JP3575548B2 - 生物材料標識用磁性微粒子並びにその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫検査法、並びに磁石を用いた目的とする細胞の磁気標識や磁気分離あるいは生物体内での薬剤運搬（ドラックデリバリー）等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
後天性免疫不全症候群、成人Ｔ細胞白血病等のような新型ウイルス性疾病、あるいは各種ガンの早期検査法として、抗原抗体反応を利用した免疫測定法の開発が、現在、世界的規模で推進されている。
【０００３】
従来から知られている微量免疫測定法としては、ラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡ法と記す）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）法等が既に実用化されている。これらの方法は、それぞれアイソトープ、酵素、蛍光物質を標識として付加した抗原または抗体を用い、これと特異的に反応する抗体または抗原の有無を検出する方法である。
【０００４】
本発明者らは先に特開昭６３−７９０７０、６３−１０６５５９、６３−１０８２６５、６３−１８８７６６、６３−１８８７６４、６３−３１５９５１、６３−３１５９５２号、特開平１−２９７６８号公報記載のレーザ磁気免疫測定法及び測定装置についての発明を特許出願している。これらの新しい免疫測定法は標識材料として磁性微粒子を用いて、例えば磁気標識された検体の有無を干渉縞から検出する点に特徴があり、アイソトープを用いないでピコグラム以下の超微量検出が可能である。本発明者らは上述のレーザ磁気免疫測定法に基づき、磁性微粒子を抗原あるいは抗体に標識し、初めて、ウイルスの検出等を行なった。
【０００５】
本発明に関わる、デキストラン被覆マグネタイト粒子に関しては、米国特許第４４５２７７３号の”Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ−ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ”として、Ｍｏｌｄａｙの発明がある。この発明はマグネタイト微粒子を核として、その周りにデキストランを被覆し、このデキストランに、プロテインＡあるいは抗体あるいは酵素等を結合したものである。本発明者らはＭｏｌｄａｙの特許で開示されたデキストラン被覆マグネタイト粒子の製造方法を改良し、任意の粒径の磁性微粒子が製造できる方法を発明し、先に特開平３−１４１１１９号公報記載の「磁性微粒子の製造方法」、特開平３−２４２３２７号公報記載の「磁性微粒子の製造方法」を特許出願している。
【０００６】
磁性微粒子を抗原あるいは抗体に標識し、高感度で抗原あるいは抗体を検出するためには、磁性微粒子として飽和磁化が大きく、かつ残留磁化の小さなものが好ましい。何故ならば、飽和磁化が大きなものほど印加磁界に対する応答性が高いためである。例えば、本発明者らが発明した特開平１−２９７６８号公報記載の「レーザ磁気免疫測定法及び装置」では、傾斜磁界中で容器水面上の一点に磁気標識した検体を濃縮しているが、その際、上方に働く磁気吸引力と下方に働く表面張力の２つの力のバランスで形成される、水面上の微小突起の高さをレーザ干渉法で測定する、新しい原理の測定法を発明している。磁気吸引力と表面張力が一定ならば、飽和磁化の大きな磁性微粒子ほど水面上の微小突起の高さは大きくなるから検出感度が向上することになる。また、磁性微粒子の残留磁化が大きい場合は、磁界を取り除いても磁性微粒子が永久磁石となっているから、磁性微粒子がお互いに磁気凝集することになり、溶液中ではすぐに沈澱を生じる。従って、寸法が小さな抗体や抗原を磁気標識する場合、これらの検体が磁性微粒子の凝集塊に埋もれてしまうため、不都合である。
【０００７】
さて、本発明に関わる、フェライト微粒子としては特開昭６１−７７６９９号公報記載の「無機鉄系酸化物の単結晶超微粒子の製法」、特開昭６２−１８５３０５号公報記載の「磁性体超微粒子」がある。このうち後者の発明にはマグネタイトの磁化を凌ぐ、（Ｃｏ−Ｆｅ−Ｚｎ）・Ｆｅ２Ｏ４系のフェライト超微粒子が技術開示されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらのフェライト超微粒子は、▲１▼水溶液中では分散せず、大きな凝集塊となっており、また、▲２▼生物材料と親和性の高い材料が微粒子表面に存在しないため、抗体や抗原と結合することができない等の問題点があった。本発明は、磁気応答性が高く、溶液中で分散安定性が優れ、生物材料と親和性の高い磁性微粒子を新たに提供することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の生物材料標識用磁性微粒子は、（Ｃｏ ｘ −Ｆｅ ｙ −Ｚｎ ｚ ）・Ｆｅ２Ｏ４ （但し、前記組成式中の組成比を示すｘ、ｙ、ｚは、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１なる関係を満たす。）からなるフェライト微粒子であって、該結晶粒子径が５ｎｍから１０ｎｍであり、表面がデキストランで被覆されていることを特徴とするものである。
請求項２記載の生物材料標識用磁性微粒子は、前記フェライト微粒子の組成式中の組成比を示すｘ、ｙ、ｚは、０．４≦ｘ≦０．７、０．２≦ｙ≦０．３６、０．１≦ｚ≦０．２４であることを特徴とする請求項１記載の生物材料標識用磁性微粒子である。
【００１０】
請求項３記載の生物材料標識用磁性微粒子の製造方法は、モル濃度が０．０１から０．１ｍｏｌ／ｌの範囲内にある等モル濃度のＣｏＣｌ２とＦｅＣｌ２とＺｎＣｌ２からなる混合溶液を調製する工程と、前記調製工程のモル濃度の２倍のモル濃度のＦｅＣｌ３溶液を前記混合溶液と等量加える工程と、混合溶液中のデキストラン濃度が０．５ｗｔ％から１５ｗｔ％の範囲内になるようにデキストランを添加する工程と、攪半しながらＮａＯＨを徐々に滴下し、ｐＨ１２以上１３以下で共沈反応を終了する工程と、純水で希釈・攪半して溶液中に分散浮遊したもののみを回収する工程と、デキストラン被覆フェライト微粒子以外の反応生物を限外瀘過あるいはゲル瀘過によって除去する工程とを少なくとも具備することを特徴とする方法である。
【００１１】
以下、本発明を例を挙げて詳しく説明する。
本発明者らは、ＣｏＦｅＺｎフェライトの有する高い飽和磁化を損なわないようにして、デキストランを被覆し、分散安定を図る方法を見い出し、発明を完成させた。デキストランは、上述のＭｏｌｄａｙの発明に見られるごとく、生物分野では古くから抗体、薬剤などの生物・化学材料を固定する材料として知られている。しかしながら、本発明者らが特開平３−２４２３２７号公報記載の「磁性微粒子の製造方法」で技術開示したように、溶液中で分散安定性のよいデキストラン被覆マグネタイト微粒子を製造するためには、製造時の鉄イオン濃度とデキストラン濃度の関係、並びにアルカリ共沈反応のｐＨが重要であり、最適な製造条件を選ばなければ、作製されたものは直ちに沈降が生じてしまう。最適な製造条件で作製されたデキストラン被覆マグネタイト微粒子の場合、４℃で６ヶ月以上放置後も溶液の沈降はほとんど生じない。
【００１２】
さて、特開昭６２−１８５３０５号公報記載の「磁性体超微粒子」によれば、ＣｏＦｅＺｎフェライト微粒子は、現存する粒径１０ｎｍ前後の磁性微粒子の中では、飽和磁化は最高（８０ｅｍｕ／ｇ以上）である。しかし、マグネタイト微粒子と違って、複雑な組成であるため、製造条件によって磁気特性、溶液中の分散安定性が著しく左右されることが、予備実験の過程で明らかになった。例えば、アルカリ共沈時のデキストラン量が０．５ｗｔ％以下である場合、製造半日後には水とフェライト微粒子層の２層に分離し、攪半しても直ちにフェライト微粒子は沈降してしまう。また、デキストラン量が１５ｗｔ％以上では、全体がゲル状になり、希土類磁石を近づけても磁石に反応しない。この溶液を希釈すると水垢のようになり、水溶液中には均一に分散しない。そこで、種々の条件で作製したデキストラン被覆フェライト微粒子のｘ線回折、電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）、磁化測定を実施し、水溶液中での分散安定性を調べた結果、図１に示すように、フェライト結晶粒子径は５ｎｍから１０ｎｍのものが飽和磁化が大きく、水溶液中でも沈降しにくいことが分かった。
【００１３】
すなわち、図１はフェライト結晶粒子径に及ぼすアルカリ共沈時のデキストラン濃度を調べた結果の一例であって、フェライト結晶粒子径はＴＥＭ写真から求めたものである。この図１から、デキストラン濃度が０．５ｗｔ％以下では、フェライト結晶粒子径は１０ｎｍ以上であり、溶液を静置すると１時間以内にフェライト微粒子は凝集・沈降し、水とフェライト微粒子層の２層に分離する領域である。デキストラン濃度が０．５ｗｔ％から１５ｗｔ％の範囲内では、フェライト結晶粒子径は５ｎｍから１０ｎｍの範囲内にあり、磁気特性はマグネタイトよりも優れ、溶液中での分離安定性改善領域である。また、デキストラン無添加の場合、フェライト結晶粒子の平均粒径は１８ｎｍであったが、デキストラン数％添加によって結晶粒径は著しく小さくなり、溶液中での分散安定性が著しく改善される効果があることが本実験で初めて明らかになった。
【００１４】
図２、図３にフェライト結晶粒子の粒子構造の劇的な変化の一例を示す。すなわち、図２は、アルカリ共沈時のデキストラン濃度が０．２４ｗｔ％の場合（後述の比較対照例１）のフェライト結晶粒子の粒子構造を示した電子顕微鏡写真（倍率２２１，０００）であり、結晶粒径が平均粒径２１ｎｍと大きいばかりでなく、大きな凝集塊となっている。一方、図３は、デキストラン濃度が１０ｗｔ％の場合（後述の実施例２）のフェライト結晶粒子の粒子構造を示した電子顕微鏡写真（倍率２２１，０００）であり、結晶粒径は５ｎｍと小さく、かつ、均一に分散している。
【００１５】
ところが、デキストラン濃度が１５ｗｔ％以上では、結晶粒径に変化は見られないが、溶液がゲル状になって、磁気特性が低下した。このように、製造条件の検討にはフェライト結晶粒子径が一つの目安になることが分かった。
【００１６】
次に、磁気特性がマグネタイトよりも優れ、溶液中での分散安定性に優れたデキストラン被覆フェライト微粒子を得るためのその他の製造方法の要点を以下に説明する。
まず、共沈時のｐＨは飽和磁化に影響するからｐＨの管理が重要である。例えば、濃度が０．１ｍｏｌ／ｌであるＣｏＣｌ２とＦｅＣｌ２とＺｎＣｌ２からなる混合溶液を調製し、これに濃度が０．２ｍｏｌ／ｌであるＦｅＣｌ３溶液を等量加え、これに分子量４万のデキストランを加え、水溶液濃度が０．５ｗｔ％から１５ｗｔ％の範囲内で調製した後、攪半しながら徐々にＮＨ４ＯＨを滴下し、共沈反応を行なった結果、ｐＨ１１で反応を終了して得られたものは、色は黒褐色で、希土類磁石を溶液に近づけても磁石に反応しなかった。一方、ＮＨ４ＯＨの替わりに、ＮａＯＨを使用し、ｐＨ１２から１３で反応を終了して得られたものは、色は同じ黒褐色であるが磁石に鋭敏に反応するものが得られた。電子顕微鏡でフェライト結晶粒子径を観察した結果、平均粒子径５ｎｍから１０ｎｍであっ
た。
【００１７】
さらに、２価の塩化物（ＣｏＣｌ２−ＦｅＣｌ２−ＺｎＣｌ２）と３価の塩化物（ＦｅＣｌ３）の混合比は、１：２が最も好ましく、これら塩化物の濃度によって結晶粒径が制御され、２価の塩化物濃度が０．０１ｍｏｌ／ｌから０．１ｍｏｌ／ｌの範囲であると、結晶粒径５ｎｍから１０ｎｍのものが得られる。０．０１ｍｏｌ／ｌ以下の濃度では、磁気特性が不十分であり、０．１ｍｏｌ／ｌでは凝集が顕著になり使用に適さない。
【００１８】
２価の塩化物（ＣｏＣｌ２−ＦｅＣｌ２−ＺｎＣｌ２）の混合比は、種々の組み合せが考えられるが、Ｃｏ添加は結晶磁気異方性を高めるために最も効果的であるから、４０％以上７０％以下の添加が好ましい。Ｚｎ添加は飽和磁化向上効果があるから、１０％以上２５％以下の添加が好ましい。このように、ＣｏとＺｎをＦｅに複合添加することによって、Ｆｅ単独、すなわち、Ｆｅ３Ｏ４（マグネタイト）よりも飽和磁化は約２倍の８０ｅｍｕ／ｇ台が得られた。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明する。
［実施例１］
０．２ｍｏｌ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、０．１ｍｏｌ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２をそれぞれ４ｍｌ、３．６ｍｌ、２．４ｍｌを２００ｍｌのビーカに混合し、これに予め溶解しておいた５０ｗｔ％デキストラン水溶液（デキストラン分子量：４万）を５ｍｌ加え、混合溶液２１ｍｌを調製した。該混合溶液中のデキストラン濃度は１０ｗｔ％であった。次に、攪半機を用いて攪半しながら、３ＮのＮａＯＨを７５ｍｌ徐々に加え、約１０分で全量を滴下した。この時の溶液のｐＨは１２．１であり、黒褐色の溶液が得られた。続いて、６０℃の恒温槽に１時間入れ、熟成させた。この溶液は室温で１時間静置したが、沈降は全く生じなかった。次に、未反応のデキストラン及び、反応生成物のＮａＣｌを除去するために、５０ｍｌを取り、純水で希釈して全量１リットルとした後、限外瀘過機（商品名 Ｍｉｎｔａｎ、ミリポア社製）を用いて、分子量１０万のフィルターで１００ｍｌまで濃縮し、さらに純水９００ｍｌを加え、限外瀘過する操作を３回繰り返し、回収液５０ｍｌを得た。本デキストラン被覆フェライト微粒子の組成は、Ｃｏ０．４Ｆｅ０．３６Ｚｎ０．２４・Ｆｅ２Ｏ４であった。
【００２０】
［実施例２］
０．１ｍｏｌ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、０．０５ｍｏｌ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２をそれぞれ６ｍｌ、２．８ｍｌ、１．２ｍｌを２００ｍｌのビーカに混合し、これに予め溶解しておいた５０ｗｔ％デキストラン水溶液（デキストラン分子量：４万）を５ｍｌ加え、混合溶液２５ｍｌを調製した。該混合溶液中のデキストラン濃度は１０ｗｔ％であった。次に、攪半機を用いて攪半しながら、３ＮのＮａＯＨを７５ｍｌ徐々に加え、約１０分で全量を滴下した。この時の溶液のｐＨは１２．１であり、黒褐色の溶液が得られた。続いて、６０℃の恒温槽に１時間入れ、熟成させた。この溶液は室温で１時間静置したが、沈降は全く生じなかった。実施例１と同様に限外瀘過を実施し、回収液５０ｍｌを得た。本デキストラン被覆フェライト微粒子の組成は、Ｃｏ０．６Ｆｅ０．２８Ｚｎ０．１２・Ｆｅ２Ｏ４であった。
【００２１】
［実施例３］
０．２ｍｏｌ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、０．１ｍｏｌ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２をそれぞれ４ｍｌ、３．６ｍｌ、２．４ｍｌを２００ｍｌのビーカに混合し、これに予めアミノ化処理し、溶解しておいた５０ｗｔ％アミノ化デキストラン水溶液（デキストラン分子量：４万）を２ｍｌ加え、混合溶液２２ｍｌを調製した。該混合溶液中のデキストラン濃度は４．８ｗｔ％であった。次に、攪半機を用いて攪半しながら、３ＮのＮａＯＨを７５ｍｌ徐々に加え、約１０分で全量を滴下した。この時の溶液のｐＨは１２．３であり、黒褐色の溶液が得られた。続いて、６０℃の恒温槽に１時間入れ、熟成させた。この溶液は室温で１時間静置したが、沈降は全く生じなかった。実施例１と同様に限外瀘過を実施し、回収液５０ｍｌを得た。本デキストラン被覆フェライト微粒子の組成は、Ｃｏ０．４Ｆｅ０．３６Ｚｎ０．２４・Ｆｅ２Ｏ４であった
。
【００２２】
［実施例４］
０．０２ｍｏｌ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、０．０１ｍｏｌ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２をそれぞれ７ｍｌ、２ｍｌ、１ｍｌを２００ｍｌのビーカに混合し、これに予め溶解しておいた５ｗｔ％デキストラン水溶液（デキストラン分子量：４万）を３ｍｌ加え、混合溶液２３ｍｌを調製した。該混合溶液中のデキストラン濃度は０．６５ｗｔ％であった。次に、攪半機を用いて攪半しながら、３ＮのＮａＯＨを７５ｍｌ徐々に加え、約１０分で全量を滴下した。この時の溶液のｐＨは１２．６であり、黒褐色の溶液が得られた。続いて、６０℃の恒温槽に１時間入れ、熟成させた。この溶液は室温で１時間静置したが、沈降は全く生じなかった。実施例１と同様に限外瀘過を実施し、回収液５０ｍｌを得た。本デキストラン被覆フェライト微粒子の組成は、Ｃｏ０．７Ｆｅ０．２Ｚｎ０．１・Ｆｅ２Ｏ４であった。
【００２３】
［比較対照例１］
０．２ｍｏｌ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、０．１ｍｏｌ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２をそれぞれ４ｍｌ、３．６ｍｌ、２．４ｍｌを２００ｍｌのビーカに混合し、これに予め溶解しておいた５ｗｔ％デキストラン水溶液（デキストラン分子量：４万）を１ｍｌ加え、混合溶液２１ｍｌを調製した。該混合溶液中のデキストラン濃度は０．２４ｗｔ％であった。次に、攪半機を用いて攪半しながら、３ＮのＮａＯＨを７５ｍｌ徐々に加え、約１０分で全量を滴下した。この時の溶液のｐＨは１２．６であり、黒褐色の溶液が得られた。続いて、６０℃の恒温槽に１時間入れ、熟成させた。本デキストラン被覆フェライト微粒子の組成は、Ｃｏ０．４Ｆｅ０．３６Ｚｎ０．２４・Ｆｅ２Ｏ４であった。この溶液を室温で半日静置したところ、フェライト微粒子と水の２層に完全に分離し、フェライト微粒子の溶液中への分散は図れなかった。
【００２４】
なお、デキストラン濃度を徐々に増やした実験の結果、デキストラン濃度０．５ｗｔ％まではデキストラン濃度と共にフェライト結晶粒子径は急激に減少すること、同濃度（フェライト結晶粒子径１０ｎｍのものが得られる）を境として、０．５ｗｔ％以上では生成したデキストラン被覆フェライト微粒子の溶液中での分散安定性が著しく改善される結果が得られた。
しかし、デキストラン濃度が１５ｗｔ％以上では、共沈後の溶液はゲル状になり、永久磁石に反応するものが得られなかった。
【００２５】
［比較対照例２］
０．２ｍｏｌ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、０．１ｍｏｌ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２をそれぞれ４ｍｌ、３．６ｍｌ、２．４ｍｌを２００ｍｌのビーカに混合し、デキストランを添加しないで混合溶液２０ｍｌを調製した。次に、攪半機を用いて攪半しながら、３ＮのＮａＯＨを７５ｍｌ徐々に加え、約１０分で全量を滴下した。この時の溶液のｐＨは１２．５であり、黒褐色の溶液が得られた。続いて、６０℃の恒温槽に１時間入れ、熟成させた。本フェライト微粒子の組成は、Ｃｏ０．４Ｆｅ０．３６Ｚｎ０．２４・Ｆｅ２Ｏ４であった。この溶液は室温では、フェライト微粒子の沈降が顕著であり、放置時間とともに沈澱量も増加した。上清部に純水を加え、沈澱を捨てる、いわゆるデカンテーション操作を繰り返したが、分散安定した水溶液は得られなかった。
【００２６】
つぎに、上記実施例で作製したデキストラン被覆フェライト微粒子および比較対照例で作製したフェライト微粒子の諸特性をｘ線回折、磁化測定、並びに上述のレーザ磁気免疫測定法で調べた結果を次に述べる。
図４はデキストラン濃度０％の比較対照例２のフェライト微粒子のＸ線回折パターンを示したグラフ、図５はデキストラン濃度４．８ｗｔ％の実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子のｘ線回折パターンを示したグラフである。溶液状の試料を乾燥させ、メノウ乳鉢で微粉末とした後、Ｃｕターゲットを使用して、４０ｋｖ、２００ｍＡの条件で測定した。回折スペクトルの上方の数値は、ピークを示す２θ値（度）である。比較対照例２のフェライト微粒子のＸ線回折パターンと実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子のＸ線回折パターンの比較から、誤差０．６％以内で両方のスペクトルの２θ値は一致している。本発明の生物材料標識用磁性微粒子の製造方法に従えば、デキストラン共存下で共沈反応させても、コアとなるフェライト微粒子の結晶は同じ物が作製できていることが分かる。なお、比較対照例２のフェライト微粒子のＸ線回折パターンに比べ、実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子のＸ線回折パターンのスペクトルの半値幅が広い理由は、よく知られているように、結晶粒径が小さいためである。この半値幅からＳｃｈｅｒｒｅｒの式にしたがって、結晶粒径を求めると、実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子の場合、平均粒径５．６ｎｍとなり、上述のＴＥＭから求めた値と一致した。
【００２７】
次に、振動式磁化測定装置（ＶＳＭ）による磁化測定結果の一例を説明する。磁化曲線の一例として、図６に実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子を用いた場合の実験データを示す。室温、１０ｋＯｅで測定した。本発明のデキストラン被覆フェライト粒子は、総べてこの図６のように、ヒステリシスすなわち残留磁化が無いことが特徴である。このため磁気的に凝集することがない。比較対照例２と実施例３の試料を乾燥後、微粉末状にして乾燥重量を求めると、磁化は各々、８０ｅｍｕ／ｇ、３８ｅｍｕ／ｇであった。実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子の磁化が比較対照例２のフェライト単体よりも小さい理由は、前述のように結晶粒径が小さいためと（磁化が結晶粒径の影響を受けることは公明である）、フェライトに結合したデキストランの増量効果によるものである。一方、本発明者らが技術開示した、特開平３−２４２３２７号公報記載の「磁性微粒子の製造方法」に基づいて作製したデキストラン被覆マグネタイト微粒子の場合、磁化は１０ｅｍｕ／ｇ前後、そしてマグネタイト単体の場合、磁化は４４ｅｍｕ／ｇであった。実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子とデキストラン被覆マグネタイト微粒子の磁化を比較すると、３倍以上高いことから、本発明が優れていることが明らかである。
【００２８】
図７は本発明者らが発明したレーザ磁気免疫測定装置を用いて、実施例１および３のデキストラン被覆マグネタイト、比較対照例２のフェライト微粒子、並びに上述の酸化デキストラン被覆マグネタイト微粒子（デキストランを過ヨウ素酸化した）の干渉縞中心光強度測定結果の一例を示した図である。既知濃度（乾燥重量から求めた）の試料を対象にして、純水で２倍希釈列をつくり、１０μｌを測定機にかけて６０秒後の干渉縞の中心強度を測定した。縦軸の値は、ＣＣＤカメラの出力を８ビットＡ／Ｄ変換器で変換した値であって、光強度の飽和値は２５５である。この図７から、従来の酸化デキストラン被覆マグネタイト微粒子よりも１桁以上微量のデキストラン被覆フェライト微粒子が検出できることが分かる。この結果は、上述の磁化測定結果と一致する。なお、比較対照例２のフェライト微粒子単体の場合、磁化が大きいため、さらに微量まで検出できるが、溶液中では凝集・沈降が著しいため免疫診断用としては使用に耐えない。
【００２９】
以上のデキストラン被膜フェライト微粒子の製造方法の説明では、未結合のデキストラン並びにＮａＣｌ等を除去するために、限外瀘過法を用いた例を述べた。限外瀘過法は大量の試料を処理するのに適した方法であるが、試料が少量の場合、一般に用いられているゲル瀘過法で実施することも可能である。
【００３０】
【発明の効果】
本発明の生物材料標識用磁性微粒子を用いれば、磁気特性が従来の如何なる材料よりも優れており、かつ溶液中の分散安定性も優れているから、免疫診断分野に用いれば迅速・高感度診断が可能となる。例えば、本発明者らによるレーザ磁気免疫測定法に適用すれば、同一磁界中ではレーザ干渉縞の本数が増加するから検出感度、精度が向上する。あるいは、検出感度を同じにした場合、電磁石をより小型化できるから装置の小型化を図ることが出来る。
【００３１】
さらに、磁石を用いた細胞の磁気分離や磁石誘導による薬剤運搬（ドラックデリバリー）の分野に用いれば、磁石応答性が優れているため、分離時間、運搬時間等の短縮が可能となる。また細胞の磁気標識に用いれば、粒子径が１０ｎｍ以下であり、かつ分散性に優れているため、標識の分解能が向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】アルカリ共沈時のデキストラン濃度とフェライト結晶粒子径の関係を示したグラフである。
【図２】比較対照例１（アルカリ共沈時のデキストラン濃度が０．２４ｗｔ％の場合）のフェライト結晶粒子の粒子構造を示した電子顕微鏡写真である。
【図３】実施例２（アルカリ共沈時のデキストラン濃度が１０ｗｔ％の場合）のフェライト結晶粒子の粒子構造を示した電子顕微鏡写真である。
【図４】比較対照例２のフェライト微粒子のｘ線回折パターンを示したグラフである。
【図５】実施例３のデキストラン被膜フェライト微粒子のｘ線回折パターンを示したグラフである。
【図６】実施例３のデキストラン被膜フェライト微粒子の磁化曲線を示した図である。
【図７】レーザ磁気免疫測定装置を用いて、実施例１および３のデキストラン被膜フェライト微粒子、比較対照例２のフェライト微粒子、並びに上述の酸化デキストラン被覆マグネタイト微粒子（デキストランを過ヨウ素酸化した）の干渉縞中心光強度の測定結果の一例を示した図である。
【産業上の利用分野】
本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫検査法、並びに磁石を用いた目的とする細胞の磁気標識や磁気分離あるいは生物体内での薬剤運搬（ドラックデリバリー）等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
後天性免疫不全症候群、成人Ｔ細胞白血病等のような新型ウイルス性疾病、あるいは各種ガンの早期検査法として、抗原抗体反応を利用した免疫測定法の開発が、現在、世界的規模で推進されている。
【０００３】
従来から知られている微量免疫測定法としては、ラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡ法と記す）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）法等が既に実用化されている。これらの方法は、それぞれアイソトープ、酵素、蛍光物質を標識として付加した抗原または抗体を用い、これと特異的に反応する抗体または抗原の有無を検出する方法である。
【０００４】
本発明者らは先に特開昭６３−７９０７０、６３−１０６５５９、６３−１０８２６５、６３−１８８７６６、６３−１８８７６４、６３−３１５９５１、６３−３１５９５２号、特開平１−２９７６８号公報記載のレーザ磁気免疫測定法及び測定装置についての発明を特許出願している。これらの新しい免疫測定法は標識材料として磁性微粒子を用いて、例えば磁気標識された検体の有無を干渉縞から検出する点に特徴があり、アイソトープを用いないでピコグラム以下の超微量検出が可能である。本発明者らは上述のレーザ磁気免疫測定法に基づき、磁性微粒子を抗原あるいは抗体に標識し、初めて、ウイルスの検出等を行なった。
【０００５】
本発明に関わる、デキストラン被覆マグネタイト粒子に関しては、米国特許第４４５２７７３号の”Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ−ｄｅｘｔｒａｎ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ”として、Ｍｏｌｄａｙの発明がある。この発明はマグネタイト微粒子を核として、その周りにデキストランを被覆し、このデキストランに、プロテインＡあるいは抗体あるいは酵素等を結合したものである。本発明者らはＭｏｌｄａｙの特許で開示されたデキストラン被覆マグネタイト粒子の製造方法を改良し、任意の粒径の磁性微粒子が製造できる方法を発明し、先に特開平３−１４１１１９号公報記載の「磁性微粒子の製造方法」、特開平３−２４２３２７号公報記載の「磁性微粒子の製造方法」を特許出願している。
【０００６】
磁性微粒子を抗原あるいは抗体に標識し、高感度で抗原あるいは抗体を検出するためには、磁性微粒子として飽和磁化が大きく、かつ残留磁化の小さなものが好ましい。何故ならば、飽和磁化が大きなものほど印加磁界に対する応答性が高いためである。例えば、本発明者らが発明した特開平１−２９７６８号公報記載の「レーザ磁気免疫測定法及び装置」では、傾斜磁界中で容器水面上の一点に磁気標識した検体を濃縮しているが、その際、上方に働く磁気吸引力と下方に働く表面張力の２つの力のバランスで形成される、水面上の微小突起の高さをレーザ干渉法で測定する、新しい原理の測定法を発明している。磁気吸引力と表面張力が一定ならば、飽和磁化の大きな磁性微粒子ほど水面上の微小突起の高さは大きくなるから検出感度が向上することになる。また、磁性微粒子の残留磁化が大きい場合は、磁界を取り除いても磁性微粒子が永久磁石となっているから、磁性微粒子がお互いに磁気凝集することになり、溶液中ではすぐに沈澱を生じる。従って、寸法が小さな抗体や抗原を磁気標識する場合、これらの検体が磁性微粒子の凝集塊に埋もれてしまうため、不都合である。
【０００７】
さて、本発明に関わる、フェライト微粒子としては特開昭６１−７７６９９号公報記載の「無機鉄系酸化物の単結晶超微粒子の製法」、特開昭６２−１８５３０５号公報記載の「磁性体超微粒子」がある。このうち後者の発明にはマグネタイトの磁化を凌ぐ、（Ｃｏ−Ｆｅ−Ｚｎ）・Ｆｅ２Ｏ４系のフェライト超微粒子が技術開示されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらのフェライト超微粒子は、▲１▼水溶液中では分散せず、大きな凝集塊となっており、また、▲２▼生物材料と親和性の高い材料が微粒子表面に存在しないため、抗体や抗原と結合することができない等の問題点があった。本発明は、磁気応答性が高く、溶液中で分散安定性が優れ、生物材料と親和性の高い磁性微粒子を新たに提供することを目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の生物材料標識用磁性微粒子は、（Ｃｏ ｘ −Ｆｅ ｙ −Ｚｎ ｚ ）・Ｆｅ２Ｏ４ （但し、前記組成式中の組成比を示すｘ、ｙ、ｚは、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１なる関係を満たす。）からなるフェライト微粒子であって、該結晶粒子径が５ｎｍから１０ｎｍであり、表面がデキストランで被覆されていることを特徴とするものである。
請求項２記載の生物材料標識用磁性微粒子は、前記フェライト微粒子の組成式中の組成比を示すｘ、ｙ、ｚは、０．４≦ｘ≦０．７、０．２≦ｙ≦０．３６、０．１≦ｚ≦０．２４であることを特徴とする請求項１記載の生物材料標識用磁性微粒子である。
【００１０】
請求項３記載の生物材料標識用磁性微粒子の製造方法は、モル濃度が０．０１から０．１ｍｏｌ／ｌの範囲内にある等モル濃度のＣｏＣｌ２とＦｅＣｌ２とＺｎＣｌ２からなる混合溶液を調製する工程と、前記調製工程のモル濃度の２倍のモル濃度のＦｅＣｌ３溶液を前記混合溶液と等量加える工程と、混合溶液中のデキストラン濃度が０．５ｗｔ％から１５ｗｔ％の範囲内になるようにデキストランを添加する工程と、攪半しながらＮａＯＨを徐々に滴下し、ｐＨ１２以上１３以下で共沈反応を終了する工程と、純水で希釈・攪半して溶液中に分散浮遊したもののみを回収する工程と、デキストラン被覆フェライト微粒子以外の反応生物を限外瀘過あるいはゲル瀘過によって除去する工程とを少なくとも具備することを特徴とする方法である。
【００１１】
以下、本発明を例を挙げて詳しく説明する。
本発明者らは、ＣｏＦｅＺｎフェライトの有する高い飽和磁化を損なわないようにして、デキストランを被覆し、分散安定を図る方法を見い出し、発明を完成させた。デキストランは、上述のＭｏｌｄａｙの発明に見られるごとく、生物分野では古くから抗体、薬剤などの生物・化学材料を固定する材料として知られている。しかしながら、本発明者らが特開平３−２４２３２７号公報記載の「磁性微粒子の製造方法」で技術開示したように、溶液中で分散安定性のよいデキストラン被覆マグネタイト微粒子を製造するためには、製造時の鉄イオン濃度とデキストラン濃度の関係、並びにアルカリ共沈反応のｐＨが重要であり、最適な製造条件を選ばなければ、作製されたものは直ちに沈降が生じてしまう。最適な製造条件で作製されたデキストラン被覆マグネタイト微粒子の場合、４℃で６ヶ月以上放置後も溶液の沈降はほとんど生じない。
【００１２】
さて、特開昭６２−１８５３０５号公報記載の「磁性体超微粒子」によれば、ＣｏＦｅＺｎフェライト微粒子は、現存する粒径１０ｎｍ前後の磁性微粒子の中では、飽和磁化は最高（８０ｅｍｕ／ｇ以上）である。しかし、マグネタイト微粒子と違って、複雑な組成であるため、製造条件によって磁気特性、溶液中の分散安定性が著しく左右されることが、予備実験の過程で明らかになった。例えば、アルカリ共沈時のデキストラン量が０．５ｗｔ％以下である場合、製造半日後には水とフェライト微粒子層の２層に分離し、攪半しても直ちにフェライト微粒子は沈降してしまう。また、デキストラン量が１５ｗｔ％以上では、全体がゲル状になり、希土類磁石を近づけても磁石に反応しない。この溶液を希釈すると水垢のようになり、水溶液中には均一に分散しない。そこで、種々の条件で作製したデキストラン被覆フェライト微粒子のｘ線回折、電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）、磁化測定を実施し、水溶液中での分散安定性を調べた結果、図１に示すように、フェライト結晶粒子径は５ｎｍから１０ｎｍのものが飽和磁化が大きく、水溶液中でも沈降しにくいことが分かった。
【００１３】
すなわち、図１はフェライト結晶粒子径に及ぼすアルカリ共沈時のデキストラン濃度を調べた結果の一例であって、フェライト結晶粒子径はＴＥＭ写真から求めたものである。この図１から、デキストラン濃度が０．５ｗｔ％以下では、フェライト結晶粒子径は１０ｎｍ以上であり、溶液を静置すると１時間以内にフェライト微粒子は凝集・沈降し、水とフェライト微粒子層の２層に分離する領域である。デキストラン濃度が０．５ｗｔ％から１５ｗｔ％の範囲内では、フェライト結晶粒子径は５ｎｍから１０ｎｍの範囲内にあり、磁気特性はマグネタイトよりも優れ、溶液中での分離安定性改善領域である。また、デキストラン無添加の場合、フェライト結晶粒子の平均粒径は１８ｎｍであったが、デキストラン数％添加によって結晶粒径は著しく小さくなり、溶液中での分散安定性が著しく改善される効果があることが本実験で初めて明らかになった。
【００１４】
図２、図３にフェライト結晶粒子の粒子構造の劇的な変化の一例を示す。すなわち、図２は、アルカリ共沈時のデキストラン濃度が０．２４ｗｔ％の場合（後述の比較対照例１）のフェライト結晶粒子の粒子構造を示した電子顕微鏡写真（倍率２２１，０００）であり、結晶粒径が平均粒径２１ｎｍと大きいばかりでなく、大きな凝集塊となっている。一方、図３は、デキストラン濃度が１０ｗｔ％の場合（後述の実施例２）のフェライト結晶粒子の粒子構造を示した電子顕微鏡写真（倍率２２１，０００）であり、結晶粒径は５ｎｍと小さく、かつ、均一に分散している。
【００１５】
ところが、デキストラン濃度が１５ｗｔ％以上では、結晶粒径に変化は見られないが、溶液がゲル状になって、磁気特性が低下した。このように、製造条件の検討にはフェライト結晶粒子径が一つの目安になることが分かった。
【００１６】
次に、磁気特性がマグネタイトよりも優れ、溶液中での分散安定性に優れたデキストラン被覆フェライト微粒子を得るためのその他の製造方法の要点を以下に説明する。
まず、共沈時のｐＨは飽和磁化に影響するからｐＨの管理が重要である。例えば、濃度が０．１ｍｏｌ／ｌであるＣｏＣｌ２とＦｅＣｌ２とＺｎＣｌ２からなる混合溶液を調製し、これに濃度が０．２ｍｏｌ／ｌであるＦｅＣｌ３溶液を等量加え、これに分子量４万のデキストランを加え、水溶液濃度が０．５ｗｔ％から１５ｗｔ％の範囲内で調製した後、攪半しながら徐々にＮＨ４ＯＨを滴下し、共沈反応を行なった結果、ｐＨ１１で反応を終了して得られたものは、色は黒褐色で、希土類磁石を溶液に近づけても磁石に反応しなかった。一方、ＮＨ４ＯＨの替わりに、ＮａＯＨを使用し、ｐＨ１２から１３で反応を終了して得られたものは、色は同じ黒褐色であるが磁石に鋭敏に反応するものが得られた。電子顕微鏡でフェライト結晶粒子径を観察した結果、平均粒子径５ｎｍから１０ｎｍであっ
た。
【００１７】
さらに、２価の塩化物（ＣｏＣｌ２−ＦｅＣｌ２−ＺｎＣｌ２）と３価の塩化物（ＦｅＣｌ３）の混合比は、１：２が最も好ましく、これら塩化物の濃度によって結晶粒径が制御され、２価の塩化物濃度が０．０１ｍｏｌ／ｌから０．１ｍｏｌ／ｌの範囲であると、結晶粒径５ｎｍから１０ｎｍのものが得られる。０．０１ｍｏｌ／ｌ以下の濃度では、磁気特性が不十分であり、０．１ｍｏｌ／ｌでは凝集が顕著になり使用に適さない。
【００１８】
２価の塩化物（ＣｏＣｌ２−ＦｅＣｌ２−ＺｎＣｌ２）の混合比は、種々の組み合せが考えられるが、Ｃｏ添加は結晶磁気異方性を高めるために最も効果的であるから、４０％以上７０％以下の添加が好ましい。Ｚｎ添加は飽和磁化向上効果があるから、１０％以上２５％以下の添加が好ましい。このように、ＣｏとＺｎをＦｅに複合添加することによって、Ｆｅ単独、すなわち、Ｆｅ３Ｏ４（マグネタイト）よりも飽和磁化は約２倍の８０ｅｍｕ／ｇ台が得られた。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明する。
［実施例１］
０．２ｍｏｌ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、０．１ｍｏｌ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２をそれぞれ４ｍｌ、３．６ｍｌ、２．４ｍｌを２００ｍｌのビーカに混合し、これに予め溶解しておいた５０ｗｔ％デキストラン水溶液（デキストラン分子量：４万）を５ｍｌ加え、混合溶液２１ｍｌを調製した。該混合溶液中のデキストラン濃度は１０ｗｔ％であった。次に、攪半機を用いて攪半しながら、３ＮのＮａＯＨを７５ｍｌ徐々に加え、約１０分で全量を滴下した。この時の溶液のｐＨは１２．１であり、黒褐色の溶液が得られた。続いて、６０℃の恒温槽に１時間入れ、熟成させた。この溶液は室温で１時間静置したが、沈降は全く生じなかった。次に、未反応のデキストラン及び、反応生成物のＮａＣｌを除去するために、５０ｍｌを取り、純水で希釈して全量１リットルとした後、限外瀘過機（商品名 Ｍｉｎｔａｎ、ミリポア社製）を用いて、分子量１０万のフィルターで１００ｍｌまで濃縮し、さらに純水９００ｍｌを加え、限外瀘過する操作を３回繰り返し、回収液５０ｍｌを得た。本デキストラン被覆フェライト微粒子の組成は、Ｃｏ０．４Ｆｅ０．３６Ｚｎ０．２４・Ｆｅ２Ｏ４であった。
【００２０】
［実施例２］
０．１ｍｏｌ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、０．０５ｍｏｌ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２をそれぞれ６ｍｌ、２．８ｍｌ、１．２ｍｌを２００ｍｌのビーカに混合し、これに予め溶解しておいた５０ｗｔ％デキストラン水溶液（デキストラン分子量：４万）を５ｍｌ加え、混合溶液２５ｍｌを調製した。該混合溶液中のデキストラン濃度は１０ｗｔ％であった。次に、攪半機を用いて攪半しながら、３ＮのＮａＯＨを７５ｍｌ徐々に加え、約１０分で全量を滴下した。この時の溶液のｐＨは１２．１であり、黒褐色の溶液が得られた。続いて、６０℃の恒温槽に１時間入れ、熟成させた。この溶液は室温で１時間静置したが、沈降は全く生じなかった。実施例１と同様に限外瀘過を実施し、回収液５０ｍｌを得た。本デキストラン被覆フェライト微粒子の組成は、Ｃｏ０．６Ｆｅ０．２８Ｚｎ０．１２・Ｆｅ２Ｏ４であった。
【００２１】
［実施例３］
０．２ｍｏｌ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、０．１ｍｏｌ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２をそれぞれ４ｍｌ、３．６ｍｌ、２．４ｍｌを２００ｍｌのビーカに混合し、これに予めアミノ化処理し、溶解しておいた５０ｗｔ％アミノ化デキストラン水溶液（デキストラン分子量：４万）を２ｍｌ加え、混合溶液２２ｍｌを調製した。該混合溶液中のデキストラン濃度は４．８ｗｔ％であった。次に、攪半機を用いて攪半しながら、３ＮのＮａＯＨを７５ｍｌ徐々に加え、約１０分で全量を滴下した。この時の溶液のｐＨは１２．３であり、黒褐色の溶液が得られた。続いて、６０℃の恒温槽に１時間入れ、熟成させた。この溶液は室温で１時間静置したが、沈降は全く生じなかった。実施例１と同様に限外瀘過を実施し、回収液５０ｍｌを得た。本デキストラン被覆フェライト微粒子の組成は、Ｃｏ０．４Ｆｅ０．３６Ｚｎ０．２４・Ｆｅ２Ｏ４であった
。
【００２２】
［実施例４］
０．０２ｍｏｌ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、０．０１ｍｏｌ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２をそれぞれ７ｍｌ、２ｍｌ、１ｍｌを２００ｍｌのビーカに混合し、これに予め溶解しておいた５ｗｔ％デキストラン水溶液（デキストラン分子量：４万）を３ｍｌ加え、混合溶液２３ｍｌを調製した。該混合溶液中のデキストラン濃度は０．６５ｗｔ％であった。次に、攪半機を用いて攪半しながら、３ＮのＮａＯＨを７５ｍｌ徐々に加え、約１０分で全量を滴下した。この時の溶液のｐＨは１２．６であり、黒褐色の溶液が得られた。続いて、６０℃の恒温槽に１時間入れ、熟成させた。この溶液は室温で１時間静置したが、沈降は全く生じなかった。実施例１と同様に限外瀘過を実施し、回収液５０ｍｌを得た。本デキストラン被覆フェライト微粒子の組成は、Ｃｏ０．７Ｆｅ０．２Ｚｎ０．１・Ｆｅ２Ｏ４であった。
【００２３】
［比較対照例１］
０．２ｍｏｌ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、０．１ｍｏｌ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２をそれぞれ４ｍｌ、３．６ｍｌ、２．４ｍｌを２００ｍｌのビーカに混合し、これに予め溶解しておいた５ｗｔ％デキストラン水溶液（デキストラン分子量：４万）を１ｍｌ加え、混合溶液２１ｍｌを調製した。該混合溶液中のデキストラン濃度は０．２４ｗｔ％であった。次に、攪半機を用いて攪半しながら、３ＮのＮａＯＨを７５ｍｌ徐々に加え、約１０分で全量を滴下した。この時の溶液のｐＨは１２．６であり、黒褐色の溶液が得られた。続いて、６０℃の恒温槽に１時間入れ、熟成させた。本デキストラン被覆フェライト微粒子の組成は、Ｃｏ０．４Ｆｅ０．３６Ｚｎ０．２４・Ｆｅ２Ｏ４であった。この溶液を室温で半日静置したところ、フェライト微粒子と水の２層に完全に分離し、フェライト微粒子の溶液中への分散は図れなかった。
【００２４】
なお、デキストラン濃度を徐々に増やした実験の結果、デキストラン濃度０．５ｗｔ％まではデキストラン濃度と共にフェライト結晶粒子径は急激に減少すること、同濃度（フェライト結晶粒子径１０ｎｍのものが得られる）を境として、０．５ｗｔ％以上では生成したデキストラン被覆フェライト微粒子の溶液中での分散安定性が著しく改善される結果が得られた。
しかし、デキストラン濃度が１５ｗｔ％以上では、共沈後の溶液はゲル状になり、永久磁石に反応するものが得られなかった。
【００２５】
［比較対照例２］
０．２ｍｏｌ／ｌのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを１０ｍｌ、０．１ｍｏｌ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２をそれぞれ４ｍｌ、３．６ｍｌ、２．４ｍｌを２００ｍｌのビーカに混合し、デキストランを添加しないで混合溶液２０ｍｌを調製した。次に、攪半機を用いて攪半しながら、３ＮのＮａＯＨを７５ｍｌ徐々に加え、約１０分で全量を滴下した。この時の溶液のｐＨは１２．５であり、黒褐色の溶液が得られた。続いて、６０℃の恒温槽に１時間入れ、熟成させた。本フェライト微粒子の組成は、Ｃｏ０．４Ｆｅ０．３６Ｚｎ０．２４・Ｆｅ２Ｏ４であった。この溶液は室温では、フェライト微粒子の沈降が顕著であり、放置時間とともに沈澱量も増加した。上清部に純水を加え、沈澱を捨てる、いわゆるデカンテーション操作を繰り返したが、分散安定した水溶液は得られなかった。
【００２６】
つぎに、上記実施例で作製したデキストラン被覆フェライト微粒子および比較対照例で作製したフェライト微粒子の諸特性をｘ線回折、磁化測定、並びに上述のレーザ磁気免疫測定法で調べた結果を次に述べる。
図４はデキストラン濃度０％の比較対照例２のフェライト微粒子のＸ線回折パターンを示したグラフ、図５はデキストラン濃度４．８ｗｔ％の実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子のｘ線回折パターンを示したグラフである。溶液状の試料を乾燥させ、メノウ乳鉢で微粉末とした後、Ｃｕターゲットを使用して、４０ｋｖ、２００ｍＡの条件で測定した。回折スペクトルの上方の数値は、ピークを示す２θ値（度）である。比較対照例２のフェライト微粒子のＸ線回折パターンと実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子のＸ線回折パターンの比較から、誤差０．６％以内で両方のスペクトルの２θ値は一致している。本発明の生物材料標識用磁性微粒子の製造方法に従えば、デキストラン共存下で共沈反応させても、コアとなるフェライト微粒子の結晶は同じ物が作製できていることが分かる。なお、比較対照例２のフェライト微粒子のＸ線回折パターンに比べ、実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子のＸ線回折パターンのスペクトルの半値幅が広い理由は、よく知られているように、結晶粒径が小さいためである。この半値幅からＳｃｈｅｒｒｅｒの式にしたがって、結晶粒径を求めると、実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子の場合、平均粒径５．６ｎｍとなり、上述のＴＥＭから求めた値と一致した。
【００２７】
次に、振動式磁化測定装置（ＶＳＭ）による磁化測定結果の一例を説明する。磁化曲線の一例として、図６に実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子を用いた場合の実験データを示す。室温、１０ｋＯｅで測定した。本発明のデキストラン被覆フェライト粒子は、総べてこの図６のように、ヒステリシスすなわち残留磁化が無いことが特徴である。このため磁気的に凝集することがない。比較対照例２と実施例３の試料を乾燥後、微粉末状にして乾燥重量を求めると、磁化は各々、８０ｅｍｕ／ｇ、３８ｅｍｕ／ｇであった。実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子の磁化が比較対照例２のフェライト単体よりも小さい理由は、前述のように結晶粒径が小さいためと（磁化が結晶粒径の影響を受けることは公明である）、フェライトに結合したデキストランの増量効果によるものである。一方、本発明者らが技術開示した、特開平３−２４２３２７号公報記載の「磁性微粒子の製造方法」に基づいて作製したデキストラン被覆マグネタイト微粒子の場合、磁化は１０ｅｍｕ／ｇ前後、そしてマグネタイト単体の場合、磁化は４４ｅｍｕ／ｇであった。実施例３のデキストラン被覆フェライト微粒子とデキストラン被覆マグネタイト微粒子の磁化を比較すると、３倍以上高いことから、本発明が優れていることが明らかである。
【００２８】
図７は本発明者らが発明したレーザ磁気免疫測定装置を用いて、実施例１および３のデキストラン被覆マグネタイト、比較対照例２のフェライト微粒子、並びに上述の酸化デキストラン被覆マグネタイト微粒子（デキストランを過ヨウ素酸化した）の干渉縞中心光強度測定結果の一例を示した図である。既知濃度（乾燥重量から求めた）の試料を対象にして、純水で２倍希釈列をつくり、１０μｌを測定機にかけて６０秒後の干渉縞の中心強度を測定した。縦軸の値は、ＣＣＤカメラの出力を８ビットＡ／Ｄ変換器で変換した値であって、光強度の飽和値は２５５である。この図７から、従来の酸化デキストラン被覆マグネタイト微粒子よりも１桁以上微量のデキストラン被覆フェライト微粒子が検出できることが分かる。この結果は、上述の磁化測定結果と一致する。なお、比較対照例２のフェライト微粒子単体の場合、磁化が大きいため、さらに微量まで検出できるが、溶液中では凝集・沈降が著しいため免疫診断用としては使用に耐えない。
【００２９】
以上のデキストラン被膜フェライト微粒子の製造方法の説明では、未結合のデキストラン並びにＮａＣｌ等を除去するために、限外瀘過法を用いた例を述べた。限外瀘過法は大量の試料を処理するのに適した方法であるが、試料が少量の場合、一般に用いられているゲル瀘過法で実施することも可能である。
【００３０】
【発明の効果】
本発明の生物材料標識用磁性微粒子を用いれば、磁気特性が従来の如何なる材料よりも優れており、かつ溶液中の分散安定性も優れているから、免疫診断分野に用いれば迅速・高感度診断が可能となる。例えば、本発明者らによるレーザ磁気免疫測定法に適用すれば、同一磁界中ではレーザ干渉縞の本数が増加するから検出感度、精度が向上する。あるいは、検出感度を同じにした場合、電磁石をより小型化できるから装置の小型化を図ることが出来る。
【００３１】
さらに、磁石を用いた細胞の磁気分離や磁石誘導による薬剤運搬（ドラックデリバリー）の分野に用いれば、磁石応答性が優れているため、分離時間、運搬時間等の短縮が可能となる。また細胞の磁気標識に用いれば、粒子径が１０ｎｍ以下であり、かつ分散性に優れているため、標識の分解能が向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】アルカリ共沈時のデキストラン濃度とフェライト結晶粒子径の関係を示したグラフである。
【図２】比較対照例１（アルカリ共沈時のデキストラン濃度が０．２４ｗｔ％の場合）のフェライト結晶粒子の粒子構造を示した電子顕微鏡写真である。
【図３】実施例２（アルカリ共沈時のデキストラン濃度が１０ｗｔ％の場合）のフェライト結晶粒子の粒子構造を示した電子顕微鏡写真である。
【図４】比較対照例２のフェライト微粒子のｘ線回折パターンを示したグラフである。
【図５】実施例３のデキストラン被膜フェライト微粒子のｘ線回折パターンを示したグラフである。
【図６】実施例３のデキストラン被膜フェライト微粒子の磁化曲線を示した図である。
【図７】レーザ磁気免疫測定装置を用いて、実施例１および３のデキストラン被膜フェライト微粒子、比較対照例２のフェライト微粒子、並びに上述の酸化デキストラン被覆マグネタイト微粒子（デキストランを過ヨウ素酸化した）の干渉縞中心光強度の測定結果の一例を示した図である。
Claims (3)
- （Ｃｏ ｘ −Ｆｅ ｙ −Ｚｎ ｚ ）・Ｆｅ２Ｏ４ （但し、前記組成式中の組成比を示すｘ、ｙ、ｚは、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１なる関係を満たす。）からなるフェライト微粒子であって、該結晶粒子径が５ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であり、表面がデキストランで被覆されていることを特徴とする生物材料標識用磁性微粒子。
- 前記フェライト微粒子の組成式中の組成比を示すｘ、ｙ、ｚは、０．４≦ｘ≦０．７、０．２≦ｙ≦０．３６、０．１≦ｚ≦０．２４であることを特徴とする請求項１記載の生物材料標識用磁性微粒子。
- モル濃度が０．０１から０．１ｍｏｌ／１の範囲内にある等モル濃度のＣｏＣｌ２とＦｅＣｌ２とＺｎＣｌ２からなる混合溶液を調製する工程と、前記調製工程のモル濃度の２倍のモル濃度のＦｅＣｌ３溶液を前記混合溶液と等量加える工程と、混合溶液中のデキストラン濃度が０．５ｗｔ％から１５ｗｔ％の範囲内になるようにデキストランを添加する工程と、攪半しながらＮａＯＨを徐々に滴下し、ｐＨ１２以上１３以下で共沈反応を終了する工程と、純水で希釈・攪半して溶液中に分散浮遊したもののみを回収する工程と、デキストラン被膜フェライト微粒子以外の反応生成物を限外瀘過あるいはゲル瀘過によって除去する工程とを少なくとも具備することを特徴とする生物材料標識用磁性微粒子の製造方法。
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