CN114544939A - 一种链霉亲和素磁珠标记方法 - Google Patents

一种链霉亲和素磁珠标记方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及免疫检测的技术领域，具体为一种链霉亲和素磁珠标记方法。该方法包括如下步骤：先将惰性蛋白共价偶联至磁珠表面，获得偶联有惰性蛋白的磁珠；再将所述偶联有惰性蛋白的磁珠与链霉亲和素偶联，获得链霉亲和素标记磁珠。本申请提供的标记方法能够提高链霉亲和素标记磁珠的信号值，降低背景值，提高检测结果的灵敏度。

Description

一种链霉亲和素磁珠标记方法
技术领域
本申请涉及免疫检测的技术领域，具体为一种链霉亲和素磁珠标记方法。
背景技术
链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，它能与生物素发生特异性结合，它们之间的结合力是目前已知最强的非共价键结合力。因为这一特性，链霉亲和素-生物素反应体系在纯化和检测领域得到了广泛的应用。链霉亲和素以同源四聚体的形式存在，每摩尔的四聚体分子可结合四摩尔的生物素分子，所以在免疫检测领域具有信号放大作用。由于链霉亲和素具有上述优势，目前常被标记在磁珠上，用在磁珠化学发光技术中来捕获生物素化抗体或抗原。
常见的链霉亲和素的标记方法为先利用磁珠对链霉亲和素进行标记，然后再用惰性蛋白对获得的链霉亲和素磁珠进行封闭。目前，用磁珠对链霉亲和素的标记方式有两种，一种是用羧基磁珠和链霉亲和素进行标记，具体步骤为将羧基磁珠进行活化，配置链霉亲和素溶液，将活化后的羧基磁珠和链霉亲和素溶液进行包被反应获得链霉亲和素标记磁珠；另一种是用Tosyl官能团磁珠和链霉亲和素进行标记，具体步骤为取Tosyl官能团的磁珠清洗重悬之后，再加入链霉亲和素溶液和硫酸铵溶液进行包被反应，最终获得链霉亲和素磁珠。
上述链霉亲和素的标记方法中，由于先在磁珠上进行了链霉亲和素标记，在后续用惰性蛋白对链霉亲和素磁珠进行封闭时，受磁珠表面上链霉亲和素空间位阻的影响，惰性蛋白无法很好的对链霉亲和素磁珠进行封闭，所以在使用过程中，链霉亲和素磁珠会和生物素抗体、吖啶酯抗体等发生非特异性结合，导致非特异性背景升高，最终影响检测结果。
发明内容
本申请提供一种链霉亲和素磁珠的标记方法，能够提高链霉亲和素标记磁珠的信号值，降低背景值，提高检测结果的灵敏度。
为了解决技术问题，采取了如下的技术方案：
一种链霉亲和素磁珠标记方法，包括如下步骤：
先将惰性蛋白共价偶联至磁珠表面，对磁珠进行封闭，获得偶联有惰性蛋白的磁珠；再将所述偶联有惰性蛋白的磁珠与链霉亲和素偶联，获得链霉亲和素标记磁珠。
通过采用此技术方案，本申请通过先将磁珠与惰性蛋白封闭，再和链霉亲和素偶联，因此，在封闭过程中不涉及到链霉亲和素，故利用惰性蛋白封闭磁珠的过程中不会受到链霉亲和素空间位阻的影响，使得惰性蛋白对磁珠的封闭效果较好。而相关技术中采用先利用链霉亲和素对磁珠标记，后用惰性蛋白对链霉亲和素磁珠封闭的方法，当后用惰性蛋白封闭链霉亲和素磁珠时，由于链霉亲和素的存在，故封闭时会受到磁珠表面上链霉亲和素空间位阻的影响，从而使得惰性蛋白对链霉亲和素磁珠的标记效果差。本申请利用封闭效果较好的、偶联有惰性蛋白的磁珠与链霉亲和素偶联，使得最终获得的链霉亲和素标记磁珠信号值高，背景值低，同时，还能够提高结果的灵敏度。
优选的，在所述偶联有惰性蛋白的磁珠与所述链霉亲和素偶联的过程中，用多功能双向交联剂对所述偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白和所述链霉亲和素进行修饰，获得修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠和修饰后的链霉亲和素。
进一步地，所述用多功能双向交联剂对所述偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白和所述链霉亲和素进行修饰，是指用所述多功能双向交联剂对所述偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基和所述链霉亲和素的氨基进行修饰。
