JPH04108377A - 細胞培養用基材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、皮膚細胞、血管内皮細胞等の体外培養や、治
療期間の短縮化のため生体内に埋植することができる細
胞培養用基材に関する。

（従来の技術およびその問題点） 人工臓器や細胞工学など生体と接触して用いられる高分
子材料に対しては、生体適合性が要求され、従来におい
ては、生体に対して不活性、無毒性であるバイオイナー
トの材料の開発が主流であったが、近年、生体に対して
積極的に働きかけるようなバイオアクティブな生体適合
性材料の開発に重点がおかれている。

バイオアクティブな生体適合性材料として、これまでグ
ロー放電処理をしたり、親水性モノマーをグラフト重合
することによって、材料表面を親水化して細胞の接着性
を向上させたり、材料表面に正電荷を導入することによ
って細胞接着を促進させることが報告されている。

しかしながら、これらの材料はいずれも細胞接着、細胞
増殖に好適な環境を与えるという受動的な材料に過ぎな
い。

一方、動物細胞を培養する場合、上述のような材料表面
の物理化学的制御によらず、細胞成長因子や細胞接着因
子の様な生体由来物質を利用する生化学的アプローチに
よる方法がある。

この種の方法としては、当初は細胞の生存や増殖に必要
な培地成分として、体内の環境を直接体外に持出したも
のであったが、やがて体内成分の中のアミノ酸、ビタミ
ン、脂質、微量金属元素等の各種栄養分を含んだ合成培
地が開発され、これに１０％の血清を添加して細胞の基
材に対する接着や成長を補ってきた。

しかし、血清を使用する場合には、血清に含まれる多量
の未知成分のため、細胞から分泌されることを目的とす
る有用物質を単離精製することか困難であること、ロッ
ト間にばらつきがあること、高価であることなどの問題
点があり、細胞の大量培養を行なう場合、特に、この問
題が顕著となる。

一方、血清成分中の細胞成長因子の役割が解明され、血
清を用いることなく、既知タンパク質成分のアルブミン
、インスリン、トランスフェリン等を数種類組合せて添
加する無血清培養の可能性が見出されて来たが、未だ完
全無血清培地の開発には至っていない。

これは、細胞は細胞成長因子、細胞接着因子等による外
部からの刺激を細胞膜表面で受容し、適切なシグナルに
変換して細胞内に情報を伝達して増殖しているため、血
清中のこれらの因子が必須なだめである。

また、上記インスリンは非固定化の状態では、細胞膜表
面のインスリン受容体と複合体を形成した後、凝集しエ
ンドサイト−シス機構によって細胞内部に取り込まれ、
これらの過程においてシグナルか伝達されることによっ
てＤＮＡの合成か促進されるか、細胞内に入ったインス
リン及びインスリン受容体は分解を受け、この分解によ
って細胞は受容体数が減少して脱感作現象を引き起し、
ＤＮＡの合成が停滞するという不都合を来すなとの問題
が内蔵されている。

そこで、本発明者らは、上述の問題点に鑑み、高価な血
清を使用する必要がなく、しかも再利用が可能で、細胞
を高速に増殖でき、かつ生産された有用物質の回収率が
高い細胞培養基材の提供を目的として鋭意検討して本願
発明を完成した。

（発明の構成） 上記目的を達成するための本発明の構成は、ポリメチル
メタクリレート膜表面にアミド結合を介して細胞成長因
子及び細胞接着因子を同時固定化してなることを特徴と
する。

ＰＭＭＡ膜表面にアミド結合を介して細胞成長因子、接
着因子を同時固定化するには、ＰＭＭＡ膜の表面を加水
分解して、膜表面にカルボキシル基を生成させ、これに
縮合剤としての水溶性カルボジイミド（以下ＷＳＣと称
す）を反応させてカルボキシル基活性状のＰＭＭＡ膜を
得、これに細胞成長因子、接着因子（以下これらをリガ
ンドと称す）を添加する２ステツプ法と、前記のｗｓｃ
とリガンドとを同時に添加する１ステツプ法とがあり、
何れであってもよい。

