CN113980911A - 富集病毒的微马达的制备方法及其应用 - Google Patents

富集病毒的微马达的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113980911A
CN113980911A CN202111193198.6A CN202111193198A CN113980911A CN 113980911 A CN113980911 A CN 113980911A CN 202111193198 A CN202111193198 A CN 202111193198A CN 113980911 A CN113980911 A CN 113980911A
Authority
CN
China
Prior art keywords
micromotor
virus
mixed solution
enriched
water
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111193198.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113980911B (zh
Inventor
崔海鹏
庞慰
段学欣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN202111193198.6A priority Critical patent/CN113980911B/zh
Publication of CN113980911A publication Critical patent/CN113980911A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113980911B publication Critical patent/CN113980911B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20051—Methods of production or purification of viral material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了富集病毒的微马达的制备方法及其应用。本发明所提供的富集病毒的微马达的制备方法，包括如下步骤：(1)将羧甲基壳聚糖与海藻酸钠混合水溶，制备得到羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液A；(2)向步骤(1)的羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液A中加入Fe3O4@Ag纳米粒子，并超声混合，得到混合溶液B；(3)将步骤(2)得到的混合溶液B作为水项，biorad液滴生成油作为油项，在T形微流控芯片中产生油包水液滴；(4)将所述步骤(3)得到的油包水液滴与氯化钙和戊二醛进行交联反应，即得到微马达。本发明制备得到的微马达上可携带生物素化的抗体并进行病毒的特异性富集。

Description

富集病毒的微马达的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及病毒富集技术领域，特别地涉及富集病毒的微马达的制备方法及其应用。
背景技术
新冠肺炎在2020年成为了危害全球的超级病毒，严重影响各国人民的健康和各个国家的经济发展，研发出快速准确的新冠肺炎病毒检测方法就显得更为重要。目前，新冠病毒检测的方法主要通过咽试纸进行上呼吸道病毒检测，为提高检测速率，实现大规模检测，需要将多个样本合并检测。因此，提高病毒的富集效率对于样本检测的准确率尤为重要。
目前富集病毒的方法有聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)沉淀法、超速离心法、超滤法和免疫磁珠分离法。
基于PEG可在中性高离子强度的缓冲液中使病毒沉淀的原理，PEG沉淀法被广泛用于从洗脱液中富集病毒。PEG沉淀法操作简单，只需将洗脱液的pH调至中性，并提高其离子强度，加入PEG后于4℃静置过夜，即可将病毒沉淀。PEG沉淀法成本低廉、易于操作，已被广泛用于从洗脱液中沉淀病毒，但是一般需要沉降，耗费时间较长，而且需要高速离心机等大型设备。
超速离心法浓缩病毒是通过60,000r/min以上的转速来获得约为重力加速度50万倍的离心力，从而达到浓缩病毒的目的。其原理是利用每个颗粒都有不同的质量、密度、大小及形状等，使其在条件相同的离心场中有不同的沉降速度，由此便可以实现物质之间的分离，达到浓缩效果。超速离心机价格较高，而且要求样品的体积很小，一般用作二次浓缩。
免疫磁珠分离法的原理是利用抗体和抗原特异性结合，把抗体包裹在磁珠表面，并将其装填成柱，水样通过柱子与其中的免疫磁珠充分接触后，最后再用洗脱液洗脱病毒，这样就可以分离出被检测病毒。使用磁珠法由于需要被动的磁棒多次搅动来驱动磁珠，提高富集效率，因而很难实现设备小型化。
发明内容