通过采用此技术方案，利用多功能双向交联剂对偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基和所述链霉亲和素的氨基进行偶联。由于偶联是两个目标蛋白的氨基之间进行的偶联，当使用常规的单功能双向交联剂如戊二醛进行偶联时，会出现相邻磁珠上的惰性蛋白的氨基之间或相邻的链霉亲和素的氨基之间的偶联，从而导致磁珠聚集以及链霉亲和素自身的团聚，最终导致偶联失败。而当使用多功能双向交联剂进行偶联时，由于多功能双向交联剂两端的基团的特异性，只有一端能够与氨基进行偶联，从而可以避免相邻磁珠上的惰性蛋白的氨基之间或相邻链霉亲和素的氨基之间的偶联，降低磁珠聚集以及链霉亲和素自身的团聚，进而提高偶联的成功率。因此，本申请采用多功能双向交联剂对惰性蛋白磁珠上的惰性蛋白和链霉亲和素进行修饰，解决了因为单功能双向交联剂导致的偶联失败的问题。
优选的，多功能双向交联剂选自SANH和SFB。
在一个具体的实施方式中，所述多功能双向交联剂可以是SANH。
在一个具体的实施方式中，所述多功能双向交联剂可以是SFB。
在一个具体的实施方式中，所述多功能双向交联剂可以是SANH和SFB。
在一个具体的实施方式中，用多功能双向交联剂SANH对偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基进行修饰。
在一个具体的实施方式中，用多功能双向交联剂SANH对链霉亲和素的氨基进行修饰。
在一个具体的实施方式中，用多功能双向交联剂SFB对偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基进行修饰。
在一个具体的实施方式中，用多功能双向交联剂SFB对链霉亲和素的氨基进行修饰。
在一个具体的实施方式中，用多功能双向交联剂SANH对偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基进行修饰，用多功能双向交联剂SFB对偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基进行修饰。
在一个具体的实施方式中，用多功能双向交联剂SFB对偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基进行修饰，用多功能双向交联剂SANH对偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基进行修饰。
经过试验分析，相比用多功能双向交联剂SFB对偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基进行修饰和用多功能双向交联剂SANH对链霉亲和素的氨基进行修饰，用多功能双向交联剂SANH对偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基进行修饰和用多功能双向交联剂SFB对链霉亲和素的氨基进行修饰时，各个浓度点的发光值高，信噪比、灵敏度都高，检测结果更加准确。
优选的，在所述偶联有惰性蛋白的磁珠与所述链霉亲和素偶联的过程中，所述修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠与所述修饰后的链霉亲和素的重量比为1:(0.2-2)。
优选的，在所述偶联有惰性蛋白的磁珠与所述链霉亲和素偶联的过程中，所述修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠与所述修饰后的链霉亲和素重量比为1:(0.2-0.5)。
在一个具体的实施方案中，所述偶联有惰性蛋白的磁珠与所述链霉亲和素的重量比可以是1:2、1:1、1:0.5、1:0.2。
优选的，所述偶联有惰性蛋白的磁珠与所述链霉亲和素的重量比是1:(0.2-1)。
优选的，所述偶联有惰性蛋白的磁珠与所述链霉亲和素的重量比是1:(0.5-2)。
通过试验分析可知，当所述修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠与所述修饰后的链霉亲和素偶联时的重量比为1:5时，偶联有惰性蛋白的磁珠出现轻微自凝，将修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠与修饰后的链霉亲和素偶联时的重量比控制在1:(0.2-2)的范围内时，偶联有惰性蛋白的磁珠的自凝现象消失。通过检测结果可以明显看出修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠的添加量越大，灵敏度越高，因此将修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠与修饰后的链霉亲和素偶联时的重量比控制在1:(0.2-0.5)的范围内，性能最好。综合考虑性能和成本确定修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠与修饰后的链霉亲和素偶联时的重量比为1:0.2。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.通过采用本申请的技术方案获得的链霉亲和素标记磁珠信噪比高，信号值升高，背景值降低，提高检测结果的灵敏度。
2.本申请利用多功能双向交联剂对偶联有惰性蛋白的磁珠与链霉亲和素进行修饰再偶联，从而使偶联有惰性蛋白的磁珠以及链霉亲和素不会发生自身的聚集，最终达到偶联的目的。
3.本申请将修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠与修饰后的链霉亲和素的重量比控制在1:(0.2-2)范围内，偶联有惰性蛋白的磁珠不会自凝，且链霉亲和素标记磁珠的灵敏度高。
具体实施方式
本申请提供了一种链霉亲和素磁珠标记方法。该方法包括如下步骤：
先将惰性蛋白共价偶联至磁珠表面，获得偶联有惰性蛋白的磁珠；再将所述偶联有惰性蛋白的磁珠与链霉亲和素偶联，获得链霉亲和素标记磁珠。
进一步地，在偶联有惰性蛋白的磁珠与链霉亲和素偶联的过程中，用多功能双向交联剂对偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白和链霉亲和素进行修饰，获得修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠和修饰后的链霉亲和素。其中，用多功能双向交联剂对偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白和链霉亲和素进行修饰，是指用多功能双向交联剂对偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基和链霉亲和素的氨基进行修饰。多功能双向交联剂选自SANH和SFB。
再进一步地，用SANH对偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基进行修饰；用SFB对链霉亲和素的氨基进行修饰。其中，在偶联有惰性蛋白的磁珠与链霉亲和素偶联的过程中，修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠与修饰后的链霉亲和素的重量比为1:(0.2-2)。修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠与修饰后的链霉亲和素的重量比优选为1:(0.2-0.5)。
下述实施例中使用的主要试剂为：
1.缓冲液A：MES缓冲液(2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，pH值为5.5-6.7)。
2.缓冲液B：EDC HCl活化缓冲液(分子式为C8H17N3的HCI溶液即1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)。
3.缓冲液C：10×Modification Buffer(1.0M sodium phosphate，1.5M NaCl，pH8.0)。
4.缓冲液D：10×Conjugation Buffer(1.0M sodium phosphate，1.5M NaCl，pH6.0)。
5.缓冲液E：10×Catalyst Buffer(100mM aniline，100mM sodium phosphate，150mM NaCl，pH 6.0)。
6.SANH：采购自TriLink BioTechnologies；货号：S-1002-105。
7.SFB：采购自TCI chemicals；货号：S0893。
8.zeba脱盐柱：采购自Thermofisher。
9.BSA：牛血清白蛋白；购自采购自sigma-aldrich；货号：SRE0098。
10.无水DMF(无水N,N-二甲基甲酰胺)，采购自sigma-aldrich；货号：227056。
11.EDC-HCl，采购自TCI chemicals；货号：D1601。
具体的，本申请提供的一种链霉亲和素磁珠标记方法，包括以下步骤：
(1)惰性蛋白与磁珠的偶联
a.制备惰性蛋白缓冲液：将惰性蛋白溶解于缓冲液中，制得惰性蛋白缓冲液。
其中，惰性蛋白缓冲液中惰性蛋白的浓度可以为10-50mg/mL。
缓冲液可以是缓冲液A，具体为MES缓冲液。
b.磁珠的活化：利用缓冲液清洗磁珠(磁珠的原始浓度为10mg/mL)，然后将清洗后的磁珠加入活化缓冲液中进行活化，活化完成后移走上清液，获得活化后的磁珠。
其中，活化缓冲液重量为磁珠重量的1-100％，活化反应时间为5-60min。
缓冲液可以是缓冲液A，具体为MES缓冲液。
活化缓冲液可以是缓冲液B，具体为EDC HCl活化缓冲液。
c.偶联：将步骤a获得的惰性蛋白缓冲液加入步骤b获得的活化后的磁珠中，获得包被反应液，进行包被反应，获得偶联有惰性蛋白的磁珠。
其中，惰性蛋白与磁珠的重量比为1：100。
包被反应液中的磁珠浓度为1-50mg/mL。
包被反应时间为1-24h。
包被反应可以在室温条件下进行。
(2)利用多功能双向交联剂对惰性蛋白进行修饰
a.将步骤(1)获得的偶联有惰性蛋白的磁珠放入磁力架上，用修饰缓冲液进行置换，置换3次，获得惰性蛋白-磁珠-缓冲液。
其中，磁珠在惰性蛋白-磁珠-缓冲液中的浓度为5-10mg/mL。
修饰缓冲液可以是缓冲液C，具体为Modification Buffer。
b.配置多功能双向交联剂溶液：将多功能双向交联剂加入无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液中，获得多功能双向交联剂溶液。
其中，多功能双向交联剂溶液中多功能双向交联剂的浓度为10-100ug/mL。
c.修饰：将步骤b获得的多功能双向交联剂溶液加入步骤a获得的惰性蛋白-磁珠-缓冲液中，旋涡震荡，并放入垂直旋转仪内进行旋转，室温反应，获得多功能双向交联剂修饰-惰性蛋白-磁珠。
(3)利用多功能双向交联剂对链霉亲和素进行修饰
a.配置链霉亲和素溶液：利用修饰缓冲液溶解链霉亲和素，获得链霉亲和素-缓冲液。
其中，链霉亲和素溶液中，链霉亲和素的浓度可以是2-5mg/mL。
修饰缓冲液可以是缓冲液C，具体为Modification Buffer。
b.配置多功能双向交联剂溶液：将多功能双向交联剂加入无水DMF溶液中，获得多功能双向交联剂溶液。
其中，多功能双向交联剂溶液中多功能双向交联剂的浓度可以是10-100ug/mL。
c.修饰：将步骤b获得的多功能双向交联剂溶液加入步骤a获得的链霉亲和素溶液中，旋涡震荡，并放入垂直旋转仪内进行旋转，室温反应，获得多功能双向交联剂修饰-链霉亲和素。
(4)多功能双向交联剂修饰-惰性蛋白-磁珠和多功能双向交联剂修饰-链霉亲和素的偶联
a.利用接合缓冲液将步骤(2)获得的多功能双向交联剂修饰-惰性蛋白-磁珠的溶剂置换，置换3次，置换后多功能双向交联剂修饰-惰性蛋白-磁珠的溶剂为接合缓冲液。
其中，多功能双向交联剂修饰-惰性蛋白-磁珠在接合缓冲液中的浓度为5-10mg/mL。
接合缓冲液可以是缓冲液D，具体为Conjugation Buffer。
b.将步骤(3)获得的多功能双向交联剂修饰-链霉亲和素过zeba脱盐柱，利用脱盐置换液进行置换，置换后多功能双向交联剂修饰-链霉亲和素的溶剂为脱盐置换液。
其中，多功能双向交联剂修饰-链霉亲和素在脱盐置换液中的浓度为2-5mg/mL。
脱盐置换液可以是缓冲液D，具体为Conjugation Buffer。
c.将步骤a置换后的多功能双向交联剂修饰-惰性蛋白-磁珠与步骤b置换后的多功能双向交联剂修饰-链霉亲和素按重量比1:(0.2-2)混合，并加入催化缓冲液，进行偶联，旋涡震荡，并放入垂直旋转仪内进行旋转，室温反应2h，获得链霉亲和素标记磁珠。
其中，催化缓冲液可以是缓冲液E，具体为Catalyst Buffer。
d.将步骤c获得的链霉亲和素标记磁珠的溶剂用惰性蛋白溶液置换，置换3次，获得链霉亲和素标记磁珠溶液，备用。
其中，链霉亲和素标记磁珠溶液中，链霉亲和素标记磁珠的浓度为5-10mg/mL。
实施例
实施例1
本实施例提供了一种链霉亲和素磁珠标记方法。该标记方法具体包括以下步骤：
(1)牛血清白蛋白与羧基磁珠的偶联
a.制备牛血清白蛋白缓冲液：将BSA溶解于缓冲液A中，制得BSA缓冲液；其中，BSA浓度为10mg/mL。
b.羧基磁珠的活化：利用缓冲液A清洗羧基磁珠(羧基磁珠的原始浓度为10mg/mL)，然后将清洗后的羧基磁珠10mg加入10mg缓冲液B中进行活化，活化完成后移走上清液，获得活化后的羧基磁珠。其中，活化反应时间为30min。
c.偶联：将步骤a获得的BSA缓冲液10μL加入步骤b获得的活化后的羧基磁珠10mg中，获得包被反应液，进行包被反应，获得偶联有BSA的羧基磁珠。包被反应时间为12h，且包被反应在室温条件下进行。
其中，BSA与羧基磁珠的重量比为1：100；羧基磁珠的浓度为10mg/mL。
(2)利用SANH对BSA进行修饰
a.将步骤(1)获得的偶联有BSA的羧基磁珠5mg放入磁力架上，用缓冲液C进行置换，置换3次，获得BSA-羧基磁珠-缓冲液。其中，BSA-羧基磁珠浓度为5mg/mL。
b.配置SANH溶液：将SANH加入无水DMF溶液中，获得SANH溶液。其中，SANH浓度为50ug/mL。
c.修饰：将步骤b获得的SANH溶液10ul加入步骤a获得的BSA-羧基磁珠-缓冲液中，旋涡震荡，并放入垂直旋转仪内进行旋转，室温反应2h，获得SANH修饰-BSA-羧基磁珠。
(3)利用SFB对链霉亲和素进行修饰
a.配置链霉亲和素溶液：利用缓冲液C溶解链霉亲和素，获得链霉亲和素-缓冲液。其中，链霉亲和素的浓度为2mg/mL。
b.配置SFB溶液：将SFB加入无水DMF溶液中，获得SFB溶液。其中，SFB的浓度为10ug/mL。
c.修饰：将步骤b获得的SFB溶液10ul加入步骤a获得的链霉亲和素-缓冲液中，旋涡震荡，并放入垂直旋转仪内进行旋转，室温反应2h，获得SFB修饰-链霉亲和素。
(4)SANH修饰-BSA-羧基磁珠和SFB修饰-链霉亲和素的偶联
a.利用缓冲液D将步骤(2)获得的SANH修饰-BSA-羧基磁珠的溶剂置换，置换3次，置换后SANH修饰-BSA-羧基磁珠的溶剂为缓冲液D。其中，SANH修饰-BSA-羧基磁珠在缓冲液D中的浓度为5mg/mL。
b.将步骤(3)获得的SFB修饰-链霉亲和素过zeba脱盐柱，利用缓冲液D进行置换，置换后SFB修饰-链霉亲和素的溶剂为缓冲液D。其中，SFB修饰-链霉亲和素在缓冲液D中的浓度为2mg/mL。
c.将步骤a置换后的SANH修饰-BSA-羧基磁珠5mg与步骤b置换后的SFB修饰-链霉亲和素1mg混合，并加入缓冲液E，进行偶联，旋涡震荡，并放入垂直旋转仪内进行旋转，室温反应2h，获得链霉亲和素标记磁珠。
d.将步骤c获得的链霉亲和素标记磁珠的溶剂用BSA溶液置换，置换3次，获得链霉亲和素标记磁珠溶液，备用。其中，链霉亲和素标记磁珠的浓度为5mg/mL。
实施例2
本实施例提供了一种链霉亲和素磁珠标记方法。该标记方法具体包括以下步骤：
(1)牛血清白蛋白与羧基磁珠的偶联
a.制备牛血清白蛋白缓冲液：将BSA溶解于缓冲液A中，制得BSA缓冲液；其中，BSA浓度为10mg/mL。
b.羧基磁珠的活化：利用缓冲液A清洗羧基磁珠(羧基磁珠的原始浓度为10mg/mL)，然后将清洗后的羧基磁珠10mg加入10mg缓冲液B中进行活化，活化完成后移走上清液，获得活化后的羧基磁珠。其中，活化反应时间为30min。
c.偶联：将步骤a获得的BSA缓冲液10μL加入步骤b获得的活化后的羧基磁珠10mg中，获得包被反应液，进行包被反应，获得偶联有BSA的羧基磁珠。包被反应时间为12h，且包被反应在室温条件下进行。
其中，BSA与羧基磁珠的重量比为1：100；羧基磁珠的浓度为10mg/mL，
(2)利用SFB对BSA进行修饰
a.将步骤(1)获得的偶联有BSA的羧基磁珠5mg放入磁力架上，用缓冲液C进行置换，置换3次，获得BSA-羧基磁珠-缓冲液。其中，BSA-羧基磁珠浓度为5mg/mL。
b.配置SFB溶液：将SANH加入无水DMF溶液中，获得SANH溶液。其中，SANH浓度为50ug/mL。
c.修饰：将步骤b获得的SFB溶液10ul加入步骤a获得的BSA-羧基磁珠-缓冲液中，旋涡震荡，并放入垂直旋转仪内进行旋转，室温反应2h，获得SFB修饰-BSA-羧基磁珠。
(3)利用SANH对链霉亲和素进行修饰
a.配置链霉亲和素溶液：利用缓冲液C溶解链霉亲和素，获得链霉亲和素-缓冲液。其中，链霉亲和素的浓度为2mg/mL。
b.配置SANH溶液：将SANH加入无水DMF溶液中，获得SFB溶液。其中，SFB的浓度为10ug/mL。
c.修饰：将步骤b获得的SFB溶液10ul加入步骤a获得的链霉亲和素-缓冲液中，旋涡震荡，并放入垂直旋转仪内进行旋转，室温反应2h，获得SFB修饰-链霉亲和素。
(4)SFB修饰-BSA-羧基磁珠和SANH修饰-链霉亲和素的偶联
a.利用缓冲液D将步骤(2)获得的SFB修饰-BSA-羧基磁珠的溶剂置换，置换3次，置换后SFB修饰-BSA-羧基磁珠的溶剂为缓冲液D。其中，SANH修饰-BSA-羧基磁珠在缓冲液D中的浓度为5mg/mL。
b.将步骤(3)获得的SANH修饰-链霉亲和素过zeba脱盐柱，利用缓冲液D进行置换，置换后SANH修饰-链霉亲和素的溶剂为缓冲液D。其中，SANH修饰-链霉亲和素在缓冲液D中的浓度为2mg/mL。
c.将步骤a置换后的SFB修饰-BSA-羧基磁珠5mg与步骤b置换后的SANH修饰-链霉亲和素1mg混合，并加入缓冲液E，进行偶联，旋涡震荡，并放入垂直旋转仪内进行旋转，室温反应2h，获得链霉亲和素标记磁珠。
d.将步骤c获得的链霉亲和素标记磁珠的溶剂用BSA溶液置换，置换3次，获得链霉亲和素标记磁珠溶液，备用。其中，链霉亲和素标记磁珠的浓度为5mg/mL
实施例3-7
实施例3-7提供了一种链霉亲和素磁珠标记方法。
上述各实施例与实施例1的不同之处在于：步骤(4)偶联的过程中，SANH修饰-BSA-羧基磁珠与SFB修饰-链霉亲和素按不同重量比添加。具体如下表所示：
表1实施例3-7SANH修饰-BSA-羧基磁珠与SFB修饰-链霉亲和素的重量比
Figure BDA0003489130090000091
Figure BDA0003489130090000101
对比例1
本对比例提供了一种使用羧基磁珠和链霉亲和素进行标记的方法。该标记方法具体包括以下步骤：
(1)配置链霉亲和素溶液：将链霉亲和素溶解于MES缓冲液中，配成链霉亲和素缓冲液。其中链霉亲和素的浓度为2mg/mL。
(2)羧基磁珠的活化：取羧基磁珠10mg(羧基磁珠的原始浓度为10mg/mL)，使用MES缓冲液清洗，然后加入10mg活化缓冲液B活化，活化完成后移走上清液，得到活化后的羧基磁珠。活化反应时间为30min。
(3)链霉亲和素标记羧基磁珠：将步骤(1)获得的链霉亲和素缓冲液1mg加入步骤(2)获得的活化后的羧基磁珠5mg中，获得包被反应液，进行包被反应，获得偶联有链霉亲和素的羧基磁珠。包被反应时间为12h，且包被反应在室温条件下进行，获得链霉亲和素羧基磁珠。
其中，链霉亲和素与羧基磁珠的重量比为1：100；羧基磁珠的浓度为10mg/mL。
(4)封闭：将步骤(3)获得的链霉亲和素羧基磁珠重悬至链霉亲和素羧基磁珠保存液中封闭保存。
其中链霉亲和素标记羧基磁珠保存液为：25mM Tris，0.1％吐温，0.01％BSA，0.2％的NaN 3。
对比例2
本对比例提供了一种带Tosyl官能团的磁珠对链霉亲和素进行标记的方法。该标记方法具体包括以下步骤：
(1)配置链霉亲和素溶液：将链霉亲和素溶解于MES缓冲液中，配成链霉亲和素缓冲液。其中链霉亲和素的浓度为2mg/mL。
(2)清洗Tosyl官能团磁珠：取Tosyl官能团的磁珠10mg(磁珠的原始浓度为10mg/mL)，使用PB缓冲液清洗，然后加入PB缓冲液重悬，获得Tosyl官能团磁珠缓冲液。
(3)链霉亲和素标记Tosyl官能团磁珠：将硫酸铵10μL和步骤(1)获得的链霉亲和素溶液1mg加入步骤(2)获得的Tosyl官能团磁珠缓冲液5mg中，获得包被反应液，进行包被反应，包被反应时间为12h，且包被反应在室温条件下进行，获得链霉亲和素Tosyl官能团磁珠。其中，硫酸铵的浓度为0.1mol/L。
其中，链霉亲和素与Tosyl官能团磁珠的重量比为1：100；硫酸铵的反应浓度为1mol/LTosyl官能团磁珠的浓度为10mg/mL。
(4)封闭：将步骤(3)获得的链霉亲和素Tosyl官能团磁珠重悬至链霉亲和素磁珠保存液中封闭保存。
其中链霉亲和素标记标记Tosyl官能团磁珠保存液为25mM Tris，0.1％吐温，0.01％BSA，0.2％的NaN3。
检测试验
分别对实施例1-7、对比例1-2制得的链霉亲和素标记磁珠进行蛋白标记检测。
1、试验所需的试剂及浓度
链霉亲和素标记磁珠，浓度为0.5mg/mL。
生物素抗体，小鼠抗人IL-6抗体购自BD公司，NHS-LC-LC-Biotin购自Thermofisher公司，按照说明书进行标记，工作浓度为1ug/mL。
吖啶酯抗体，小鼠抗人IL-6抗体购自BD公司，吖啶酯NSP-SA-NHS购自厦门赫利森生物科技有限公司，按照说明书进行标记，工作浓度为0.2ug/mL。
标准品IL-6重组蛋白采购自R&Dsystems公司。
用1％casein将标准品IL-6重组蛋白稀释至5000pg/mL、1000pg/mL、200pg/mL、50pg/mL、10pg/mL、5pg/mL、2pg/mL、0pg/mL。
2、反应模式
吸取50ul标准品加入反应杯内，然后依次加入20ul链霉亲和素磁珠、50ul生物素抗体、50ul吖啶酯抗体，37℃反应15min，清洗3遍后，加入100ul预激发液和100ul激发液，进行光计数。
3、试验结果：见表2
表2实施例1-7、对比例1-2制备的链霉亲和素标记磁珠的检测结果
Figure BDA0003489130090000121
结合表2，通过对比实施例1以及对比例1、对比例2的检测结果可知：
羧基磁珠直接标记链霉亲和素检测IL-6 2pg/ml发光值为2452，0pg/ml的发光值为2125，信/噪＝1.15；
Tosyl官能团磁珠标记的链霉亲和素检测IL-6 2pg/ml发光值为5452，0pg/ml的发光值为4122，信/噪＝1.32；
而采用上述标记方法标记出的链霉亲和素磁珠，检测IL-6 2pg/ml发光值为3921,0pg/ml的发光值为1122，信/噪＝3.49。
实施例1所用的方法与上面两种对比例的方法相比，信噪比高，信号值高，背景值低。因此，本申请采用的先将惰性蛋白共价偶联至磁珠表面，获得偶联有惰性蛋白的磁珠；再将所述偶联有惰性蛋白的磁珠与链霉亲和素偶联，获得链霉亲和素标记磁珠的方法，能够提高信号值以及信噪比，降低背景值。
通过对比实施例1以及实施例2的检测结果可知：
实施例1即用SANH修饰磁珠上的BSA、用SFB修饰链霉亲和素混合进行偶联获得链霉亲和素标记磁珠，最终检测IL-6 2pg/ml发光值为3921，0pg/ml的发光值为1122，信/噪＝3.49，能检出2pg/ml浓度的IL-6，灵敏度较高；
