CN109732097B - 一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，包括以下步骤：将0.5‑1.5mol/L氯化镍水溶液与乙二醇按体积比为1:8‑10的比例混合，即为组分A；将氢氧化钠与乙二醇按重量比为1‑10:96的比例混合，搅拌，加入一水合肼至一水合肼的浓度为0.05‑0.3mol/L，即为组分B；然后将组分A与组分B反应生成镍纳米线，再经过SiO2的包覆和氨基化或羧基化即制备得到本发明所述的一维磁性纳米线。相比现有技术中的磁性微球，本发明所述一维磁性纳米线的比磁化强度具有数量级的提高，磁性捕获分离效率高，比表面积明显增大，检测灵敏度明显增强，另外，还可以提供多靶标标记，为开发多标记物同时检测方法提供基础材料。
Description
技术领域
本发明属于生化材料领域，特别涉及一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法。
背景技术
在生化分析领域，如细胞富集、蛋白分离纯化、免疫分析、体外检测等，用磁性材料作为载体，在其表面标记特定功能分子后用于从样品中高效分离或检测特定组分，是一种特异高效的方法。如以80年代开始商品化的
为例，在磁性微球表面结合具有生物活性的专一性抗体，就可以得到免疫磁性微球，在外加磁场的作用下，利用抗体和细胞的结合，就可快速有效地将细胞分离或进行免疫分析。但用该磁性微球进行的细胞分离或进行免疫分析灵敏度低。专利CN103134926则是以纳米四氧化三铁为磁性颗粒与聚合物或氧化硅颗粒组合成微球，微球表面带有氨基、羧基、巯基、或羟基功能集团。虽然该专利所述的磁性微球对分子或细胞的检测灵敏度有所提升，但是还是不足，而且该专利所述磁性微球制备过程过于复杂，反应时间长，而且添加的试剂种类繁多。
因此，提供一种灵敏度高的磁性材料且制备过程简单，耗时短是非常必要的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种灵敏度很高的可用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法。本发明所述一维磁性纳米线在生化分析过程中的灵敏度明显高于传统的磁性微球，而且制备过程简单，耗时短，十分适合工业生产和实际生化分析的需要。
一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，包括以下步骤：
(1)组分A和组分B的制备：将0.5-1.5mol/L(优选1mol/L)氯化镍水溶液与乙二醇按体积比为1:8-10(优选1:9)的比例混合，即为组分A；将氢氧化钠粉末与乙二醇按重量比为1-10:96(优选3-8:96，进一步优选4:96)的比例混合，用磁力搅拌器在常温下搅拌，然后加入还原剂一水合肼(N2H4·H2O)至一水合肼的浓度为0.05-0.3mol/L(优选0.15-0.25mol/L，进一步优选0.2mol/L)，停止搅拌，获得组分B；
(2)制备镍纳米线：将组分B置于0.02-0.1T(优选0.05T)均匀磁场下(所述磁场方向优选水平方向，该方式容易得到又细又长的纳米线，因为反应只在NiCl2滴加进去并发生沉降扩散的附近发生，不会发生过量，因此Ni纳米线是在受控的环境中逐渐生长出来的。如果磁场改为垂直，则生成的纳米线没有水平磁场细长。)边搅拌边往组分B中缓慢滴加组分A进行反应，组分B与组分A的体积比为5-15:1(优选9:1)，反应的温度为60-150℃(优选70-120℃，进一步优选90℃)，反应5-12分钟(优选10分钟)，然后用磁铁收集镍纳米线并用蒸馏水清洗3-10次，即制得镍纳米线；