为了弥补以上领域的不足，本发明的主要目的是提供一种富集病毒的微马达的制备方法。
本发明所提供的富集病毒的微马达的制备方法，包括如下步骤：
(1)将羧甲基壳聚糖与海藻酸钠混合水溶，制备得到羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液A；
(2)向步骤(1)的羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液A中加入Fe3O4@Ag纳米粒子，并超声混合，得到混合溶液B；
(3)将步骤(2)得到的混合溶液B作为水项，biorad液滴生成油作为油项，在T形微流控芯片中产生油包水液滴；
(4)将所述步骤(3)得到的油包水液滴与氯化钙和戊二醛进行交联反应，即得到微马达。
进一步，在所述步骤(4)得到微马达后，还包括用1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇和无水乙醇的混合溶液超声清洗所述微马达的步骤。
优选地，所述混合溶液中1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇的质量百分比浓度为50％；无水乙醇的质量百分比浓度为50％。
使用质量百分比浓度为50％1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇和50％无水乙醇的混合溶液可以有效的将上述混合溶液中的biorad生成油和未参与反应的戊二醛萃取出来，从而实现微马达的清洗。
进一步，在所述步骤(4)得到微马达后，还包括在所述微马达上修饰生物素化的赖氨酸聚合物的步骤。
所述步骤(2)的Fe3O4@Ag纳米粒子的制备方法包括如下步骤：
向AgNO3中滴加氨水，使溶液先浑浊后变清，得到银氨溶液；
将Fe3O4纳米粒子加入水中制备Fe3O4纳米粒子分散液，并加入所述银氨溶液中，超声处理，得到混合物；
将含葡萄糖的水溶液加入所述混合物中，搅拌，即得到Fe3O4@Ag纳米粒子。
制备Fe3O4@Ag纳米粒子是因为其具备Ag对H2O2的催化特性，同时又具备Fe3O4的磁性。
所述混合溶液A中所述羧甲基壳聚糖的质量百分比浓度为2％；所述海藻酸钠的质量百分比浓度为2％。
所述混合溶液A与所述Fe3O4@Ag纳米粒子的比例为：每2mL混合溶液A加入3mgFe3O4@Ag纳米粒子。
所述步骤(3)中的所述水相和所述油相通过注射泵注入所述T形微流控芯片中，注入速度分别为0.7μL/min和10μL/min。
所述方法制备得到的富集病毒的微马达也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种富集病毒的方法。
本发明所提供的富集病毒的方法，包括如下步骤：
向所述的微马达中加入PBS缓冲液，得到微马达的PBS分散液；
在容器中加入病毒悬液、T-X100表面活性剂和H2O2，混匀后，加入所述微马达的PBS分散液，静置，让所述微马达自由捕获病毒。
所述微马达的PBS分散液中所述微马达的浓度为0.5mg/ml；
所述表面活性剂曲拉通X-100(T-X100)的质量分数为：0.5～2.5％；
优选地，所述表面活性剂曲拉通X-100的质量分数为：1％；
所述H2O2的质量分数为：1～10％；
所述静置的时间为5～30分钟；
优选地，所述静置的时间为5分钟。
本发明通过直接在粒子上修饰抗体，可对病毒进行特异性识别并富集。粒子的制备采用微流控技术，通过油包水的方式在T形微流控芯片中生成液滴，再进行化学交联。通过静电吸附和特异性识别，在所制备的粒子表面进行逐层修饰，最终修饰上大量的抗体。
本发明首次使用微马达进行病毒的富集，微马达上可携带任何生物素化的抗体并进行病毒的特异性富集。
通过富集可有效提高后续PCR检测的灵敏度，避免混检导致样本稀释浓度过低而产生的假阴性现象。
附图说明
为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：
图1为CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达在不同双氧水浓度下病毒的富集程度。
图2为CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达对不同浓度病毒的富集效率。
图3为CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达不同富集时间对相同浓度病毒的富集效率。
图4为CMCS/SA/Ag@Fe3O4微马达测试假阴性样本的灵敏度检测结果。
图5为利用透射电子显微镜对Fe3O4@Ag纳米粒子的表面形貌表征结果，及通过能谱分析仪进行元素分析结果，其中，图5中a为放大40000倍的Fe3O4@Ag纳米粒子透射电镜图；图5中b和5中c为元素能谱图。
图6为Fe3O4@Ag纳米粒子的元素组成。
图7为CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达的SEM及EDX能谱表征结果。