实施例2即用SFB修饰磁珠上的BSA、用SANH修饰链霉亲和素混合进行偶联获得链霉亲和素磁珠，实施例2中各个浓度点的发光值远低与实施例1，2pg/ml与0pg/ml发光值均为1400左右，信噪比仅为1。10pg/ml与0pg/ml的信噪比为3.24，因此，仅能检测到浓度为10pg/mL的IL-6，不能检测出IL-6浓度为2pg/mL、5pg/mL的情况，灵敏度较低。因此，本申请用SANH修饰磁珠上的BSA、用SFB修饰链霉亲和素混合进行偶联获得链霉亲和素标记磁珠的灵敏度高，性能好。
通过对比实施例1、4-6以及实施例3的检测结果可知：SANH修饰的磁珠与SFB修饰的链霉亲和素重量比为1:1、1:2、1:0.2、1:0.5时，磁珠不会出现自凝，而当SANH修饰的磁珠与SFB修饰的链霉亲和素重量比为1:5时，磁珠出现自凝，且检测不到发光值，由此可知，将SANH修饰的磁珠与SFB修饰的链霉亲和素重量比控制在1:(0.2-2)范围内，获得的链霉亲和素标记磁珠的信噪比高，背景值低。
而根据实施例1和实施例6以及实施例3可以看出，随着SANH修饰的偶联有惰性蛋白的磁珠添加的重量增多，磁珠自凝现象消失。当SANH修饰的偶联有惰性蛋白的磁珠与SFB修饰的链霉亲和素重量比越高，信噪比越高，背景值越低。而根据实施例7，当SANH修饰的偶联有惰性蛋白的磁珠与SFB修饰的链霉亲和素重量比为1:0.17时，信噪比为3.26，和实施例1相差不大，因此从节约成本的角度出发，将SANH修饰的偶联有惰性蛋白的磁珠与SFB修饰的链霉亲和素重量比为1:0.2时即可达到试验目的。所以当SANH修饰的偶联有惰性蛋白的磁珠与SFB修饰的链霉亲和素重量比优选为1:(0.2-0.5)时，信噪比为3.49和2.43，性能最好。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种链霉亲和素磁珠标记方法，其特征在于，包括如下步骤：
先将惰性蛋白共价偶联至磁珠表面，获得偶联有惰性蛋白的磁珠；再将所述偶联有惰性蛋白的磁珠与链霉亲和素偶联，获得链霉亲和素标记磁珠。
2.根据权利要求1所述的链霉亲和素磁珠标记方法，其特征在于，在所述偶联有惰性蛋白的磁珠与所述链霉亲和素偶联的过程中，用多功能双向交联剂对所述偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白和所述链霉亲和素进行修饰，获得修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠和修饰后的链霉亲和素。
3.根据权利要求2所述的链霉亲和素磁珠标记方法，其特征在于：用所述多功能双向交联剂对所述偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白和所述链霉亲和素进行修饰，是指用所述多功能双向交联剂对所述偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基和所述链霉亲和素的氨基进行修饰。
4.根据权利要求2所述的链霉亲和素磁珠标记方法，其特征在于，所述多功能双向交联剂选自SANH和SFB。
5.根据权利要求4所述的链霉亲和素磁珠标记方法，其特征在于：用所述SANH对所述偶联有惰性蛋白的磁珠上的惰性蛋白的氨基进行修饰。
6.根据权利要求4所述的链霉亲和素磁珠标记方法，其特征在于：用所述SFB对所述链霉亲和素的氨基进行修饰。
7.根据权利要求2所述的链霉亲和素磁珠标记方法，其特征在于：在所述偶联有惰性蛋白的磁珠与所述链霉亲和素偶联的过程中，所述修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠与所述修饰后的链霉亲和素的重量比为1:（0.2-2）。
8.根据权利要求2所述的链霉亲和素磁珠标记方法，其特征在于：在所述偶联有惰性蛋白的磁珠与所述链霉亲和素偶联的过程中，所述修饰后的偶联有惰性蛋白的磁珠与所述修饰后的链霉亲和素的重量比为1:（0.2-0.5）。
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