JP4837410B2 - 標的化合物の検出方法 - Google Patents
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Description
従って、本発明の目的は、洗いの作業を行うことなく、試料溶液中の標的化合物を簡便に且つ迅速に検出する検出方法を提供することである。
前記磁気センサーと前記分散液とを近接させたときの距離を1mm以下とすることが好ましい。
前記永久磁石の表面磁束密度としては0.01〜10Tであることが好ましい。
前記磁気抵抗素子がn型InSb半導体を含むことが好ましい。
前記磁性体ナノ粒子は、酸化鉄又はフェライトからなることが好ましい。
以上の図4において、素子間ピッチPは10〜5000μm、特に100〜1000μmが好ましく、素子幅Dは1〜1000μm、特に10〜500μmが好ましく、検知幅Lは0.01〜10mm、特に0.05〜3mmが好ましく、かつ後述の流路の内径に近い方が望ましい。
なお、濃縮後の濃度は、標的化合物の種類、サイズ、磁性体ナノ粒子と結合したリガンドの数、磁性体ナノ粒子のサイズ、磁気センサーの感度などで異なるため、条件に合わせて最適化されるが、例えば0.1mM以上が好ましい。
本発明における磁性体ナノ粒子は、個数平均粒子径が2〜50nmの磁性を有するナノ粒子である。平均粒子径が2nm以上であるので安定に作製可能であり、50nm以下であるので表面積が大きく、極微量の標的化合物を捉えることができる。磁性体ナノ粒子の平均粒子径は、安定性および磁力の観点から3〜50nmが好ましく、5〜40nmが特に好ましい。
このうち、安全性の観点から酸化鉄、フェライトが好ましい。
他方は、連続した操作様式であり、各成分(金属塩、酸化剤、および塩基を定められた順序で、粒子表面以外の部位での金属イオンの重合を避けるために各成分毎に実質的に均一な流速で、連続的に溶液中に添加する。この段階的又は連続的操作様式を用いることによって、大きさの分布が狭い粒子を形成することができる。
本発明における磁性体ナノ粒子と後述する標的化合物を結合させるために、リガンドを用いることが好ましい。換言すると、本発明に係る磁性体ナノ粒子が、その粒子表面に標的化合物と特異的に結合するためのリガンドを有していることが好ましい。このようなリガンドとしては、標的化合物に対して結合性(もしくは反応性を有する)を有する分子が好ましい。また、このような分子と外部刺激応答性化合物とが連結されたものであってもよい。
なお、標的化合物が生体関連分子である場合には、リガンドも生体関連分子を用いることが出来る。例えば、抗原を標的化合物とした場合、抗体をリガンドとして用いることが出来る。
また、特定の金属イオンに対してキレート能を有する錯形成化合物をリガンドとすることもできる。
生体関連分子には、核酸、抗原及び抗体(モノクローナルやポリクローナル)、ペプチドやその他のタンパク質、多糖類、酵素或いはその基質、脂質等の化合物、ウィルス若しくは細菌等の生物体若しくはその一部、等を挙げることができる。
本発明において、標的化合物とは検出すべき物質であり、標的物質と同義である。標的化合物は、磁性体ナノ粒子に結合したリガンドを介して磁性体ナノ粒子に結合し、磁性体ナノ粒子結合体を形成する。標的化合物は特に制約はないが、前記生体関連分子であることが好ましい。
例えば、核酸の場合には、種々のタンパク質の中から、種々の塩基配列に対して転写の制御を行うことができる転写制御因子を選択的に捕捉したり、相補的な塩基配列を設計することで異なる塩基配列を有するDNA断片を、迅速且つ容易に検出することができる。
その他、リガンドと相互作用を有し、磁性ナノ粒子の結合体を形成することの出来る標的化合物は容易に検出することができる。
(ビオチン化磁性体ナノ粒子によるアビジン結合リポソームの検出)
SPDPを用いリポソーム表面にタンパクを結合させ(Peter Walden, Zoltan A. Nagy, Jan Klein, J. Mol. Immunol.,2,191-197(1986) )、以下のようにして磁性体ナノ粒子による検出を行った。
塩化鉄(III)6水和物10.8gおよび塩化鉄(II)4水和物6.4gをそれぞれ0.5mol/L(0.5N)−塩酸水溶液80mLに溶解し混合した。得られた溶液を攪拌しながらその中にアンモニア水(14質量%)96mLを2mL/分の速度で添加した。その後、80℃で60分加熱したのち室温に冷却した。得られた凝集物を磁気分離により水で精製した。結晶子サイズ約10nmのマグネタイト(Fe3O4)の生成をX線回折法により確認した。この凝集物にポリオキシエチレン(4.5)ラウリルエーテル酢酸2.3gを溶解した水溶液200mLを加えて分散し、磁性体ナノ粒子分散液(pH=5)を調製した。
ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン(DPPE)、N−スクシミジル3−(−2−ピリジル−ジチオ)プロピオネート(SPDP)およびトリエチルアミンを1:2:2のモル比でメタノール−クロロホルム(9:1)に溶解し、室温で2時間反応させた。反応終了後100mMリン酸緩衝液(pH7.2)で洗浄後、窒素気流下乾燥させ、ジチオピリジン−ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン(DTP−DPPE)を得た。ジパルミトイルフォスファチジルコリン(DPPC)と混合し(DPPE:DPPC=2:8)、メタノール−クロロホルムに溶解し窒素気流下乾燥、薄膜とした後pH7.2のリン酸緩衝液(PBS)に懸濁させ、超音波照射、フィルターろ過により平均粒径120nmのDTPリポソーム(脂質濃度:25μM/mL)を得た。
前記磁性体ナノ粒子分散液2.5mLに0.1M MES緩衝液(pH6.0)7.5mLを加え、WSC(水溶性カルボジイミド)19mg、N−ヒドロキシスルホスクシミド(Sulfo−NHS)18mgを添加し室温で30分攪拌した。これにBiotin−PEO−Amine(Pierce)28mgを加え一晩沸騰した。1M Tris/HCl(pH8.0)200μLを加えて反応停止後、PD−10カラム(アマシャムバイオサイエンス)で精製し、ビオチン化磁性体ナノ粒子溶液を得た。
10倍に希釈した上記ビオチン化磁性体ナノ粒子溶液50mL中に、前記アビジン結合リポソーム溶液を100倍に希釈した液(サンプルA)、50倍に希釈した液(サンプルB)、20倍に希釈した液(サンプルC)をそれぞれ5mLずつ添加し、10分間撹拌した。0.3Tの表面磁束密度を有する磁石を用いて磁気分離により各液5mLになるように濃縮した。これらの液(サンプルA〜C)を内径0.5mm(断面積は約2×105μm2)、肉厚0.2mmのポリスチレン流路に20μL/秒の速度で10μL注入し、磁気センサーを用いて各サンプルにおける出力電圧を測定した。結果を図6に示す。用いた磁気センサーは、磁気抵抗素子としてInSbを含む2素子バイアス型で、素子間ピッチP=0.75mm、素子幅D=0.3mm、検知幅L=3mm、永久磁石の表面磁束密度は0.45Tである。なお、磁気センサーと、ポリスチレン流路内を流れる分散液との距離は、0.4mmであった。図6より、出力電圧がアビジン結合リポソームの濃度にほぼ比例することがわかった。なお、ビオチン化磁性体ナノ粒子に結合したアビジン結合リポソームの平均粒子サイズは260nmであった。
11 磁気抵抗素子
12 永久磁石
13 端子ピン
14 FG端子ピン
15 ホルダー
16 モールド材
22A 22B 磁気抵抗素子
24 永久磁石
Claims (7)
- 平均粒子サイズ50nm以下の磁性体ナノ粒子コロイド溶液中に、標的化合物を含む被検液を注入し、該被検液中の標的化合物と前記磁性体ナノ粒子とを結合させて100nm以上のサイズを有する磁性体ナノ粒子結合体を形成させ、該磁性体ナノ粒子結合体を磁気分離により濃縮し、磁性体ナノ粒子結合体を含む濃縮分散液を得た後、該濃縮分散液を、少なくとも磁気抵抗(MR)素子及び永久磁石からなる磁気センサーに近接させて磁気抵抗の変化を測定することにより、前記磁性体ナノ粒子結合体のみを検出し、間接的に前記標的化合物を検出することを特徴とする標的化合物の検出方法。
- 断面積101〜107μm2の流路内を0.001〜100mL/分の流速で流れる前記磁性体ナノ粒子コロイド溶液中に、前記被検液を0.1〜1000μL注入することを特徴とする請求項1に記載の標的化合物の検出方法。
- 前記磁性体ナノ粒子が、その粒子表面に標的化合物と特異的に結合するためのリガンドを有していることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の標的化合物の検出方法。
- 前記磁気センサーと前記分散液とを近接させたときの距離を1mm以下とすることを特徴とする請求項1から請求項3のいずれか1項に記載の標的化合物の検出方法。
- 前記永久磁石の表面磁束密度は0.01〜10Tであることを特徴とする請求項1から請求項4のいずれか1項に記載の標的化合物の検出方法。
- 前記磁気抵抗素子がn型InSb半導体を含むことを特徴とする請求項1から請求項5のいずれか1項に記載の標的化合物の検出方法。
- 前記磁性体ナノ粒子が酸化鉄又はフェライトからなることを特徴とする請求項1から請求項6のいずれか1項に記載の標的化合物の検出方法。
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