CN106924806A - 一种含铜羧甲基壳聚糖‑海藻酸钠支架、其制备方法及应用 - Google Patents

一种含铜羧甲基壳聚糖‑海藻酸钠支架、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含铜羧甲基壳聚糖‑海藻酸钠支架的制备方法，其包括以下步骤：(1)用超纯水配制纳米铜溶液；(2)将羧甲基壳聚糖和海藻酸钠加入步骤(1)制得的纳米铜溶液中，混合均匀，得到混合溶液；(3)将步骤(2)得到的混合溶液冻干，得到冻干后的初始支架；(4)向步骤(3)得到的冻干后的初始支架中加入CaCl2溶液交联，清洗，得到交联后的支架；(5)将步骤(4)得到的交联后的支架冻干，即得所述含铜羧甲基壳聚糖‑海藻酸钠抗菌骨修复支架。本发明的制备方法制备得到的含铜羧甲基壳聚糖‑海藻酸钠支架具有多孔结构，同时具有良好的生物相容性和抗菌效果。

Description

一种含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及羧甲基壳聚糖-海藻酸钠材料，尤其涉及一种可用作抗菌骨修复材料的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的制备方法和应用。
背景技术
感染性骨缺损是临床的棘手问题，目前临床的常用治疗方法是清创、使用大量的抗生素和骨移植。骨组织工程是骨修复的研究热点，在抗菌骨修复材料上，目前研究大多数使用加入抗生素的办法打到抑菌效果。然而，抗生素产生的细菌耐药性问题，也成为了感染治疗中新的难题。壳聚糖和海藻酸钠都是自然界存量丰富的天热多糖，在骨修复材料中具有很好的应用前景。大量研究已经证明壳聚糖和海藻酸钠具有良好的生物相容性：无毒性、致敏性低和具有生物降解性。同时，壳聚糖还有抗菌、促进骨修复等多种生物功能。
金属离子的抗菌作用也是研究的热点，如银离子、铜离子等具有很强的杀菌作用。由于银的价格昂贵而且人体中不含银离子，银在应用上有一定的限制。铜是自然界储量丰富的金属，也是人体所需的微量元素，应用前景良好。目前，合成含铜的骨修复支架材料，多数研究通常通过加入铜离子溶液达到使支架材料含铜的效果。然而，该合成方法易出现溶液立即交联的现象，导致制备困难、铜离子分布不均匀，严重限制其实际应用。目前报道的含铜骨修复支架中，使用纳米铜合成的报道几乎没有。
发明内容
一方面，本发明为克服现有技术的不足而提供了一种含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的制备方法，制备得到的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架具有多孔结构,同时具有良好的生物相容性和抗菌效果。
本发明采用的技术方案为：一种含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的制备方法，其包括以下步骤：
(1)用超纯水配制纳米铜溶液；
(2)将羧甲基壳聚糖和海藻酸钠加入步骤(1)制得的纳米铜溶液中，混合均匀，得到混合溶液；
(3)将步骤(2)得到的混合溶液冻干，得到冻干后的初始支架；
(4)向步骤(3)得到的冻干后的初始支架中加入CaCl2溶液交联，清洗，得到交联后的支架；
(5)将步骤(4)得到的交联后的支架冻干，即得所述含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠抗菌骨修复支架。
在以上技术方案中，先将纳米铜溶液与羧甲基壳聚糖和海藻酸钠均匀混合，其后将混合溶液冻干后得到多孔结构，纳米铜即可均匀、稳定地分散在羧甲基壳聚糖和海藻酸钠中；加入交联剂CaCl2溶液后，羧甲基壳聚糖和海藻酸钠遇CaCl2即发生凝结，使得材料的强度进一步增加。
羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的选择是发明人通过大量的创造性试验从众多材料中筛选得到的，发明人发现两者联合使用可以有效的弥补各自的不足。发明人在研究中发现单纯使用羧甲基壳聚糖制备得到的支架脆性大，单纯使用海藻酸钠制备得到的支架强度不足，而羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的联合使用具有协同增效的作用，可有效降低支架的脆性，提高支架强度，从而使得抗菌骨修复支架的性能更优。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(1)中，纳米铜溶液的浓度为0.01-10mM。当纳米铜浓度高于10mM时，会产生细胞毒性，而当其低于0.01mM时，则抗菌性不佳。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(2)中，混合溶液中，羧甲基壳聚糖的浓度为0.5-2.5％w/v，海藻酸钠的浓度为0.5-2.5％w/v。当两者的浓度过高时，制备的支架不能成型，当浓度过低时，则存在制备困难的问题。发明人通过大量的试验发现当羧甲基壳聚糖的浓度为0.5-2.5％w/v，海藻酸钠的浓度为0.5-2.5％w/v时，制得的抗菌骨修复支架能够更好的满足抗菌骨修复支架的要求。
需要说明的是，若无特别说明，本文中涉及的浓度单位％w/v的计算公式为：(物质的质量/溶液的体积)×100％，其中物质的质量/溶液的体积的单位为g/mL；例如，此处的海藻酸钠的浓度是通过(海藻酸钠的质量/组分A的体积)×100％得到的。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(2)中，羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的重量比为1:1。此时，制得的抗菌骨修复支架强度更佳。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(2)中，混合溶液中，羧甲基壳聚糖的浓度为1.5％w/v，海藻酸钠的浓度为1.5％w/v。该浓度制备的支架孔隙大小更为适宜，制得的支架性能更好。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(3)通过以下步骤实施：将混合溶液移入容器中，-80℃冷冻过夜后，移至冻干机内冻干；优选地，所述步骤(3)中，冻干时间为45～50h，更优选为48h。48h时既可保证混合溶液彻底冻干，同时制成的多孔结构更为稳定、适宜。
所述容器可为培养板，例如48孔培养板。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(4)中，CaCl2溶液的浓度为1.5～2.5％w/v，优选为2％w/v。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(4)中，交联时间为25～35min，优选为30min。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤(5)中，冻干时间为20～30h，优选为24h。24h既可保证支架彻底冻干，同时节省时间，得到的支架的性能更好。