(3)镍纳米线的SiO2包覆：采用溶胶凝胶法包覆步骤(2)中制得的镍纳米线，具体过程为：将步骤(2)中制得的镍纳米线加入到正硅酸乙脂(Si(OC2H5)4)与乙二醇甲醚(HOCH2CH2OCH3)按体积比为1:7-12(优选1:9)混合的溶液中(镍纳米线与正硅酸乙脂和乙二醇甲醚的混合溶液的重量比为1:5-100，即保证正硅酸乙脂和乙二醇甲醚的混合溶液相对于镍纳米线过量即可。)，在50-65℃(优选60℃)下搅拌0.5-1.5小时(优选1小时)(反应的方程式为：Si(OC2H5)4+2H2O→SiO2+4C2H5OH)然后过滤，将得到的镍纳米线置于真空条件(真空度<0.01mTorr)中，在350-450℃(优选400℃)下老化1.5-2.5小时(优选2小时)，然后在500-600℃(优选550℃)下退火2-3.5小时(优选3小时)，制得SiO2包覆的镍纳米线；
(4)氨基化或羧基化：氨基化修饰过程为：将二氧化硅分散在乙醇中，加入APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)以及步骤(3)制得的SiO2包覆的镍纳米线，70-85℃(优选80℃)回流2-3.5小时(优选3小时)，制得本发明所述的用于生化分析的一维磁性纳米线。(所述羧基化过程属于本领域技术人员常用的)
步骤(2)中所得镍纳米线的长径比大于100。
步骤(2)中缓慢滴加的具体速度为用胶头滴管按照2-5mL/分钟的速度进行滴加。
步骤(1)中在制备组分B时加入的NaOH可以显著加快步骤(2)中组分B与组分A的反应速度，而且浓度越高反应速度越快。用肼每还原1mol Ni2+需要消耗2mol OH-:2Ni2++N2H4·H2O+4OH-→2Ni+N2+5H2O。
步骤(3)中用SiO2层包覆镍纳米线有两个好处：第一、SiO2包裹起隔绝镍金属直接与溶液接触，增加产品稳定性和生物兼容性；第二、SiO2层的存在便于进一步进行氨基、羧基等各种表面修饰。步骤(3)中通过反应生成一薄层SiO2均匀包裹在镍纳米线表面，通过控制反应条件和时间可以实现均一、厚度可控。普通SiO2是固体，无法直接用于包裹。
步骤(3)中SiO2包覆层厚度在1-100nm。
步骤(4)是为了在经SiO2包覆后的镍纳米线表面共价结合上抗体、蛋白等生物分子，因此需要对SiO2包覆的镍纳米线表面进行氨基化或羧基化修饰，所用氨基化或羧基化修饰方法为常规方法。
步骤(4)中按重量计，二氧化硅、乙醇、APTES以及SiO2包覆的镍纳米线四者之间的用量比为1:40-60:1:1(优选1:50:1)。
相比于现有技术中的磁性微球，本发明所述一维磁性纳米线的有益效果如下：
(1)磁性微球的比磁化强度(又叫比饱和磁化强度(specific saturationmagnetization),常用单位是emu/g)太小，在外加磁场下响应弱导致磁性微球的磁性捕获分离效率低，本发明所述一维磁性纳米线的比磁化强度具有数量级的提高；通常磁性微球的比磁化强度为几个emg/g，本发明所述一维磁性纳米线则高达40emu/g或更多，在外加磁场下响应强，磁性捕获分离效率高；
(2)本发明所述一维磁性纳米线的比表面积远远高于磁性微球的比表面积，在生化分析过程中可以结合更多的抗原或抗体、蛋白质等生物分子标记物，明显增强检测灵敏度；具体的，以直径2μm的磁性微球为例，它的体积是4π/3μm3表面积是4πμm2，同样体积的材料变成直径200nm长度为100μm的线，其表面积则为20.2μm2，比表面增大5倍。
(3)本发明所述一维磁性纳米线具有不对称性，可以提供多靶标标记，为开发多标记物同时检测方法提供基础材料(一维磁性纳米线具有不对称性是由于表面氨基或羧基的分布不对称引起的，从而可以提供多靶标，能同时与多标记物作用)。
附图说明
图1为实施例2制备的一维磁性纳米线在外加磁场下的聚集响应图。
图2为实施例2制备的一维磁性纳米线的扫描电镜(SEM)图。
图3为实施例2制备的一维磁性纳米线同时检测两种标记物的示意图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更清楚明白本发明所述技术方案，以下列举一些实施例。
实施例1
一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，包括以下步骤：
