CN104945510A - 一种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法和应用 - Google Patents
一种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104945510A CN104945510A CN201510322129.9A CN201510322129A CN104945510A CN 104945510 A CN104945510 A CN 104945510A CN 201510322129 A CN201510322129 A CN 201510322129A CN 104945510 A CN104945510 A CN 104945510A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sodium alginate
- immunomagnetic beads
- antibody
- condensing agent
- mass content
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法和应用，免疫磁珠为核壳型结构，内核为磁性材料Fe3O4，中间层为脂质体和海藻酸钠的混合材料，最外层为包被在中间层上的抗体。免疫磁珠各层的组成比例为：海藻酸钠：质量含量为0.0%-50.0%；脂质体：质量含量为0.0%-50.0%；磁性材料：质量含量为0.0%-50.0%；抗体：质量含量为0.0%-30.0%。本发明海藻酸钠免疫磁珠具有很好的生物相容性，通过与生物活性物质中的配基偶联，能够识别并结合相应的抗原、抗体或核酸等，在外加磁场中分离富集迅速，可用于生物材料检测和分离纯化，在细胞分离、固定化酶、靶向药物和免疫检测等生物学领域有着广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于纳米磁性材料领域和生物学领域，涉及一种纳米磁性颗粒，具体为一种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法和应用。
背景技术
免疫微球技术(Immunomicrospheres)是以免疫学为基础利用包被有免疫活性物质的各种微球进行免疫学或其他生物学分析分离等方面应用的一项技术。自1956年Singer将人lgG吸附存聚苯乙烯胶乳颗粒上，首次建立检测类风湿因子的胶乳凝集试验以来，免疫微球技术就以其简便，高效，实用的特点，在免疫学，微生物学，生物化学，分子遗传学及分子生物学等各个领域崭露头角。
免疫磁性微球(Immunomagnetic Microspheres，IMMS)或叫做免疫磁性微珠简称免疫磁珠，作为新型的功能材料近年来已被广泛研究，其在生物医学及临床诊断等领域的应用引起了各国研究者的高度重视。免疫磁性微球是免疫微球的一种，是指连有抗体或抗原的磁性微球，它通过表面的抗体或抗原特异地与靶物质结合，从而赋予其磁响应性，在特定磁场的作用下，通过免疫磁性微球可以发生定向移动，从而实现其免疫学检测，分离纯化，药物导向等方面的目的。理想的免疫磁性微球应具有灵敏性高，特异性强，重复性好以及分离检测速度快等优点。
免疫磁性微球是磁性微球与抗体或抗原结合的产物。磁性微球的范围广泛，包括常用的磁性高分子微球、磁性脂质体、磁性胶束等；而磁性脂质微球是通过适当的方法使脂质体与无机物结合起来形成具有一定磁性及特殊结构的微球，其表面可比较容易的赋予多种反应性功能基团，如-OH，-COOH和-NH2等，使其具有良好的生物相容性，通过与生物活性物质中的配基偶联，能够识别并结合相应的抗原、抗体或核酸等，然后可在外加磁场中进行分离富集。因此，磁性脂质微球（刘信等，磁性脂质体的制备及应用）在细胞分离、固定化酶、靶向药物和免疫检测等生物学领域有着广泛的应用前景。
但是，目前存在的免疫磁性海藻酸钠微球还存在许多问题。首先，免疫磁性海藻酸钠微球中抗体接枝率较低、活性较难维持。主要原因为，利用磁性海藻酸钠微球表面存在的活性基团进行改性，温度较高，时间较长，容易降低抗体的活性。再次，所制备的免疫磁性海藻酸钠微球普遍稳定性不足，容易发生团聚；样品存放半年后，均容易发生结块。如，博士论文（华中科技大学，李青，2007年）中的免疫磁性海藻酸钠微球使用的是反相微乳-包埋的方法，所用的材料包含磁粉，海藻酸钠和表面活性剂琥铂酸二异辛脂磺酸钠。本发明中免疫磁性海藻酸钠微球与现有技术具有本质的区别，具体如下：
（1）成分不同，本发明免疫磁性微球含有Fe3O4超顺磁性纳米颗粒，海藻酸钠，脂质体成分（卵磷脂、胆固醇、羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐、DSPE-PEG-抗体）；
（2）制备方法不同，本发明主要采用脂质体的薄膜分散法制备；
（2）免疫微球的种类不同，本发明的免疫微球属于脂质体类的纳米微球，海藻酸钠和羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐的加入可提高脂质体微球的稳定性。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法和应用。本发明的技术方案如下：
一种海藻酸钠免疫磁珠，核壳型结构，内核为磁性材料Fe3O4，中间层为脂质体和海藻酸钠的混合材料，最外层为包被在中间层上的抗体。
海藻酸钠免疫磁珠各层的组成比例如下：
海藻酸钠：质量含量为0.0%-50.0%；
脂质体：质量含量为0.0%-50.0%；
磁性材料：质量含量为0.0%-50.0%；
抗体：质量含量为0.0%-30.0%。
所述磁珠的粒径为10nm-10000nm。
所述抗体为单克隆抗体。
所述海藻酸钠免疫磁珠的成分包括海藻酸钠、卵磷脂、胆固醇和磁性纳米颗粒；其中，海藻酸钠的质量含量为10.0%-60.0%，卵磷脂的质量含量为10.0%-30.0%，胆固醇的质量含量为5.0%-30.0%，磁性纳米颗粒为5.0%-30.0%。
本发明海藻酸钠免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
