TW201303296A - 用於偵測水產動物病毒之試劑與方法 - Google Patents

用於偵測水產動物病毒之試劑與方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種偵測水產動物病毒之檢測試劑及方法，該方法係利用磁性免疫分析儀偵測帶有水產動物病毒抗體之磁性奈米粒子的免疫磁減量(Immunomagnetic Reduction，IMR)訊號，並透過邏輯函數計算出水產動物體內的病毒濃度，進一步確認水產動物感染病毒。

Description

用於偵測水產動物病毒之試劑與方法
本發明係有關一種偵測水產動物病毒之檢驗試劑套組及方法。
在亞洲及歐洲國家中，石斑魚係魚類中重要的品種，其可產生高經濟價值。然而，因幼體會遭受病毒的傷害，使幼體的繁殖比例相當低(Kiryu et al.,2007,Fish Pathology 42,163-165)。有多種的病毒會攻擊石斑魚，如神經壞死病毒NNV(nervous necrosis virus)、虹彩病毒(irido virus)和感染性胰臟壞死病毒(infection pancreatic necrosis virus)(Munday et al. J. Fish Dis. 25,127-142)。而神經壞死病毒對於石斑魚幼體會造成傷害並且導致死亡率高於90%以上。
神經壞死病毒NNV係一種核酸病毒，屬於野田病毒中的β-野田病毒(betanodavirus)一種。神經壞死病毒的大小大約為25-30奈米，其包含兩種核醣核酸(RNA)：RNA1及RNA2(Tan et al.,2001,Singapore strain. J. Gen. Virol. 82,647-653.；Chi et al.,2001,J. Fish Dis. 24,3-13.；Sung et al.,2009,J. Virol. Methods 159,206-210.)，其中，RNA1可表現蛋白質A，而RNA2可表現蛋白質α，形成NNV的帽結構(Qin et al.,2002 Epinephelus spp. J. Virol. Methods 106,89-96.；Adachi et al.,2008,Arch. Virol. 153,15-24.)。常見用於定量偵測NNV的步驟是包含從石斑魚組織中萃取出NNV的微顆粒，並進行RNA反轉錄為DNA，最後利用即時定量聚合酶連鎖反應，亦是即時聚合酶連鎖反應(Real-Time PCR)(Chi et al.,2003,Dis. Aquat. Org. 55,221-228.；Kuo et al,2011,J. Clin. Microbiol. 49,1090-1096.)。雖然上述的方法在偵測NNV可表現出高靈敏度及專一性，但因在操作流程需小心處理，所以僅可透過在研究室中的熟練該技術的人員操作，此缺點嚴重地阻礙偵測NNV方法的普及性，並且在水產養殖業中，NNV的大範圍檢驗很難藉由即時聚合酶連鎖反應完成。
近年來，有許多研究團隊使用酵素連結免疫吸附分析(ELISA)，如三明治免疫分析技術(Volpers et al.,1995,J. Virol. 6,3258-3264；Breuil et al.,2001,Dis. Aquat. Org. 45,25-31)，而上述技術常因檢測時的操作複雜度，無法將該技術普遍地推廣。因此，具有容易操作的優點、高信賴性、高靈敏度和專一性的替代技術係近年來逐漸發展的重點。
本發明提供一種用於偵測水產動物病毒的檢測試劑，包括：多個磁性奈米粒子，分布於水溶液中，其中該些磁性奈米粒子的構造為一磁性核、一界面活性劑層，披覆於該磁性核上，以及多個水產動物病毒抗體，結合於該界面活性劑層上。
本發明中所指之「磁性奈米粒子」，其材料係選自於Fe3O4、Fe2O3、MnFe2O4、CoFe2O4及NiFe2O4所組成之群組，於較佳的實施例中，磁性核的材料係Fe3O4。