(1)组分A和组分B的制备：将0.5mol/L氯化镍水溶液与乙二醇按体积比为1:8的比例混合，即为组分A；将氢氧化钠粉末与乙二醇按重量比为1:96的比例混合，用磁力搅拌器搅拌，然后加入还原剂一水合肼至一水合肼的浓度为0.05mol/L，停止搅拌，获得组分B；
(2)制备镍纳米线：将组分B置于0.02T均匀磁场下，边搅拌边往组分B中缓慢滴加组分A进行反应，组分B与组分A的体积比为5:1，反应的温度为60℃，反应10分钟，然后用磁铁收集镍纳米线并用蒸馏水清洗3次，即制得镍纳米线；
(3)镍纳米线的SiO2包覆：采用溶胶凝胶法包覆步骤(2)中制得的镍纳米线，具体过程为：将步骤(2)中制得的镍纳米线加入到正硅酸乙脂与乙二醇甲醚按体积比为1:7混合的溶液中，在50℃下搅拌0.5小时，然后过滤，将得到的镍纳米线置于真空条件中，在350-450℃下老化1.5小时，然后在500℃下退火2小时，制得SiO2包覆的镍纳米线；
(4)氨基化：氨基化修饰过程为：将二氧化硅分散在乙醇中，加入APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)以及步骤(3)制得的SiO2包覆的镍纳米线(按重量计，二氧化硅、乙醇、APTES以及SiO2包覆的镍纳米线四者之间的用量比为1:50:1:1)，70-85℃下回流2小时，制得本发明所述的用于生化分析的一维磁性纳米线。
实施例2
一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，包括以下步骤：
(1)组分A和组分B的制备：将1mol/L氯化镍水溶液与乙二醇按体积比为1:9的比例混合，即为组分A；将氢氧化钠粉末与乙二醇按重量比为4:96的比例混合，用磁力搅拌器搅拌，然后加入还原剂一水合肼(N2H4·H2O)至一水合肼的浓度为0.2mol/L，停止搅拌，获得组分B；
(2)制备镍纳米线：将组分B置于0.05T均匀磁场下，边搅拌边往组分B中缓慢滴加组分A进行反应，组分B与组分A的体积比为9:1，反应的温度为90℃，反应10分钟，然后用磁铁收集镍纳米线并用蒸馏水清洗8次，即制得镍纳米线；
(3)镍纳米线的SiO2包覆：采用溶胶凝胶法包覆步骤(2)中制得的镍纳米线，具体过程为：将步骤(2)中制得的镍纳米线加入到正硅酸乙脂(Si(OC2H5)4)与乙二醇甲醚(HOCH2CH2OCH3)按体积比为1:9混合的溶液中，在60℃下搅拌1小时然后过滤，将得到的镍纳米线置于真空条件中，在400℃下老化2小时，然后在550℃下退火3小时，制得SiO2包覆的镍纳米线；
(4)氨基化：氨基化修饰过程为：将二氧化硅分散在乙醇中，加入APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)以及步骤(3)制得的SiO2包覆的镍纳米线(按重量计，二氧化硅、乙醇、APTES以及SiO2包覆的镍纳米线四者之间的用量比为1:40:1:1)，80℃回流3小时，制得本发明所述的用于生化分析的一维磁性纳米线。
图1为实施例2制备的一维磁性纳米线在外加磁场下的聚集响应图。从图中可以看出，在外界磁铁的作用下，一维磁性纳米线出现了聚集，a图未施加外界磁场，b图为施加了外界磁场，从而b图出现了一维磁性纳米线的聚集现象。
图2为实施例2制备的一维磁性纳米线的扫描电镜(SEM)图。从图中可以看出，制备的一维磁性纳米线的确呈一维线状。
实施例3
一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，包括以下步骤：
(1)组分A和组分B的制备：将1mol/L氯化镍水溶液与乙二醇按体积比为1:9的比例混合，即为组分A；将氢氧化钠粉末与乙二醇按重量比为8:96的比例混合，用磁力搅拌器搅拌，然后加入还原剂一水合肼(N2H4·H2O)至一水合肼的浓度为0.25mol/L，停止搅拌，获得组分B；
