ２８抗体固相化ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ、インビトロジェン社製）を０．３×１０^６個／ｍＬになるように懸濁し、細胞懸濁液３ｍＬを１２ウェルプレートに添加して、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養を行った。

培養開始から２日目に各ウェルから上清を１．５ｍＬ除き、実施例２で調製したＭＴ−ａｃＧＦＰウイルス液を１．５ｍＬ添加して３２℃、１０００×ｇ、１時間の条件で遺伝子導入し、３日目、７日目に希釈培養を行い、７日目に遺伝子導入効率をＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞の割合としてフローサイトメーターで解析した。また、１０日目に細胞を回収し、トリパンブルー染色により細胞数を計数し、３日目、７日目の希釈倍率から、１０日間の培養における拡大倍率を算出した。遺伝子導入効率測定結果を表１に、細胞増殖倍率を表２にそれぞれ示す。

表１に示す如く、ＰＢＭＣ刺激培養時にＣＨ−２９６／ＯＫＴ３固定化容器を用い、２日目にレトロウイルスベクターで遺伝子導入することによって効率良くＰＢＭＣに遺伝子導入できることが示された。表２に示す如く、ＣＨ−２９６／ＯＫＴ３固定化容器で刺激培養を行うことによって、ＯＫＴ３単独や、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体による共刺激よりも多い細胞数が獲得できることが明らかとなった。

実施例４ レンチウイルスベクターの作製
レンチウイルスベクターｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）をＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）で平滑化処理し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて環状化した後、Ｏｎe Ｓｈｏｔ Ｓｔｂｌ３（インビトロジェン社製）に形質転換することにより、レンチウイルスベクタープラスミドｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５を作製した。
プラスミドｐＺｓＧｒｅｅｎＮ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を制限酵素ＮｏｔＩで消化後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔで平滑化処理し、次に制限酵素ＢａｍＨＩで消化して緑色蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎをコードする領域を獲得した。レンチウイルスベクタープラスミドｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５は、制限酵素ＸｈｏＩで消化後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔで平滑化処理し、次に制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。制限酵素消化したｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５に先に獲得したＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘを用いて挿入し、Ｏｎe Ｓｈｏｔ Ｓｔｂｌ３に形質転換することにより、ＺｓＧｒｅｅｎ発現レンチウイルスベクタープラスミドｐＬｅｎｔｉ６．３−ＺｓＧｒｅｅｎを構築した。

レンチウイルスベクターを作製するための２９３Ｔ／１７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１１２６８）は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ培地で培養した。ＶＳＶ−Ｇシュードタイプレンチウイルスを作製するために、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現プラスミドおよびレンチウイルスの構造遺伝子であるｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、レンチウイルスのアクセサリー遺伝子であるＲｅｖ発現プラスミドが混合されたＶｉｒａＰｏｗｅｒ^ＴＭ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（インビトロジェン社製）と、先に構築したＺｓＧｒｅｅｎ発現レンチウイルスベクタープラスミドｐＬｅｎｔｉ６．３−ＺｓＧｒｅｅｎとを２９３Ｔ／１７細胞にＴｒａｎｓＩＴ ２９３（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いてトランスフェクションし、２４時間後に培地を新鮮なものに交換して培養を継続した。トランスフェクション開始から２日後に培養上清を集めて０．４５μｍのフィルターでろ過し、このろ液をウイルス上清として以下の実験に使用した。

実施例５ レンチウイルスベクターによる遺伝子導入細胞の調製
実施例３に記載の方法で、ＣＨ−２９６／抗ＣＤ３抗体固定化プレートを作製した。ＰＢＭＣを０．７×１０^６個／ｍＬになるように培養用培地に懸濁し、細胞懸濁液０．４ｍＬと実施例４で調製したレンチウイルスベクター１ｍＬを混合し、ＣＨ−２９６／抗ＣＤ３抗体固定化２４ウェルプレートに添加して、３２℃、１０００×ｇ、３０分間の遠心処理を施したのち、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養を行った。