本發明中所指的「界面活性劑」係指能使目標溶液表面張力顯著下降的物質，以及降低兩種液體之間表面張力的物質，一般的界面活性劑為具有親水與疏水基團的有機兩性分子，可溶於有機溶液和水溶液。於本發明中，所使用之界面活性劑材料包含但不限於有機酸、蛋白質A、蛋白質G、葡萄聚醣(Dextran)或微脂粒，於較佳的實施例中，界面活性劑的材料為葡萄聚醣(Dextran)。
本發明中，所指的水產動物病毒係包含神經壞死病毒、虹彩病毒和感染性胰臟壞死病毒，於較佳的實施例中，此水產動物病毒係神經壞死病毒。此外，本發明所使用的水產動物為石斑魚。
本發明另提供一種檢測水產動物病毒的方法，包括提供本發明檢測試劑，並萃取水產動物內病毒，進一步將試劑與萃取物混合，量測免疫磁減量訊號，並藉由一邏輯函數，以定量該病毒的濃度。
其中，A係噪音強度，B係飽和值參數，Φ NNV 係神經壞死病毒濃度，Φ ο 係隨著Φ NNV 變化的參數，γ係密合參數。。
本發明另提供一種萃取組織內病毒的方法，其步驟為(1)取出水產動物之腦組織。(2)加入萃取液溶液至含有組織的容器中。(3)將含有組織的容器放在冰上，並磨碎該組織。(4)取出容器中的上清液進行檢測萃取效率。
下列實施例僅代表本發明幾種不同態樣及特徵，但不用於限制本發明之內容。
實施例一　萃取石斑魚幼體中的神經壞死病毒
所有神經壞死病毒NNV幾乎存在於石斑魚的腦組織中，本發明將取出的0.5克腦組織放入微量離心管，並加入200μl的萃取液(MagQu Co.,Ltd.)至微量離心管，為了保持組織的新鮮度，將微量離心管放置在冰上並將組織磨碎，3分鐘磨碎後，移開在冰上的微量離心管5分鐘，取出在微量離心管中含組織的液體的上部溶液做免疫磁減量檢測並量測NNV的濃度。
圖1係不同石斑魚腦組織的萃取過程之流程圖，其中圖1(a)係直接從石斑魚腦組織萃取神經壞死病毒的RNA，所萃取的RNA被轉錄為DNA，並藉由即時聚合酶連鎖反應偵測DNA的濃度，亦為ΦNNV,RNA。根據萃取的結果，選擇700TCID50/毫升至4x107TCID50/毫升的神經壞死病毒濃度作為檢視萃取NNV的濃度範圍。
本發明所述的TCID50係指組織培養感染劑量50(Tissue culture infection dose50)。
圖1(b)為萃取腦組織的神經壞死病毒顆粒，經由上述萃取流程，在上部溶液中含NNV顆粒透過即時聚合酶連鎖反應檢測並表示為ΦNNV,part。經上述方式所萃取的NNV濃度，可經由ΦNNV,part/ΦNNV,RNA的比例獲得萃取效率值。如圖2所示，700TCID50/毫升至4x107TCID50/毫升的神經壞死病毒濃度中，本發明之萃取神經壞死病毒的效率超過80%。
實施例二　試劑合成
混合化學計量比率1:2的硫酸亞鐵七水(FeSO4‧7H2O)與氯化鐵六水(FeCl3‧6H2O)的鐵溶液與等量的水性葡萄聚醣(Dextran)混合，其作為四氧化三鐵粒子的界面活性劑並分散在水中。該混合物加熱至70-90℃並以強鹼溶液滴定形成黑色的四氧化三鐵粒子，團聚體和多餘的葡萄聚醣(Dextran)則以離心的方式移除，並以凝膠過濾層析方式獲得高濃度均相的磁流體。該試劑可透過pH-7.4的磷酸鹽緩衝液稀釋高濃度磁流體而獲得適合的磁性濃度(Jiang et al.,2004,J. Magn. Magn. Mater. 283,210-214.)。
為了使抗體結合至磁性奈米粒子外層的葡萄聚醣(Dextran)上，以神經壞死病毒抗體為例，加入過碘酸鈉NaIO4溶液至磁性溶液中，使葡萄聚醣(Dextran)氧化並得到醛基(-CHO)(Yang et al.,2008,Magn. Magn. Mater. 320,2688-2691.)，之後，葡萄聚醣(Dextran)可透過-CH=N-的連結與神經壞死病毒抗體反應。因此，神經壞死病毒抗體共價連接到葡萄聚醣(Dextran)上。透過磁性分離，未接合的神經壞死病毒抗體可從溶液中分離。