图8为红外光谱仪对CMCS、SA和CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达进行红外测试的结果。
图9为利用SEM对富集病毒前后的微马达进行扫描结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本申请的限制。
下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，均可从常规商业途径购买得到。
实施例1、富集病毒的微马达的制备方法及其应用
一、制备富集病毒的微马达
1、微马达采用微流控的方式制备，首先配置质量比为2％的羧甲基壳聚糖(购自天津希恩思奥普得科技有限公司，83512-85-0)(CMCS)和质量比为2％海藻酸钠(购自天津希恩思奥普得科技有限公司，9005-38-3)(SA)水溶；分别将1g CMCS和1g SA放入50mL蒸馏水中置于水浴环境下加热，采用磁力搅拌器进行搅拌，使海藻酸钠和羧甲基壳聚糖充分溶解于蒸馏水中，并将其进行1：1的混合，制备得到羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液A，作为制备微马达的主要基底。
2、向步骤1的混合溶液A中加入自制的Fe3O4@Ag纳米粒子50mg并超声混合10min，使其混合均匀，制备得到混合溶液B。制备Fe3O4@Ag纳米粒子是因为其具备Ag对H2O2的催化特性，同时又具备Fe3O4的磁性。将其加入步骤1中的混合溶液并混合，以作为后续实验的主要材料。
Fe3O4@Ag纳米粒子的制备方法如下：
向100mlAgNO3(10mg/ml)中滴加氨水1ml左右，使溶液先浑浊后变清，得到是硝酸银的氨水溶液，简称银氨溶液。
将200mg Fe3O4纳米粒子(购自天津希恩思奥普德科技有限公司，1317-61-9)加入100mL水中制备Fe3O4纳米粒子分散液(20mg/ml)，并加入银氨溶液中，超声处理30min，得到混合物。
将100ml含葡萄糖(20mg/ml)的水溶液加入上述混合物中，搅拌1h，生成Fe3O4@Ag纳米粒子。
3、制备T形微流控芯片，包括对硅片进行光刻，PDMS倒模等可依据现有技术(Weiwei Cui，Meihang He,Luye Mu,et,Cellphone-Enabled Microwell-Based MicrobeadAggregation Assay for Portable Biomarker Detection,ACS Sensors.2018,3,432-440)。
4、通过微流控的方式制备液滴，将步骤2制备得到混合溶液B作为水相，biorad液滴生成油(购自北京友华照钦医疗器械有限公司)作为油相，通过注射泵注入步骤3制备的T形微流控芯片中，注入速度分别为0.7μL/min和10μL/min，在T形微流控芯片中通过油相的剪切力，产生粒径为30～40μm的油包水液滴。将生成的油包水液滴转移到培养皿中，并在培养皿下方放置一块磁铁10分钟，使Fe3O4@Ag纳米粒子沉积在液滴的下方形成不对称的Janus结构；因为推进方式主要靠化学驱动，即产生气泡并反向冲击，因此只有让气泡在微马达的一个方向上生成，才能促进其运动。将1g无水氯化钙放入50ml蒸馏水中进行搅拌，待完全溶解后缓慢加入培养皿中，并滴入100μl质量百分比为50％的戊二醛溶液使其进行交联反应，即得到CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达。
交联过夜后，用质量百分比浓度50％1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇(购自天津希恩思奥普德科技有限公司，647-42-7)和50％无水乙醇的混合溶液溶液经过超声清洗5分钟，后在离心机上以转速为2000转每秒的速度进行3分钟离心，并去除上清溶液，反复清洗三次后，再使用无水乙醇和PBS溶液(PBS缓冲液浓度为0.01mM，pH＝7.4)以相同的方式依次处理三次。
使用质量百分比浓度50％1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇和50％无水乙醇的混合溶液可以有效的将上述混合溶液中的biorad生成油和未参与反应的戊二醛萃取出来，从而实现微马达的清洗。
用无水乙醇和PBS溶液处理的目的是洗掉1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇。
步骤4最终得到的是微马达。液滴通过交联之后就已经固化变成微马达，后续过程是对微马达进行清洗。清洗后得到带负电的胶球。
5、由于羧甲基壳聚糖显电中性，海藻酸钠带负电，所以生成的胶球整体带负电，可以通过静电吸附带正电的赖氨酸及其聚合物。所述赖氨酸聚合物的制备参见文献：WenweiPan,Ziyu Han，Ye Chang,Xuexin Duan，Three-dimensional biosensor surface basedon novel thorns-like polyelectrolytes，Biosensors and Bioelectronics 167(2020)112504。