（1）使用海藻酸钠与抗体反应制备抗体前体物海藻酸钠-抗体。
（2）用薄膜分散法制备海藻酸钠磁性脂质体：具体为将卵磷脂、胆固醇和油溶性磁性纳米颗粒混合溶于油相氯仿中，孵育20-60分钟，放入茄形瓶中，旋转蒸发成脂质膜；
（3）将形成的脂质膜与含有海藻酸钠和抗体前体物海藻酸钠-抗体的水溶液混合水化，并超声，即可得海藻酸钠免疫磁珠。
上述步骤（1）中将含有海藻酸钠的水溶液与单克隆抗体混合，加入缩合剂反应0.5至48小时，透析除去未反应的缩合剂；所述海藻酸钠与缩合剂的质量比为1-5：1-20；所述的海藻酸钠与抗体混合的质量比为100：1-20；所述缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N'-羰基二咪唑、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或两种。
本发明将磁性脂质体与海藻酸钠复合制备免疫磁珠的中间层，海藻酸钠的加入可提高磁性脂质体的稳定性，同时可提供反应的官能团羧基；在海藻酸钠免疫磁珠免疫磁珠的抗体修饰过程中，采用先制备抗体前体物海藻酸钠－抗体，再与脂质成分复合的方法，前体物的使用可较高的维持抗体的活性。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明海藻酸钠免疫磁珠具有很好的生物相容性，通过与生物活性物质中的配基偶联，能够识别并结合相应的抗原、抗体或核酸等，在外加磁场中分离富集迅速，可用于生物材料检测和分离纯化，在细胞分离、固定化酶、靶向药物和免疫检测等生物学领域有着广泛的应用前景。如制备的抗-EpCAM抗体修饰的海藻酸钠免疫磁珠可进行外周血中肿瘤（乳腺癌）细胞的抓捕和富集，然后将富集的肿瘤细胞进行免疫染色分析计数，就可以指导临床进行个体化用药方案的评估。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 制备海藻酸钠免疫磁珠
（1）将5.0mg 海藻酸钠与1.0mg抗-EpCAM单克隆抗体混合，加入浓度为2.0mg/mL的缩合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐5.0mL中反应24小时，8000-10000分子量透析袋透析除去未反应的缩合剂；冻干后得抗体前体物海藻酸钠- EpCAM。
（2）用薄膜分散法制备免疫海藻酸钠磁性脂质体。将卵磷脂10.0mg、胆固醇6.0mg和油溶性磁性纳米颗粒3.0mg混合溶于10.0mL油相氯仿中，孵育30分钟，放入茄形瓶中，旋转蒸发成脂质膜；
（3）将形成的脂质膜与含有2.0mg海藻酸钠和2.0mg海藻酸钠- EpCAM的水溶液混合水化，并超声，即可得免疫抗-EpCAM单克隆抗体海藻酸钠免疫磁珠。
实施例2 一种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法
所述海藻酸钠免疫磁珠为核壳型结构，内核为磁性材料Fe3O4，中间层为脂质体和海藻酸钠的混合材料，最外层为包被在中间层上的抗体。
海藻酸钠免疫磁珠各层的组成比例如下：
海藻酸钠：质量含量为15.0%；
脂质体：质量含量为35.0%；
磁性材料：质量含量为35.0%；
抗体：质量含量为15.0%；
所述磁珠的粒径为500nm。
所述海藻酸钠免疫磁珠的成分包括海藻酸钠、卵磷脂、胆固醇和磁性纳米颗粒；其中，海藻酸钠的质量含量为15.0%，卵磷脂的质量含量为15.0%，胆固醇的质量含量为15.0%，磁性纳米颗粒为15.0%。
本发明海藻酸钠免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
（1）使用海藻酸钠与抗体反应制备抗体前体物海藻酸钠-抗体。
（2）用薄膜分散法制备海藻酸钠磁性脂质体：具体为将卵磷脂、胆固醇和油溶性磁性纳米颗粒混合溶于油相氯仿中，孵育40分钟，放入茄形瓶中，旋转蒸发成脂质膜；
（3）将形成的脂质膜与含有海藻酸钠和抗体前体物海藻酸钠-抗体的水溶液混合水化，并超声，即可得海藻酸钠免疫磁珠。
上述步骤（1）中将含有海藻酸钠的水溶液与单克隆抗体混合，加入缩合剂反应30小时，透析除去未反应的缩合剂；所述海藻酸钠与缩合剂的质量比为1：5；所述的海藻酸钠与抗体混合的质量比为10：1；所述缩合剂为N,N'-羰基二咪唑。
试验例1 本发明抗-EpCAM海藻酸钠免疫磁珠的应用
取浓度为2.0mg/mL的抗-EpCAM海藻酸钠免疫磁珠40微升，与3例乳腺癌患者穿刺液300微升混合，加入1.0mLPBS（0.1mol/L）混合振荡孵育30分钟；孵育后磁分离，并水洗3次，收集穿刺液中的乳腺癌细胞；最后，经过4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、anti-细胞角蛋白（CK19）-FITC、anti-白细胞共同抗原（CD45）-PE染色将捕获的细胞进行免疫荧光染色，并计数分析,分析结果显示3例乳腺癌患者300微升穿刺液中分别含乳腺癌细胞15个，20个，5个。
阳性判断值或者参考区间：细胞核DAPI染色（蓝色荧光）阳性、anti-CK19-FITC染色（绿色荧光）阳性、anti-CD45-PE（红色荧光）阴性。细胞大小>5μm。
Claims (10)
1.一种海藻酸钠免疫磁珠，其特征在于，所述海藻酸钠免疫磁珠为核壳型结构，内核为磁性材料Fe3O4，中间层为脂质体和海藻酸钠的混合材料，最外层为包被在中间层上的抗体。
2.根据权利要求1所述的海藻酸钠免疫磁珠，其特征在于，所述海藻酸钠免疫磁珠各层的组成比例如下：
海藻酸钠：质量含量为0.0%-50.0%；
脂质体：质量含量为0.0%-50.0%；
磁性材料：质量含量为0.0%-50.0%；
抗体：质量含量为0.0%-30.0%。
3.根据权利要求1所述的海藻酸钠免疫磁珠，其特征在于，所述海藻酸钠免疫磁珠的粒径为10nm-10000nm。