為確定磁性奈米粒子表面接合上神經壞死病毒抗體，如圖3(a)所示，本實施例使用一端接有FITC(Fluorescein Isothiocyanate)螢光的二級抗體與神經壞死病毒試劑混合。實驗中，加入過量的FITC二級抗體與披覆有神經壞死病毒抗體的磁性粒子混合。充分混合後，再藉由磁性分離技術，將混合液中的磁性粒子分離出，而未與磁性粒子表面之神經壞死病毒抗體接合的FITC二級抗體，因不具有磁性，則會留在原混合液中。
因此，本實施例將混合液放在螢光顯微鏡下觀察，首先會看到綠色(灰色)亮點，如圖3(b)中箭頭所指之處。此亮點是FITC所發出的光亮。為了再次確認二級抗體鍵結至磁性奈米粒子上，在混合液旁擺上磁鐵。此時溶液中的磁性粒子會受到磁鐵的吸引而移動，透過磁性奈米粒子的移動，若附有FITC的二級抗體與披覆有神經壞死病毒抗體的磁性粒子結合，則亮點也會移動。本實施例中，將磁鐵放於圖3(b)的右下方，而圖3(c)的亮點應朝向右下方移動。此預測在圖3(c)中被觀察到，這證實磁性粒子上，確實已接上神經壞死病毒抗體(Anti-NNV)。
藉由動態雷射分散儀(dynamic laser scattering)，分析具有神經壞死病毒抗體的磁性奈米粒子的粒徑分佈，而測量神經壞死病毒試劑的磁濃度為0.1emu/g(1.2mg-Fe/毫升)。如圖4顯示，粒子的平均流體動力粒徑為55nm，此粒徑係根據布朗式磁鬆弛，時間常數τB於55nm的粒子分散在20-25℃的水中，透過方程式(1)，估計為65.79μs，其中η係在20-25℃中水的黏度，V係粒子平均流體動力體積，kB係Boltzmann常數，和T係蘭氏溫度單位。經由上述的估計，此意味著在交流磁場下的頻率為1/τB(=15.2kHz)。實際上，分散於水中的粒子的虛部交流磁化率相當於粒子的交流磁性能量的吸附作用。因此在共鳴頻率可達到最大吸附作用，並使交流磁化率的虛部達到最大值。因此本實施例藉由磁導率計測量神經壞死病毒試劑的交流磁化率的頻率相關虛部。如圖5之實驗頻率範圍中，顯示標準化交流磁化率的最大值虛部，且顯著表現出隨著適合的交流磁場頻率增加，神經壞死病毒試劑的虛部(Imaginary part)Im[χac]Nor也隨之增加，並且達到最大值約15kHz，此實驗結果符合公式(1)的推論。
τB=3ηV/kBT.................(1)
實施例三　神經壞死病毒濃度與免疫磁減量訊號建立
本實施例將40μl與60μl的樣品溶液混合在玻璃管中，使用磁性免疫分析儀(XacPro-E,MagQu)量測未結合成神經壞死病毒-神經壞死病毒抗體-葡萄聚醣-奈米磁性粒子前的χac,0交流信號，之後，該混合物維持在室溫下以形成神經壞死病毒-神經壞死病毒抗體-葡萄聚醣-奈米磁性粒子，量測並紀錄其交流信號χac,Φ，透過量測出的χac,0及χac,Φ，可用下列的公式(2)計算出IMR訊號。
IMR(%)=(χac,o-χac,Φ)/χac,o x 100%.......(2)
對每一個給定濃度的樣品溶液，其時間依賴之χac交流信號皆檢測三重複。圖6顯示神經壞死病毒濃度ΦNNV與IMR訊號的關係曲線，當神經壞死病毒濃度ΦNNV從5TCID50/毫升改變至107TCID50/毫升，IMR訊號則從0.84%增加至3.04%，上述之實驗結果數據，可由下列邏輯函數(Logistic Function)(3)推算IMR(%)與神經壞死病毒濃度ΦNNV關係。
其中，A、B、Φo及γ是該函數的參數。將實驗數據套入邏輯特函數中，可得到A=0.64、B=3.47、Φo=26684及γ=0.31，並以實線繪於圖6。在邏輯函數(3)中，當ΦNNV趨近於0時，IMR訊號趨近於A值，此結果表示A值係NNV濃度依賴IMR訊號的噪音強度。此外當ΦNNV高於Φo時，IMR訊號趨近於B值，此顯示當神經壞死病毒為高濃度時，對於IMR訊號，B值為高端值(high-end value)。