胶球带负电主要是为了连接赖氨酸。本发明制备的多链3D赖氨酸聚合物可以提供更多的生物素连接位点，从而连接更多的抗体，提高病毒的捕获数量。
6、通过步骤5在微马达上修饰了生物素化的赖氨酸聚合物，使其可以连接链霉亲和素，具体方法为：加入浓度为0.01mg/ml的链霉亲和素1ml，浸泡。选用义翘神州公司40589-T62-B生物素化S蛋白抗体修饰到链霉亲和素上，使微马达具有捕获病毒的能力。
7、优选复百澳(苏州)生物科技有限公司FNV-2019-nCOV-abEN假病毒。将约1*104个微马达投入200微升病毒浓度为10～105/ml的样本中，并加入最低质量分数为1～10％的H2O2和质量分数0.5～5％表面活性剂曲拉通X-100(T-X100)，使微马达能自行运动，提高病毒捕获效率。5分钟～30分钟后用磁力架进行微马达的收集。
微马达的计数方法如下：制备微马达时计算液滴生成的速率，通过乘以反应的总时间估算出整体的微马达数量，后将其配置成悬浊液后取一定的体积得到的结果。
8、本发明选用常州麦格核生物技术有限公司核酸提取试剂提取微马达上富集病毒的核酸，选用
Figure BDA0003301988310000061
ⅡOne Step qRT-PCR Probe Kit试剂盒进行RNA的逆转录；选用宏石P96 PCR仪对病毒RNA进行PCR扩增。探针优选luc2-QPCR-F:5’-CGCACATATCGAGGTGGACA-3’；luc2-QPCR-R:5’-GCAAGCTATTCTCGCTGCAC-3’。本发明对所述提取病毒RNA过程没有特殊的限定，按照本领域常规的过程进行即可。
二、利用微马达富集新冠假病毒
所用新冠假病毒为FNV215新冠假病毒，购自复百澳(苏州)生物科技有限公司的，并用PBS溶液稀释至基因拷贝数为104/ml。在2ml离心管中加入100μl新冠假病毒悬液(基因拷贝数为104/ml)，1.02μl T-X100表面活性剂和4.08μlH2O2，混匀后加入100μLCMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达的PBS分散液(微马达浓度为0.5mg/ml，PBS缓冲液浓度为0.01mM，pH＝7.4)，随后静置5分钟让微马达自由捕获假病毒，随后通过磁铁将孵育所得体系中的CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达与液相分离，得到上清液；
提取200μl上清液，利用常州麦格核生物技术有限公司酸提取试剂盒提取病毒的RNA，利用
Figure BDA0003301988310000071
ⅡOne Step qRT-PCR Probe Kit试剂盒进行RNA的逆转录，和RNA病毒的荧光定量PCR扩增，确定上清液中病毒的剩余含量。同时设立不同浓度梯度的新冠假病毒悬液，并设立对照组，即病毒富集体系中不加入H2O2和曲拉通T-X100表面活性剂，孵育之后通过上述定量PCR反应体系确定上清液中病毒的剩余含量。
富集效率计算公式如下：
Figure BDA0003301988310000072
其中，总病毒拷贝数为加入CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达时上清液中的病毒拷贝数。
结果：
1)以104基因拷贝数假病毒为对象，按照上述方法进行不同条件下测定CMCS/SA/Ag@Fe3O4微马达对病毒富集效率的影响，结果如图1所示。
分别测试CMCS/SA/Ag@Fe3O4微马达在静置，摇床，以及不同双氧水浓度下病毒的富集程度。从图1中可以看出，微马达在双氧水中自由运动对病毒的富集效率远高于静置和在摇床上病毒的富集效率，这说明微马达的自由运动增加了其表面位点与病毒接触的概率。并且，随着双氧水的浓度增加，在2％时达到最高的富集效率。之后，随着双氧水浓度的增加，富集效率逐渐降低。这说明2％为最佳的双氧水浓度。
2)研究CMCS/SA/Ag@Fe3O4微马达对不同浓度假病毒的富集效率和检测极限：
分别以每毫升105，104，103，102，101基因拷贝数的假病毒为研究对象，按照上述方法计算其富集效率。结果如图2所示，从图2中可以看出CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达对不同浓度病毒的富集均处于一个较高的富集效率，而且具有较低的检测极限。
3)研究CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达不同富集时间对相同浓度病毒的富集效率的影响：
分别测试CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达在不同时间下的富集效率，结果如图3所示。从图3中可以看出CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达在5min左右达到了最高的富集效率，随后富集效率变化幅度较小。这说明5min为最佳的反应时间。
4)研究CMCS/SA/Ag@Fe3O4微马达测试假阴性样本的灵敏度：