比較対照４として、ＰＢＭＣを２×１０^６個／ｍＬ、抗ＣＤ３抗体・抗ＣＤ２８抗体固相化ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ、インビトロジェン社製）を４×１０^６個／ｍＬになるように、培養用培地に懸濁し添加して室温で３０分間インキュベートし、細胞懸濁液０．５ｍＬと実施例４で調製したレンチウイルスベクター１ｍＬを混合し、ＣＨ−２９６固定化２４ウェルプレートに添加して、３２℃、１０００×ｇ、２時間の遠心処理を施したのち、０．５ｍＬの培養用培地を添加して３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養を行った。
比較対照５として、前記細胞懸濁液０．５ｍＬと実施例４で調製したレンチウイルスベクター１ｍＬを混合し、表面未処理２４ウェルプレートに添加し、さらにプロタミンを１０μｇ／ｍＬになるように添加して、３２℃、１０００×ｇ、２時間の遠心処理を施したのち、０．５ｍＬの培養用培地を添加して３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養を行った。

培養開始から４日目、７日目、１０日目に希釈培養を行い、１４日目に細胞を回収し、遺伝子導入効率をＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞の割合としてフローサイトメーターで解析した。また、トリパンブルー染色により細胞数を計数し、４日目、７日目、１０日目の希釈倍率から、１４日間の培養における拡大倍率を算出した。さらに、１４日目の細胞の表面マーカーをＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７抗体を用いて解析した。遺伝子導入効率測定結果を表３に、細胞増殖倍率を表４に、細胞表面マーカー解析結果を表５および表６にそれぞれ示す。

表３に示す如く、ＰＢＭＣ刺激培養時にＣＨ−２９６／ＯＫＴ３固定化容器を用い、レンチウイルスベクターで遺伝子導入することによって効率良くＰＢＭＣに遺伝子導入できることが示された。表４に示す如く、ＣＨ−２９６／ＯＫＴ３固定化容器で刺激培養を行うことによって、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体による共刺激よりも有意に多い細胞数が獲得できることが明らかとなった。また、細胞表面マーカーの解析から、ＣＨ−２９６／ＯＫＴ３固定化容器を用いることによって、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体による共刺激と比較してＣＤ８陽性のキラー細胞が多く、ナイーブ細胞の比率も高いことが明らかとなった。

本発明の製造方法により、高い効率で所望の遺伝子が導入された細胞集団が提供される。本発明の製造方法は効果が簡便であり、作業効率も改善される。当該製造方法により得られる細胞集団は、例えば、免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。

SEQ ID NO:1: Synthetic primer A2 to amplify a DNA fragment encoding ZsGreen
SEQ ID NO:2: Synthetic primer ZsGreen to amplify a DNA fragment encoding ZsGreen
SEQ ID NO:3: Synthetic primer AcGFP5 to amplify a DNA fragment encoding AcGFP
SEQ ID NO:4: Synthetic primer AcGFP3 to amplify a DNA fragment encoding AcGFP

Claims (10)

1. 下記工程を包含することを特徴とする、所望の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法；
   （１）フィブロネクチンまたはそのフラグメントおよびＣＤ３リガンドを含む容器内でＴ細胞および／またはＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養する工程、および
   （２）所望の遺伝子を保持するベクターを工程（１）の容器に添加する工程。
2. 工程（２）において、ベクターがレトロウイルスベクターである請求項１記載の方法。
3. 工程（２）において、ベクターの添加後にベクターと細胞の接触頻度を物理的に高める操作が実施される請求項１記載の方法。
4. 遠心力の付加または容器の内容物の撹拌によりベクターと細胞の接触頻度を物理的に高める請求項３記載の方法。
5. 工程（２）で得られた遺伝子導入された細胞集団を培養する工程をさらに包含する、請求項１記載の方法。
6. 工程（２）で得られた遺伝子導入された細胞集団より任意の亜細胞集団を分離する工程をさらに包含する、請求項１記載の方法。
7. 請求項１〜６いずれか１項に記載の方法により得ることのできる、所望の遺伝子が導入された細胞集団。
8. 請求項１〜６いずれか１項に記載の方法により得ることのできる、所望の遺伝子が導入された細胞集団を有効成分として含有する医薬。
9. 被験体に、請求項１〜６いずれか１項に記載の方法により得ることのできる、所望の遺伝子が導入された細胞集団を有効量投与する工程を含む疾患の治療方法または予防方法。
10. 医薬の製造のための、請求項１〜６いずれか１項に記載の方法により得ることのできる、所望の遺伝子が導入された細胞集団の使用。

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