4.根据权利要求1所述的海藻酸钠免疫磁珠，其特征在于，所述海藻酸钠免疫磁珠中的抗体为单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的海藻酸钠免疫磁珠，其特征在于，所述海藻酸钠免疫磁珠的成分包括海藻酸钠、卵磷脂、胆固醇和磁性纳米颗粒；其中，海藻酸钠的质量含量为10.0%-60.0%，卵磷脂的质量含量为10.0%-30.0%，胆固醇的质量含量为5.0%-30.0%，磁性纳米颗粒为5.0%-30.0%。
6.制备如权利要求1-5任一项所述的海藻酸钠免疫磁珠的方法，步骤如下：
（1）使用海藻酸钠与抗体反应制备抗体前体物海藻酸钠-抗体；
（2）用薄膜分散法制备海藻酸钠磁性脂质体：具体为将卵磷脂、胆固醇和油溶性磁性纳米颗粒混合溶于油相氯仿中，孵育20-60分钟，放入茄形瓶中，旋转蒸发成脂质膜；
（3）将形成的脂质膜与含有海藻酸钠和抗体前体物海藻酸钠-抗体的水溶液混合水化，并超声，即可得海藻酸钠免疫磁珠。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中将含有海藻酸钠的水溶液与单克隆抗体混合，加入缩合剂反应0.5至48小时，透析除去未反应的缩合剂；所述海藻酸钠与缩合剂的质量比为1-5：1-20；所述的海藻酸钠与抗体混合的质量比为100：1-20。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N'-羰基二咪唑、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或两种。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中将含有海藻酸钠的水溶液与单克隆抗体混合，加入缩合剂反应24小时，透析除去未反应的缩合剂；所述海藻酸钠与缩合剂的质量比为1：2；所述的海藻酸钠与抗体混合的质量比为5：1。
10.如权利要求1-5任一项所述的海藻酸钠免疫磁珠在细胞分离、固定化酶、靶向药物和免疫检测等生物学领域的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510322129.9A CN104945510A (zh) | 2015-06-12 | 2015-06-12 | 一种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510322129.9A CN104945510A (zh) | 2015-06-12 | 2015-06-12 | 一种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104945510A true CN104945510A (zh) | 2015-09-30 |
Family
ID=54160621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510322129.9A Pending CN104945510A (zh) | 2015-06-12 | 2015-06-12 | 一种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104945510A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106366195A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-01 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种pd‑l1抗体免疫磁珠及其制备方法 |
| CN106366198A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-01 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种免疫磁珠及其制备方法 |
| CN108226485A (zh) * | 2018-02-12 | 2018-06-29 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 肝星状细胞分离纯化用的复合免疫磁珠及其制备方法 |
| CN109283328A (zh) * | 2017-11-15 | 2019-01-29 | 广州弗赛生物科技有限公司 | 一种基于电化学方法和磁珠抗体富集技术的快速检测靶标物的方法 |
| CN113980911A (zh) * | 2021-10-13 | 2022-01-28 | 天津大学 | 富集病毒的微马达的制备方法及其应用 |
| CN114702582A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-07-05 | 浙江树人学院 | 一种可降解免疫磁珠及其制备方法 |
-
2015
- 2015-06-12 CN CN201510322129.9A patent/CN104945510A/zh active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106366195A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-01 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种pd‑l1抗体免疫磁珠及其制备方法 |
| CN106366198A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-01 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种免疫磁珠及其制备方法 |
| CN106366195B (zh) * | 2016-08-31 | 2021-03-30 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种pd-l1抗体免疫磁珠及其制备方法 |