分别配制体积为10mL,浓度分别为100拷贝/mL,10拷贝/mL,1拷贝/mL,10-1拷贝/mL,10-2拷贝/mL的假病毒待测样本，测试CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达对假阴性样本的检测灵敏度。结果如图4所示，从图4中可以看出在浓度为100拷贝/mL和10拷贝/mL的样本中，使用CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达比直接测量高出6-7个Ct值，而在1拷贝/mL和10-1拷贝/mL样本中直接测量已显示出假阴性，而使用CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达还可以检测出假病毒。这说明CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达对假阴性样本具有更高的检测灵敏度。
5)利用透射电子显微镜(TEM,Tecnai G2 F20)对制备的Fe3O4@Ag纳米粒子及表面形貌进行表征，并通过能谱分析仪进行元素分析，结果见图5-图6，图5中a为放大40000倍的投射电镜图，比例尺为200nm。图5中b和5中c为元素能谱图，可知，Ag通过银镜反应在Fe3O4上长出纳米粒子。图6为Fe3O4@Ag纳米粒子的元素组成，可以看出Fe3O4@Ag纳米粒子的组成元素有Fe,O,Ag,和Cu，其中Cu来自铜网，Fe,O,Ag来自于Fe3O4@Ag纳米粒子。
6)对上述制备的CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达进行SEM及EDX能谱表征，结果见图7；从图7中a)中可以看出CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达中的Fe3O4@Ag纳米粒子成功固定在微马达的一侧；图7中b)，c)和d)的能谱分别代表C,Fe和Ag的元素分布，其中C来自CMCS和SA，而Fe和Ag元素的集中分布也证明了Fe3O4@Ag纳米粒子成功固定在微马达的一侧。
7)利用傅里叶红外光谱仪(VERTEX 70v)对CMCS、SA和CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达进行红外测试，结果见图8；由图8可以看出，1593cm-1处和1410cm-1处为CMCS的NH+2的特征吸收峰，CMCS/SA/Fe3O4@Ag在此处的吸收峰变弱，说明CMCS/SA/Fe3O4@Ag的NH+2上发生了交联反应；在1627cm-1处CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达出现了新的吸收峰，说明戊二醛和CMCS发生Schiff碱反应，生成C＝N双健，成功生成CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达；
利用SEM对富集病毒前后的微马达进行扫描，结果见图9；由图9中可以观察到微马达表面出现大量白色亮点，尺寸为70nm左右，证明CMCS/SA/Fe3O4@Ag微马达成功富集假病毒。
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

Claims (10)

1.一种富集病毒的微马达的制备方法，包括如下步骤：
(1)将羧甲基壳聚糖与海藻酸钠混合水溶，制备得到羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液A；
(2)向步骤(1)的羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液A中加入Fe3O4@Ag纳米粒子，并超声混合，得到混合溶液B；
(3)将步骤(2)得到的混合溶液B作为水项，biorad液滴生成油作为油项，在T形微流控芯片中产生油包水液滴；
(4)将所述步骤(3)得到的油包水液滴与氯化钙和戊二醛进行交联反应，即得到微马达。
2.根据权利要求1所述的富集病毒的微马达的制备方法，其特征在于：在所述步骤(4)得到微马达后，还包括用1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇和无水乙醇的混合溶液溶液超声清洗所述微马达的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的富集病毒的微马达的制备方法，其特征在于：在所述步骤(4)得到微马达后，还包括在所述微马达上修饰生物素化的赖氨酸聚合物的步骤。
4.根据权利要求1所述的富集病毒的微马达的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的Fe3O4@Ag纳米粒子的制备方法包括如下步骤：
向AgNO3中滴加氨水，使溶液先浑浊后变清，得到银氨溶液；
将Fe3O4纳米粒子加入水中制备Fe3O4纳米粒子分散液，并加入所述银氨溶液中，超声处理，得到混合物；