(2)制备镍纳米线：将组分B置于0.08T均匀磁场下，边搅拌边往组分B中缓慢滴加组分A进行反应，组分B与组分A的体积比为12:1，反应的温度为95℃，反应10分钟，然后用磁铁收集镍纳米线并用蒸馏水清洗5次，即制得镍纳米线；
(3)镍纳米线的SiO2包覆：采用溶胶凝胶法包覆步骤(2)中制得的镍纳米线，具体过程为：将步骤(2)中制得的镍纳米线加入到正硅酸乙脂(Si(OC2H5)4)与乙二醇甲醚(HOCH2CH2OCH3)按体积比为1:10混合的溶液中，在65℃下搅拌1.5小时然后过滤，将得到的镍纳米线置于真空条件中，在400℃下老化2小时，然后在550℃下退火2小时，制得SiO2包覆的镍纳米线；
(4)氨基化：氨基化修饰过程为：将二氧化硅分散在乙醇中，加入APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)以及步骤(3)制得的SiO2包覆的镍纳米线(按重量计，二氧化硅、乙醇、APTES以及SiO2包覆的镍纳米线四者之间的用量比为1:45:1:1)，70℃回流3小时，制得本发明所述的用于生化分析的一维磁性纳米线。
实施例4
一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，包括以下步骤：
(1)组分A和组分B的制备：将1.5mol/L氯化镍水溶液与乙二醇按体积比为1:10的比例混合，即为组分A；将氢氧化钠粉末与乙二醇按重量比为10:96的比例混合，用磁力搅拌器搅拌，然后加入还原剂一水合肼(N2H4·H2O)至一水合肼的浓度为0.3mol/L，停止搅拌，获得组分B；
(2)制备镍纳米线：将组分B置于0.1T均匀磁场下，边搅拌边往组分B中缓慢滴加组分A进行反应，组分B与组分A的体积比为15:1，反应的温度为150℃，反应12分钟，然后用磁铁收集镍纳米线并用蒸馏水清洗10次，即制得镍纳米线；
(3)镍纳米线的SiO2包覆：采用溶胶凝胶法包覆步骤(2)中制得的镍纳米线，具体过程为：将步骤(2)中制得的镍纳米线加入到正硅酸乙脂与乙二醇甲醚按体积比为7-12混合的溶液中，在65℃下搅拌1.5小时，然后过滤，将得到的镍纳米线置于真空条件中，在450℃下老化2.5小时，然后在600℃下退火3.5小时，制得SiO2包覆的镍纳米线；
(4)氨基化：氨基化修饰过程为：将二氧化硅分散在乙醇中，加入APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)以及步骤(3)制得的SiO2包覆的镍纳米线(按重量计，二氧化硅、乙醇、APTES以及SiO2包覆的镍纳米线四者之间的用量比为1:60:1:1)，85℃回流3.5小时，制得本发明所述的用于生化分析的一维磁性纳米线。
对比例1
对比例1与实施例2相比，除了在步骤(1)中制备组分B过程中不加氢氧化钠粉末外，其余过程完全相同。
产品效果测试
实施例5
以常规的乙肝表面抗原的化学发光检测作为评估本发明所述用于生化分析的一维磁性纳米线检测时的灵敏度的方法。以相同量(如2mg)的本实施例1-4、对比例1制备的用于生化分析的一维磁性纳米线，专利CN103134926制备的磁性微球以及市售的磁性微球为检测物，以乙肝表面抗原为检测对象，根据国际标准EP-17A文件要求，计算对乙肝表面抗原的检出限，结果如表1所示。
表1：
由表1结果可以看出，本发明所述用于生化分析的一维磁性纳米线对乙肝表面抗原的检出限明显低于CN103134926所述磁性微球和市售的磁性微球对乙肝表面抗原的检出限。可见，本发明所述产品的灵敏度更高。另外，由表1中实施例1-4与对比例1的检出限可以看出，在制备组分B过程中添加氢氧化钠粉是很有必要的。
实施例6
用相同量(如10mg)本发明实施例1-4、对比例1制备的用于生化分析的一维磁性纳米线与市售的磁性微球作为载体来分离纯化含有相同量血红蛋白的溶液(溶液中血红蛋白的质量为100mg)，分离提纯3分钟后，称量分离出来的血红蛋白的质量，结果如表2所示。
表2：