リガンドとしての細胞成長因子と細胞接着因子は、同時
に添加しても、何れか一方を先に添加した後、他方を添
加して固定化してもよい。

また、前記ＷＳＣの具体例としては、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｅ　
Ｄ　Ｃ）が挙げられる。

リガンドの固定化のカップリング反応は、ＰＭＭＡ膜表
面のカルボキシル基と、リガンドのアミノ基を結合させ
るための縮合剤として前記ｗｓｃを使用して行なうもの
で、通常、ｐＨが１，０〜１３．０程度の水系溶奴中て
０〜５０℃の温度範囲で１〜２４時間程時間部させれば
゛よい。

本発明に用いられるリガンド（生体情報分子）としての
細胞成長因子としては、インスリン、とりわけウシイン
スリン、細胞接着因子としてはフィブロネクチン、とり
わけウシフィブロネクチンを挙げることができる。

これらの固定化量は、ウシインスリン、ウシフィブロネ
クチンの場合、両者とも０，１μｇ　／　ｃｄ以上、よ
り好ましくは、ウシインスリンが０．２μｇ　／　ｃ−
以上、ウシフィブロネクチンが０．１３μＺ　／　Ｃ−
以上の範囲であることが好適である。

前記固定化量が各々０．１μｇ　／　ｃｄ未満であると
、細胞培養基材として用いたときに、その機能が十分に
発揮されない。

（作用効果） 本発明の細胞培養基材は、ＰＭＭＡ表面のカルボキシル
基を活性化させ、次いで細胞成長因子及び細胞接着因子
のアミノ基と反応させてアミド結合を生成させて、細胞
成長因子及び細胞接着因子を同時固定化しているので、
インターナリゼーションの抑制によるダウンレギュレー
ションの緩和、細胞か局部的に高濃度の情報分子と接触
するため強い刺激を受けるか、また成長因子、接着因子
各々の受容体間の相互作用を促進する等の理由が考えら
れ、Ｐ　Ｍ　Ｍ　Ａ膜にインスリンあるいはフィブロネ
クチンを単独で添加した場合と比較して強力な細胞成長
促進作用か発揮される。

また、細胞培養のために高価な血清を使用する必要がな
いので経済的であり、無血清培養中″で血清添加と同等
の高い細胞成長作用を有するため、細胞により産生され
る有用物質を大量に高収率で回収することができる。

さらに、本発明の細胞培養用基材は、使用後に処理する
ことによって再利用することが可能なので極めて経済的
である。

さらにまた、本発明の細胞培養用基材は、生体適合性に
優れているので、生体内に埋植するなどして生体に積極
的に働きかける医用材料として使用できる可能性がある
。

（実　施　例） 以下本発明につき、好適な実施例により詳細に説明する
。

なお、細胞成長因子、接着因子の固定化量は、放射免疫
測定法（ＲＩＡ法）を用いて定量した。

通常、タンパク質のＮａ１２５１の標識は、クロラミン
Ｔ法を用いて行なわれる。クロラミンＴ法を用いて標識
された１２５Ｉ−インスリンと未標識フィブロネクチン
を用いて固定化した同時固定化膜のγ線量から、インス
リン固定化量を決定することができ、また　１２５Ｉて
標識したフィブロネクチンと未標識インスリンを用いて
固定化した同時固定化膜のγ線量から、フィブロネクチ
ン固定化量を決定することができる。

実施例１ 細胞成長因子としてウシインスリン１細胞接着因子とし
てウシフィブロネクチンを使用し、以下の方法で、これ
らを同時固定化したＰＭＭＡ膜を合成した。

まず、ＰＭＭＡ膜を４規定の水酸化ナトリウム水溶液と
メチルアルコールとを容量比で１＝４とした溶液に浸漬
して、表面の加水分解反応を行なった後、１０％クエン
酸水溶液とメタノールとを容量比で１：４とした溶液で
中和して、カルボキシル基を有するＰＭＭＡ膜を得た。

ＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲによりカルボキシルに基づく吸収を
確認し、ローダミン法によりカルボキシル基量を定量し
たところ、７．　３　　ｎｍｏ、ｅ／ｃ−であった。

次いで、上記のカルボキシル基を有するＰＭＭＡ膜をｐ
Ｈ５，０のＷＳＣの存在下４℃で２時間活性化し、得ら
れたカルボキシル基油性化ＰＭＭＡ膜を、二回蒸留水を
用いて洗浄後、５００μｇ／　ｍ　Ｄのウシインスリン
を１００μｇ　／　ｍ　１２濃度のウシフィブロネクチ
ンの混合溶液中に浸漬し、４℃で２４時間振盪して、ウ
シインスリンとウシフィブロネクチンのカップリング反
応を行なって、細胞培養用基材を得た。

この基材の固定化量は、インスリンが０．２７μｇ　／
　ｃｊ　、フィブロネクチンが０．１２μｇ／ｃｄであ
った。

次いで、得られた細胞培養用基材を用いてマウス繊維芽
細胞ＳＴＯの増殖実験を次の条件で行なった。

上記の細胞培養用基材の膜上に、マウス繊維芽細胞ＳＴ
Ｏを１．　　ＯＸ　１０’　ｃｅｌｌｓ／ｍＪの濃度で
添加し、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下で４８時間培養
した。増殖後の細胞数を乳酸脱水素酵素活性（ＬＤＨ活
性法）により定量したところ相対増殖率が２．５６であ
った。

実施例２〜４ 実施例１においてウシフィブロネクチンの濃度を２００
μｇ／ｍｆ２ｃ実施例２）、３００μｇ／ｍぶ（実施例
３）、５００μｇ／ｍＡ＜実施例４）とした外は実施例
１と同一の条件でウシインスリン、ウシフィブロネクチ
ン同時固定化細胞培養用基材を得、これらを用いて実施
例１と同一の条件でマウス繊維芽細胞ＳＴＯの増殖を行
なったところ、相対増殖率は第１表に示すとおりであっ
た。

インスリン／フィブロネクチン固定化量が相対増殖率に
影響を及はしていることが判る。

比較例］、２ 実施例１において、ウシインスリンのみを単独固定化（
比較例１）あるいはウシフィブロネクチンのみを単独固
定化（比較例２）して、実施例１と同一の条件でマウス
繊維芽細胞ＳＴＯの増殖を行なったところ、第１表に示
すように相対増殖率は低いものであった。

比較例３，４ 実施例１におけるカルボシキ基を有するＰＭＭＡ膜にウ
シインスリンを１０μｇ　／　ｍ　１２の濃度で添加し
たインスリン非固定化状のＰＭＭＡ膜（比較例３）、あ
るいは同濃度のフィブロネクチン非固定化状のＰＭＭＡ
膜（比較例４）を用いて実施例１と同一の条件でマウス
繊維芽細胞ＳＴＯの増殖を行なったところ、相対増殖率
は共に低いものであった。

比較例５ 実施例１におけるカルボキシル基を有するＰＭＭＡ　膜
上に、濃度１５μｇ　／　ｍ　Ｒのウシインスリン及び
５μｇ　／　ｍ　ｆ！のウシフィブロネクチンを添加し
てインスリン及びフィブロネクチンの非固定化状Ｐ　Ｍ
　Ｍ　Ａ膜を調製し、上記同様のマウス繊維芽細胞ＳＴ
Ｏの培養を行なったことろ、相対増殖率は３．３１であ
った。

しかし、このように相対増殖率は高いものの、脱感作現
象を起すなどの不都合かあり、実用上の問題がある。

第１表 手続補正書（０発）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリメチルメタクリレート膜表面にアミド結合を
   介して細胞成長因子及び細胞接着因子を同時固定化して
   なることを特徴とする細胞培養用基材。
2. （２）前記細胞成長因子がインスリンであり、前記細胞
   接着因子がフィブロネクチンであることを特徴とする請
   求項１記載の細胞培養用基材。