将含葡萄糖的水溶液加入所述混合物中，搅拌，即得到Fe3O4@Ag纳米粒子。
5.根据权利要求1所述的富集病毒的微马达的制备方法，其特征在于：所述混合溶液A中所述羧甲基壳聚糖的质量百分比浓度为2％；所述海藻酸钠的质量百分比浓度为2％。
6.根据权利要求1所述的富集病毒的微马达的制备方法，其特征在于：所述混合溶液A与所述Fe3O4@Ag纳米粒子的比例为：每2mL混合溶液A加入3mg Fe3O4@Ag纳米粒子。
7.根据权利要求1所述的富集病毒的微马达的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的所述水相和所述油相通过注射泵注入所述T形微流控芯片中，注入速度分别为0.7μL/min和10μL/min。
8.权利要求1～7中任一所述的方法制备得到的富集病毒的微马达。
9.一种富集病毒的方法，包括如下步骤：
向权利要求要求8所述的微马达中加入PBS缓冲液，得到微马达的PBS分散液；
在容器中加入病毒悬液、表面活性剂曲拉通X-100和H2O2，混匀后，加入所述微马达的PBS分散液，静置，让所述微马达自由捕获病毒。
10.根据权利要求9所述的富集病毒的方法，其特征在于：
所述微马达的PBS分散液中所述微马达的浓度为0.5mg/ml；
所述表面活性剂曲拉通X-100的质量分数为：0.5～2.5％；
所述H2O2的质量分数为：1～10％；
所述静置的时间为5～30分钟。
CN202111193198.6A 2021-10-13 2021-10-13 富集病毒的微马达的制备方法及其应用 Active CN113980911B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111193198.6A CN113980911B (zh) 2021-10-13 2021-10-13 富集病毒的微马达的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111193198.6A CN113980911B (zh) 2021-10-13 2021-10-13 富集病毒的微马达的制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113980911A true CN113980911A (zh) 2022-01-28
CN113980911B CN113980911B (zh) 2023-08-22

Family

ID=79738412

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111193198.6A Active CN113980911B (zh) 2021-10-13 2021-10-13 富集病毒的微马达的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113980911B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110053250A1 (en) * 2008-03-31 2011-03-03 Japan Tobacco Inc. Enrichment method of virus
US20110053145A1 (en) * 2008-03-31 2011-03-03 Japan Tobacco Inc. Quantitation method of virus
CN103961703A (zh) * 2014-04-23 2014-08-06 上海裕隆医学检验所股份有限公司 一种免疫纳米纤维素磁性脂质体及其制备方法
CN104945510A (zh) * 2015-06-12 2015-09-30 上海裕隆医学检验所股份有限公司 一种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法和应用
CN106924806A (zh) * 2017-04-20 2017-07-07 广州军区广州总医院 一种含铜羧甲基壳聚糖‑海藻酸钠支架、其制备方法及应用
CN111748109A (zh) * 2019-03-29 2020-10-09 武汉大学 一种利用pH值在6~8的壳聚糖溶液制备的壳聚糖微球及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110053250A1 (en) * 2008-03-31 2011-03-03 Japan Tobacco Inc. Enrichment method of virus
US20110053145A1 (en) * 2008-03-31 2011-03-03 Japan Tobacco Inc. Quantitation method of virus
CN103961703A (zh) * 2014-04-23 2014-08-06 上海裕隆医学检验所股份有限公司 一种免疫纳米纤维素磁性脂质体及其制备方法