从表2数据可以看出，本发明所述的用于生化分析的一维磁性纳米线比市售的磁性微球对血红蛋白的分离提纯效果更好，且在3分钟内的分离率就能超过95％(95/100*100％＝95％)，可见本发明所述产品十分适合于在医学上对血红蛋白的快速分离过程。
实施例7
用本发明实施例2制备的产品来检测混有乙肝表面抗原和H7N9禽流感病毒的待检测液，检测结果显示待检测液中含有乙肝表面抗原和H7N9禽流感病毒。
图3为本发明实施例2制备的产品来检测混有乙肝表面抗原和H7N9禽流感病毒的示意图，其中较粗的“Y”型物为乙肝表面抗原，较细的“Y”型物为H7N9禽流感病毒，与“Y”型物接壤的圆柱状为本发明实施例2制备的一维磁性纳米线。
Claims (10)
1.一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将0.5-1.5mol/L氯化镍水溶液与乙二醇按体积比为1:8-10的比例混合，获得组分A；将氢氧化钠与乙二醇按重量比为1-10:96的比例混合，搅拌，然后加入一水合肼，获得组分B；
(2)制备镍纳米线：将组分B置于磁场中，加入组分A进行反应，得到镍纳米线；所述磁场为水平方向磁场；
(3)镍纳米线的SiO2包覆：将步骤(2)中制得的镍纳米线加入到正硅酸乙脂与乙二醇甲醚按体积比为1:7-12混合的溶液中，在50-65℃下搅拌0.5-1.5小时，过滤，将得到的镍纳米线进行老化和退火处理，制得SiO2包覆的镍纳米线；
(4)氨基化或羧基化：氨基化修饰过程为：将二氧化硅分散在乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷和步骤(3)制得的SiO2包覆的镍纳米线，在70-85℃回流2-3.5小时，制得所述的用于生化分析的一维磁性纳米线。
2.根据权利要求1所述的一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述组分B中一水合肼的浓度为0.05-0.3mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，其特征在于，步骤(2)中磁场的强度为0.02-0.1T。
4.根据权利要求1所述的一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，其特征在于，步骤(2)中组分B与组分A的体积比为5-15:1。
5.根据权利要求1所述的一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，其特征在于，步骤(2)中往组分B中加入组分A的具体过程为：边搅拌边往组分B中滴加组分A，滴加的速度为2-5mL/分钟。
6.根据权利要求1所述的一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，其特征在于，步骤(2)中反应的温度为60-150℃，反应的时间为5-12分钟。
7.根据权利要求1所述的一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将制得的镍纳米线用蒸馏水清洗3-10次。
8.根据权利要求1所述的一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的老化和退火的过程为：将镍纳米线置于真空条件中，在350-450℃下老化1.5-2.5小时，然后在500-600℃下退火2-3.5小时。
9.根据权利要求1所述的一种用于生化分析的一维磁性纳米线的制备方法，其特征在于，步骤(4)中按重量计，二氧化硅、乙醇、APTES以及SiO2包覆的镍纳米线四者之间的用量比为1:40-60:1:1。
10.一种一维磁性纳米线，其特征在于，由权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备得到。
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