另一方面，本发明还提供了根据以上所述的制备方法制备得到的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架。
又一方面，本发明还提供了根据以上所述的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架作为抗菌骨修复材料的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架具有多孔结构，孔径大小主要90～130μm之间分布。
(2)本发明的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的制备方法，加入纳米铜的过程中不会发生支架材料立即交联，制备过程简单，铜分布更加均匀。
(3)本发明制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的相对细胞活性在80％以上，没有细胞毒性，溶血性低于5％，没有溶血性，具有良好的生物相容性。
(4)本发明制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架制备方法对金黄色葡萄球菌的抗菌性可达99％以上，具有良好的抗菌效果。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架外观。
图2为本发明实施例1制备得到的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的扫描电镜照片。
图3为本发明实施例1制备得到的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的细胞毒性检测结果。
图4为本发明实施例1制备得到的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的溶血性检测结果。
图5为本发明实施例1制备得到的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的抗菌性检测结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
用超纯水配置10mL浓度为10mM的纳米铜溶液，磁力搅拌器于常温条件下搅拌至均匀。逐渐加入150mg的羧甲基壳聚糖和150mg海藻酸钠，磁力搅拌器于常温条件下搅拌至完全溶解。将上述混合溶液加入48孔培养板中，放入-80℃冰箱中冷冻过夜。将48孔板移至冻干机内冻干48h。加入2％CaCl2溶液交联30min，超纯水清洗3次。放入-80℃冰箱中冷冻过夜，使用冻干机冻干24h后得到支架，即为含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架。
将所得到的支架与105个成纤维细胞L929共培养，分别于1、3、5天弃去培养基，加入10％的MTT溶液，4h后加入DMSO溶解紫色结晶，于490nm测量吸光度，检测支架的细胞毒性。将所得支架与稀释后的健康人外周血共培养1h，离心后吸取上清，于545nm测量吸光度，检测支架的溶血性。将所得到的支架与106CFU的金黄色葡萄球菌共培养24h，稀释1000倍后涂板，培养24h后进行计数，检测支架的抗菌性。本实施例1制备得到的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架外观如图1所示。
图2为本实施例制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的扫描电镜图，由图2可知，本实施例1制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架为多孔结构。
图3为本实施例1制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的细胞毒性检测结果，由图2可知，本实施例1制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架与空白培养板相比，在1、3、7天的相对细胞活性分别为97.76％、114.99％和102.95％，所制备材料无细胞毒性。
图4为本实施例1制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的溶血性检测结果，本实施例1制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的溶血性为1.13％，由图3可知，所制备的支架无明显的溶血性。
图5为本实施例1制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的抗菌性检测结果，由图4可知，本实施例1制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架对金黄色葡萄球菌的抗菌率达99.86％，具有良好的抗菌性。
实施例2
用超纯水配置10mL浓度为称取1mM的纳米铜溶液，磁力搅拌器于常温条件下搅拌至均匀。逐渐加入150mg的羧甲基壳聚糖和150mg海藻酸钠，磁力搅拌器于常温条件下搅拌至完全溶解。将上述混合溶液加入48孔培养板中，放入-80℃冰箱中冷冻过夜。将48孔板移至冻干机内冻干48h。加入2％CaCl2溶液交联30min，超纯水清洗3次。放入-80℃冰箱中冷冻过夜，使用冻干机冻干24h后得到支架，即为含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架。
本实施例制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架与空白培养板相比，在1、3、7天的相对细胞活性分别为85.81％、132.19％和106.99％，所制备材料无细胞毒性。
本实施例制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的溶血性为1.37％。
本实施例制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架对金黄色葡萄球菌的抗菌率达99.38％，具有良好的抗菌性。
实施例3
用超纯水配置10mL浓度为称取0.1mM的纳米铜溶液，磁力搅拌器于常温条件下搅拌至均匀。逐渐加入150mg的羧甲基壳聚糖和150mg海藻酸钠，磁力搅拌器于常温条件下搅拌至完全溶解。将上述混合溶液加入48孔培养板中，放入-80℃冰箱中冷冻过夜。将48孔板移至冻干机内冻干48h。加入2％CaCl2溶液交联30min，超纯水清洗3次。放入-80℃冰箱中冷冻过夜，使用冻干机冻干24h后得到支架，即为含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架。
本实施例制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架与空白培养板相比，在1、3、7天的相对细胞活性分别为94.97％、133.8％和113.15％，所制备材料无细胞毒性。
本实施例制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的溶血性为1.08％。
本实施例制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架对金黄色葡萄球菌的抗菌率达98.67％，具有良好的抗菌性。
实施例4
用超纯水配置10mL浓度为称取10mM的纳米铜溶液，磁力搅拌器于常温条件下搅拌至均匀。逐渐加入50mg的羧甲基壳聚糖和50mg海藻酸钠，磁力搅拌器于常温条件下搅拌至完全溶解。将上述混合溶液加入48孔培养板中，放入-80℃冰箱中冷冻过夜。将48孔板移至冻干机内冻干48h。加入2％CaCl2溶液交联30min，超纯水清洗3次。放入-80℃冰箱中冷冻过夜，使用冻干机冻干24h后得到支架，即为含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架。
本实施例制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架与空白培养板相比，在1、3、7天的相对细胞活性分别为95.72％、122.59％和104.16％，所制备材料无细胞毒性。
本实施例制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的溶血性为1.17％。
本实施例制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架对金黄色葡萄球菌的抗菌率达99.83％，具有良好的抗菌性。
实施例5
用超纯水配置10mL浓度为称取10mM的纳米铜溶液，磁力搅拌器于常温条件下搅拌至均匀。逐渐加入250mg的羧甲基壳聚糖和250mg海藻酸钠，磁力搅拌器于常温条件下搅拌至完全溶解。将上述混合溶液加入48孔培养板中，放入-80℃冰箱中冷冻过夜。将48孔板移至冻干机内冻干48h。加入2％CaCl2溶液交联30min，超纯水清洗3次。放入-80℃冰箱中冷冻过夜，使用冻干机冻干24h后得到支架，即为含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架。
本实施例制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架与空白培养板相比，在1、3、7天的相对细胞活性分别为88.25％、105.83％和98.61％，所制备材料无细胞毒性。
本实施例制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的溶血性为1.64％。
本实施例制备的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架对金黄色葡萄球菌的抗菌率达99.91％，具有良好的抗菌性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用超纯水配制纳米铜溶液；
(2)将羧甲基壳聚糖和海藻酸钠加入步骤(1)制得的纳米铜溶液中，混合均匀，得到混合溶液；
(3)将步骤(2)得到的混合溶液冻干，得到冻干后的初始支架；
(4)向步骤(3)得到的冻干后的初始支架中加入CaCl2溶液交联，清洗，得到交联后的支架；
(5)将步骤(4)得到的交联后的支架冻干，即得所述含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠抗菌骨修复支架。
2.根据权利要求1所述的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，纳米铜溶液的浓度为0.01-10mM。
3.根据权利要求1所述的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，混合溶液中，羧甲基壳聚糖的浓度为0.5-2.5％w/v，海藻酸钠的浓度为0.5-2.5％w/v。
4.根据权利要求3所述的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的重量比为1:1。
5.根据权利要求1所述的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)通过以下步骤实施：将混合溶液移入容器中，-80℃冷冻过夜后，移至冻干机内冻干；
优选地，所述步骤(3)中，冻干时间为45～50h，更优选为48h。
6.根据权利要求1所述的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，CaCl2溶液的浓度为1.5～2.5％，优选为2％。
7.根据权利要求6所述的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，交联时间为25～35min，优选为30min。
8.根据权利要求1所述的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，冻干时间为20～30h，优选为24h。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法制备得到的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架。
10.根据权利要求9所述的含铜羧甲基壳聚糖-海藻酸钠支架作为抗菌骨修复材料的应用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108333009A (zh) * 2018-02-01 2018-07-27 福州大学 柔性海藻酸钠-金纳米粒子复合材料的制备及其应用
CN109529116A (zh) * 2019-01-29 2019-03-29 中国海洋大学 一种用于治疗烫伤的ns-gam基因活性支架及其制备方法
CN111375067A (zh) * 2020-03-18 2020-07-07 四川大学 一种壳聚糖支架及其制备方法和应用
CN113980911A (zh) * 2021-10-13 2022-01-28 天津大学 富集病毒的微马达的制备方法及其应用

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