CN104945510A (zh) * 2015-06-12 2015-09-30 上海裕隆医学检验所股份有限公司 一种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法和应用
CN106924806A (zh) * 2017-04-20 2017-07-07 广州军区广州总医院 一种含铜羧甲基壳聚糖‑海藻酸钠支架、其制备方法及应用
CN111748109A (zh) * 2019-03-29 2020-10-09 武汉大学 一种利用pH值在6~8的壳聚糖溶液制备的壳聚糖微球及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEI DENG 等: ""Poly-l-lysine-functionalized magnetic beads combined with polymerase chain reaction for the detection of Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7 in milk"", 《J. DAIRY SCI.》 *
林显坤 等: ""可控分子组装的自驱动胶体马达及其生物医学应用"", 《中国科学：化学》 *
韩晓娜等: "O-羧甲基壳聚糖/海藻酸钠微球的制备及取代度对微球溶胀性的影响", 《中国食品学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113980911B (zh) 2023-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101729687B1 (ko) 초상자성 나노복합체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 초상자성 나노복합체
JP6661368B2 (ja) マルチソート細胞分離法
Zengin et al. Molecularly imprinted superparamagnetic iron oxide nanoparticles for rapid enrichment and separation of cholesterol
CN104538168B (zh) 一种磁珠的制备方法及应用
CN103305464B (zh) 直接分离cd4+和cd8+淋巴细胞的方法
CN109727761A (zh) 一种单分散超顺磁性纳米磁珠的制备方法和应用
CN111330558A (zh) 一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法
Hsu et al. Fast sorting of CD4+ T cells from whole blood using glass microbubbles
CN106552600A (zh) 一种磁性壳核结构纳米粒子及其制备方法与应用
CN110812497B (zh) 特异性捕获CTCs的仿生型Janus磁-介孔二氧化硅纳米粒子及制备方法和应用
Van de Waterbeemd et al. Surface functionalisation of magnetic nanoparticles: quantification of surface to bulk amine density
CN117330481B (zh) 一种外泌体的流式检测方法及其应用
CN114459877A (zh) 用于富集外泌体的dna四面体复合磁性纳米材料及制备
JP5150890B2 (ja) ポリマー被覆粒子
CN110327792A (zh) 一种双组分纳米添加剂构建的树状结构的混合基质膜及其制备方法和应用
CN113980911B (zh) 富集病毒的微马达的制备方法及其应用
CN111724954B (zh) 一种氧化石墨烯磁珠、抗体偶联氧化石墨烯磁珠及其在细胞分选中的应用
CN116116385B (zh) 一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法
JP2010229440A (ja) 水分散性金属ナノ粒子
Xing et al. Capture of cervical exfoliative cells on a glass slide coated by 3-glycidyloxypropyl trimethoxysilane and poly-L-lysine
CN107621553A (zh) 一种微生物放大成像检测方法
CN109732097B (zh) 一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法
CN116053017B (zh) 一种复合磁性微球及其制备方法和应用
CN103305462B (zh) 一种富集分离人外周血cd34+和cd91+淋巴细胞的方法
CN116426481A (zh) 循环肿瘤细胞分离用花状免疫磁珠及其制备、应用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant