CN106366198A - 一种免疫磁珠及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种免疫磁珠及其制备方法，包括磁性微球部分和生物配基部分，所述免疫磁珠的结构式为：A‑NH‑N＝CH‑B，其中A表示磁性微球，B表示生物配基，或者A表示生物配基，B表示磁性微球。本发明的免疫磁珠性质稳定，而且磁性好，磁性微球与生物配基进行化学偶联，反应具有高度特异性，避免了内部交联，偶联效率高。同时，本发明的制备方法简单，反应条件温和，使生物配基可以保留生物活性。本发明原料简单易得，成本低，工艺步骤简单，具有很强的实用性。

Description

一种免疫磁珠及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫磁珠的制备领域，具体地说是一种免疫磁珠及其制备方法。
背景技术
免疫磁珠(Immonumagnetic beads，简称IMB)，是由磁性微球和生物配基结合而成。磁性微球与生物配基的结合一般有物理吸附和化学偶联的方法。物理吸附法由于制备得到的免疫磁珠保存时间短、磁性微球表面活性物质易脱落、蛋白稳定性和活性不佳等缺点，应用受到了限制。化学偶联是利用磁性微球表面的活性基团与生物配基的活性基团进行共价偶联，在磁性微球表面包被生物配基。化学偶联法具有结合容量大的优点，并且生物配基和磁性微球之间多了一层化学键空间臂，对生物配基的活性保护较好，可以避免蛋白质失活，稳定性好，制备得到的免疫磁珠通常可以保存数月。但是化学偶联法只能使用比较温和的条件，因此，抗体的包被效率不佳。化学偶联法是通过以下方法实现的：将磁性微球表面修饰上活性基团，如氨基(-NH2)、羧基(-COOH)或环氧基等，可将这些活性基团与生物配基中相应的，如氨基、羧基等活性基团偶联。
其中，氨基修饰的磁性微球由于容易获得，且氨基的活性较好，很容易与生物配基进行化学偶联，被广泛使用。在使用时，一般将氨基修饰的磁性微球通过戊二醛与生物配基偶联，利用戊二醛作为空间臂，两端分别对磁性微球表面的氨基和生物配基中的氨基进行还原胺化反应，使获得较高的生物配基包被量。但是该方法在进行还原胺化反应时还需要添加强还原剂(如硼氢化钠或者氰基硼氢化钠)，容易引起蛋白等活性物质失活，而且戊二醛会导致磁性微球和生物配基发生交联，也会导致蛋白质内部交联，不利于生物配基的包被。
发明内容
本发明的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种免疫磁珠及其制备方法，用该方法制备得到的免疫磁珠，生物配基与磁珠定向偶联，而且生物配基包被量大，生物活性好。
在本发明的一方面，本发明是通过如下技术方案实现的：一种免疫磁珠，包括磁性微球部分和生物配基部分，所述免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示生物配基，或者A表示生物配基，B表示磁性微球。
优选的，所述生物配基为BSA(牛血清白蛋白)、酶、抗体、DNA或RNA中的一种。
优选的，所述磁性微球为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。比如二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三铁等，更优选为二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁。
在本发明的第二方面，提供了一种制备上述免疫磁珠的方法，其步骤包括：
s1.磁性纳米簇的制备；
s2.氨基修饰的磁性微球的制备；
s3肼基修饰的A部分的制备；
s4.醛基修饰的B部分的制备；
s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠。
在本发明的一种实施方式中，对氨基修饰的磁性微球进行醛基修饰，并且对生物配基进行肼基修饰。或者对氨基修饰的磁性微球进行肼基修饰，并且对生物配基进行醛基修饰，均可以实现上述结构的免疫磁珠。
进一步的，所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或生物配基用摩尔当量为10～50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。最优选的，SANH的摩尔当量为氨基修饰的磁性微球或生物配基的25倍。所述SANH为对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(CAS：362522-50-7)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为肼基。所述SANH一般溶解在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或生物配基的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本发明一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对生物配基的修饰反应时间2～4h。
进一步的，所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或生物配基用摩尔当量为5～20倍的SFB进行醛基修饰后得到的。最优选的，SFB的摩尔当量为氨基修饰的磁性微球或生物配基的10倍。所述SFB为4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(CAS：60444-78-2)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为醛基。所述SFB一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或生物配基的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本发明一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对生物配基的修饰反应时间2～4h。