| CN109283328A (zh) * | 2017-11-15 | 2019-01-29 | 广州弗赛生物科技有限公司 | 一种基于电化学方法和磁珠抗体富集技术的快速检测靶标物的方法 |
| CN108226485A (zh) * | 2018-02-12 | 2018-06-29 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 肝星状细胞分离纯化用的复合免疫磁珠及其制备方法 |
| CN108226485B (zh) * | 2018-02-12 | 2020-06-30 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 肝星状细胞分离纯化用的复合免疫磁珠及其制备方法 |
| CN113980911A (zh) * | 2021-10-13 | 2022-01-28 | 天津大学 | 富集病毒的微马达的制备方法及其应用 |
| CN113980911B (zh) * | 2021-10-13 | 2023-08-22 | 天津大学 | 富集病毒的微马达的制备方法及其应用 |
| CN114702582A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-07-05 | 浙江树人学院 | 一种可降解免疫磁珠及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104945510A (zh) | 一种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法和应用 | |
| CN103961703B (zh) | 一种免疫纳米纤维素磁性脂质体及其制备方法 | |
| Materón et al. | Magnetic nanoparticles in biomedical applications: A review | |
| CN101759882B (zh) | 交联葡聚糖磁性复合微粒及其制备方法及其使用 | |
| CN103926398B (zh) | 一种免疫磁珠的制备方法 | |
| Xu et al. | Recent progress of exosome isolation and peptide recognition-guided strategies for exosome research | |
| CN103305464B (zh) | 直接分离cd4+和cd8+淋巴细胞的方法 | |
| CN108192007A (zh) | 一种羧基官能化的聚氨酯包覆磁性微球及其制备方法 | |
| CN106366196B (zh) | 一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法 | |
| CN109576207A (zh) | 一种基于金属离子络合剂的细胞外囊泡的分离方法 | |
| CN103769018B (zh) | 改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球、制备方法及应用 | |
| CN104634973B (zh) | 一种纳米金复合材料免疫传感器的制备方法及应用 | |
| CN105203752A (zh) | 一种磁性血小板吸附颗粒及其制备方法 | |
| CN104762085A (zh) | 一种磁性荧光复合纳米生物探针及其制备方法 | |
| CN104437280B (zh) | 一种有机/无机杂化磁性纳米花的制备方法 | |
| JPH07506185A (ja) | 非特異的抗ハプテン抗体を使用するイムノアッセイ及び該イムノアッセイに使用するための材料 | |
| CN108273575B (zh) | 一种用于诊断贫血性疾病的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途 | |
| CN104538168A (zh) | 一种磁珠的制备方法及应用 | |
| Rashid et al. | Surface modification and bioconjugation of anti-CD4 monoclonal antibody to magnetic nanoparticles as a highly efficient affinity adsorbent for positive selection of peripheral blood T CD4+ lymphocytes | |
| CN107034191A (zh) | 一种在微流控芯片中利用透明质酸功能化的磁珠识别和分离循环肿瘤细胞的方法 | |
| CN106366195B (zh) | 一种pd-l1抗体免疫磁珠及其制备方法 | |
| CN102565382A (zh) | 一种检测血液样本中过敏原特异性IgE抗体的免疫层析方法 | |
| Zhang et al. | Improving isolation of extracellular vesicles by utilizing nanomaterials | |
| Zhu et al. | Immuno-affinitive supramolecular magnetic nanoparticles incorporating cucurbit [8] uril-mediated ternary host-guest complexation structures for high-efficient small extracellular vesicle enrichment | |
| Yu et al. | Functional and biocompatible polymeric ionic liquid (PIL)-decorated immunomagnetic nanospheres for the efficient capture of rare number CTCs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150930 |