优选的，所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过水热法、溶剂热法或共沉淀法制备得到，也可以采用市售商品。制备磁性纳米簇的方法为本领域技术人员所熟知的技术，得到的产品只需要满足具有良好的磁性，并且可以与无机或有机高分子形成核壳结构即可。
进一步的，所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球，效果更加优于直接在磁性纳米簇粒子表面进行氨基修饰得到的磁性微球，可以采用市售商品或者按照本领域技术人员所知的常规方法制备，均不影响本发明的结果。可以使纳米簇聚集在二氧化硅内部，形成核壳结构，增大粒径，并且增加磁性和稳定性即可。优选的，本发明采用如下方法制备氨基修饰的二氧化硅包裹的磁性微球：向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷偶联剂，反应1～3天后得到氨基修饰的磁性微球部分；所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入量的质量比为：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。所述氨水的质量百分浓度为25～28％。其中，硅烷化试剂可以为正硅酸四乙酯(CAS：562-90-3)，氨基硅烷偶联剂可以为(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(CAS：919-30-2)。本领域技术人员在选择其他的硅烷化试剂与氨基硅烷偶联剂时，可以对反应原料的比例进行调整，均不超出本发明的保护范围。
优选的，所述步骤s5中，磁性微球和生物配基的质量比为1：(0.01～1)。生物配基与磁性微球的质量比越高越有利于磁性微球表面偶联生物配基，但是考虑到生物配基的成本因素，当生物配基为抗体时，采用磁性微球和生物配基的质量比可以为1：(0.01～0.2)，有利于节省成本；当生物配基为多肽、寡聚核酸等小分子时，采用磁性微球和生物配基的质量比可以为1：(0.2～1)。
在本发明的第三方面，提供了一种上述免疫磁珠在细胞分选中的应用。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种免疫磁珠，其磁性微球和生物配基通过腙键结构相连，得到的免疫磁珠性质稳定，而且磁性好，同时粒径为200～400nm。
(2)本发明采用醛肼偶联的方式，将磁性微球与生物配基进行化学偶联，反应具有高度特异性，避免了内部交联，偶联效率高。
(3)本发明的制备方法简单，反应条件温和，氨基、醛基和肼基修饰的过程均可以在室温下进行，不容易造成生物配基的变质、降解等，同时避免了使用还原剂，使生物配基可以保留生物活性。
(4)本发明原料简单易得，成本低，工艺步骤简单，具有很强的实用性。
附图说明
图1为本发明CD45抗体免疫磁珠1的光学显微镜下形貌图；
图2为本发明CD45抗体免疫磁珠1的荧光显微镜下形貌图；
图3为本发明EpCAM免疫磁珠分选的CTC细胞免疫荧光图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明：下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
(1)磁性纳米簇的制备：通过共沉淀法制备磁性纳米簇Fe3O41；
(2)氨基修饰的磁性微球的制备：向含有10mg磁性纳米簇Fe3O41的溶液中加入125mg氨水、30mg正硅酸四乙酯和30mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反应1天后进行磁分离，并且用乙醇和水交替洗涤各两次，并用0.1M的pH 7～8的磷酸缓冲液分散后得到浓度为5mmol/L的氨基修饰的磁性微球1；
(3)肼基修饰的生物配基的制备：将5μL SANH的DMF溶液(浓度为5mmol/L)加入到100μL标记了荧光的CD45抗体溶液(浓度为10μmol/L)中，在室温反应2h后，用超滤柱纯化得到肼基修饰的生物配基1；
(4)醛基修饰的磁性微球的制备：将5μL的氨基修饰的磁性微球1加入到SFB的DMF溶液(浓度为5mmol/L)50μL中，在室温反应20h后，进行磁分离纯化，得到醛基修饰的磁性微球1；
(5)免疫磁珠的制备：将1mg步骤(4)中的醛基修饰的磁性微球1与0.01mg步骤(3)中的肼基修饰的生物配基1混合，在25℃下pH 5-7的缓冲液中混合2小时后，进行磁分离得到CD45抗体免疫磁珠1。
用BCA法检测溶液中反应前和反应后肼基修饰的生物配基1的浓度，计算得到每毫克CD45抗体免疫磁珠1上，包被抗体率为85％(消耗的抗体量与加入的抗体总量的比例)。
对上述CD45抗体免疫磁珠1进行显微镜检测，得到的光学显微镜下形貌图如图1所示，荧光显微镜下形貌图如图2所示。通过图1和图2可以看出，本发明的CD45抗体免疫磁珠1上，免疫磁珠上都偶联有标记荧光的CD45，偶联效率高。
实施例2
(1)磁性纳米簇的制备：通过水热法制备磁性纳米簇Fe3O4 2；
(2)氨基修饰的磁性微球的制备：向含有10mg磁性纳米簇Fe3O42的溶液中加入250mg氨水、20mg正硅酸四乙酯和10mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反应2天后进行磁分离，并且用乙醇和水交替洗涤各两次，并用0.1M的pH 7～8的磷酸缓冲液分散后得到浓度为5mmol/L的氨基修饰的磁性微球2；
(3)肼基修饰的生物配基的制备：将5μL SANH的DMF溶液(浓度为2mmol/L)加入到100μL BSA溶液(浓度为10μmol/L)中，在室温反应3h后，用超滤柱纯化得到肼基修饰的生物配基2；
(4)醛基修饰的磁性微球的制备：将5μL的氨基修饰的磁性微球1加入到SFB的DMF溶液(浓度为5mmol/L)25μL中，在室温反应16h后，进行磁分离纯化，得到醛基修饰的磁性微球2；
(5)免疫磁珠的制备：将1mg步骤(4)中的醛基修饰的磁性微球2与0.2mg步骤(3)中的肼基修饰的生物配基2混合，在16℃下pH 5-7的缓冲液中混合4小时后，进行磁分离得到BSA免疫磁珠2。
用BCA法检测溶液中反应前和反应后肼基修饰的生物配基2的浓度。计算得到每毫克BSA免疫磁珠2上，包被抗体率为77％(消耗的抗体量与加入的抗体总量的比例)。
实施例3
(1)磁性纳米簇的制备：通过溶剂热法制备磁性纳米簇Fe3O4 3；
(2)氨基修饰的磁性微球的制备：向含有10mg磁性纳米簇Fe3O43的溶液中加入125mg氨水、40mg正硅酸四乙酯和5mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反应3天后进行磁分离，并且用乙醇和水交替洗涤各两次，并用0.1M的pH 7～8的磷酸缓冲液分散后得到浓度为5mmol/L的氨基修饰的磁性微球3；
(3)肼基修饰的磁性微球的制备：将2μL的氨基修饰的磁性微球1加入到SANH的DMF溶液(浓度为2mmol/L)50μL中，在室温反应24h后，进行磁分离纯化，得到肼基修饰的磁性微球3；
(4)醛基修饰的生物配基的制备：将4μL SFB的DMF溶液(浓度为5mmol/L)加入到100μL EpCAM抗体溶液(浓度为10μmol/L)中，在室温反应4h后，用超滤柱纯化得到醛基修饰的生物配基3；
(5)免疫磁珠的制备：将1mg步骤(3)中的醛基修饰的磁性微球3与0.1mg步骤(4)中的肼基修饰的生物配基3混合，在4℃下PBS缓冲液中混合24小时后，进行磁分离得到EpCAM抗体免疫磁珠3。
用BCA法检测溶液中反应前和反应后醛基修饰的生物配基3的浓度。计算得到每毫克EpCAM抗体免疫磁珠3上，包被抗体率为83％(消耗的抗体量与加入的抗体总量的比例)。
实施例4癌症病人的CTC细胞捕获
取健康人和不同癌症病人的外周血血液，对血液中的CTC进行捕获。要求受试者血常规白细胞值位于2×106～1.2×107个/mL之间，全血样本未出现溶血或血块凝结。并且受试者相关信息完整，样本采集、保存方法规范，实验操作规范，具体步骤如下：取不同癌症病人血液3ml，将实施例3的EpCAM抗体免疫磁珠3依次加入到上述各混合细胞悬液中，在4℃下孵育30分钟，然后在1分钟内进行磁分选并用PBS洗涤2-3次，将孵育回收的CTC进行抗体染色、并在载玻片上固定、然后进行细胞核DAPI染色、封片后，用荧光显微镜鉴定，结果如图3所示，细胞膜表面显示有荧光，在荧光显微镜下为绿光荧光，说明捕获到的细胞表面呈EpCAM阳性，说明为肿瘤细胞。而正常人的血液中没有捕获到肿瘤细胞。
如果先对血液进行红细胞裂解，并且用CD45抗体免疫磁珠去除血液中的白细胞后再用EpCAM抗体免疫磁珠进行肿瘤细胞的捕获，捕获效率更高。
对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

Claims (10)

1.一种免疫磁珠，包括磁性微球部分和生物配基部分，其特征在于：所述免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示生物配基，或者A表示生物配基，B表示磁性微球。
2.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于：所述生物配基为BSA、酶、抗体、DNA或RNA中的一种。
3.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于：所述磁性微球部分为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。
4.一种制备权利要求1-3中任一项所述免疫磁珠的方法，其步骤包括：
s1.磁性纳米簇的制备；
s2.氨基修饰的磁性微球的制备；
s3肼基修饰的A部分的制备；
s4.醛基修饰的B部分的制备；
s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠。
5.根据权利要求4所述免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或生物配基用摩尔当量为10～50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。
6.根据权利要求4所述免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或生物配基用摩尔当量为5～20倍的SFB进行醛基修饰后得到的。
7.根据权利要求4所述免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过水热法、溶剂热法或共沉淀法制备得到。
8.根据权利要求4所述免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球，通过如下方法制备得到：向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷偶联剂，反应1～3天后得到氨基修饰的磁性微球；所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入的质量比为：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。
9.根据权利要求4所述免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s5中，磁性微球和生物配基的质量比为1：(0.01～1)。
10.一种权利要求1所述免疫磁珠在细胞分选中的应用。
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