依據上述，將濃度定義為偵測樣品的標準，在低濃度的神經壞死病毒中，藉由IMR訊號的三重複標準差數據，顯示出IMR訊號高於噪音強度A值。實驗數據顯示出當神經壞死病毒為低濃度時，IMR訊號的標準差為0.021%。因此，透過邏輯函數(3)，當IMR訊號的偵測標準為0.903%時，此時神經壞死病毒濃度為17.2 TCID50/毫升。
實施例四　使用即時聚合酶連鎖反應偵測神經壞死病毒濃度
取出100 ng的RNA定量具有神經壞死病毒的RNA濃度，其係使用核酸複製同步定量序列偵測系統(ABI Prism 7000 sequence detector，Applied Biosystems偵測)。執行即時聚合酶連鎖反應的放大作用係使用High Capacity cDNA Archive kit(Applied Biosystems)和其專一性引子，如序列表SEQ ID NO.1。在即時聚合酶連鎖反應的過程中，藉由Power SYBR Green PCR MasterMix試劑以螢光即時偵測核酸量，並且利用神經壞死病毒的Sense和Antisense引子，如序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3執行即時聚合酶連鎖反應。其反應條件，以95℃反應3秒將DNA模板雙股打開，再以60℃反應30秒進行引子的黏合及延伸作用，進行45個循環反應，最後藉由SDS軟體(version 1.7；Applied Biosystems)分析即時聚合酶連鎖反應訊號。
本實施例準備濃度為102至108 TCID50/毫升的多種神經壞死病毒樣品，並使用即時聚合酶連鎖反應方式偵測，以螢光強度與放大循環作用的實驗關聯性測定每一個神經壞死病毒濃度樣品的交叉點(crossing point)，如圖7顯示神經壞死病毒濃度對於交叉點的曲線圖，並得到CP=-1.48 logΦNNV+39.4的線性方程式，並且做為計算神經壞死病毒濃度的標準曲線。
實施例五　免疫磁減量與即時聚合酶連鎖反應分析方式的比較
為了確認IMR偵測神經壞死病毒濃度的分析方式能取代即時聚合酶連鎖反應，本實施例利用IMR與即時聚合酶連鎖反應同時測試15個樣品，對於每個樣品，有兩個神經壞死病毒濃度的數值，一係使用IMR偵測的數值為ΦNNV,IMR，另一使用即時聚合酶連鎖反應偵測的數值為ΦNNV,PCR。圖8顯示出ΦNNV,IMR與ΦNNV,PCR之間的高度相關性，其相關係數為0.99，因此證實利用IMR偵測神經壞死病毒濃度是具有可信度。
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圖1、從石斑魚幼體萃取神經壞死病毒顆粒之流程圖。
圖2、顯示神經壞死病毒濃度與萃取效率之結果。
圖3、表面接有神經壞死病毒抗體(Anti-NNV)的磁性奈米粒子與附有FITC之二級抗體的(a)示意圖及(b)、(c)在螢光顯微鏡下觀察到受磁鐵吸引的移動行為。
圖4、接有神經壞死病毒抗體的磁性粒子之粒徑分布。
圖5、磁性試劑的交流磁化率的虛數部分(Imaginary Part)作為適用的磁場頻率函數。
圖6、免疫磁減量對神經壞死病毒濃度訊號之影響比較。
圖7、在即時聚合酶連鎖反應的測試方式中，神經壞死病毒濃度對於交叉點的曲線圖。
圖8、比較IMR與即時聚合酶連鎖反應偵測神經壞死病毒濃度的有效性。

Claims (10)

  1. 一種用於偵測水產動物病毒之檢測試劑，其包含：一溶液；及一多個磁性奈米粒子，分佈於該溶液中，各該磁性奈米粒子包含：一磁性核；一界面活性層，披覆於該磁性核上；及一多個水產動物病毒抗體，結合於該界面活性層上。
  2. 如申請專利範圍第1項之檢測試劑，其中該溶液包含水。
  3. 如申請專利範圍第1項之檢測試劑，其中該磁性奈米粒子之材料係選自由Fe3O4、Fe2O3、MnFe2O4、CoFe2O4及NiFe2O4所組成之群組。
  4. 如申請專利範圍第1項之檢測試劑，其中該磁性核的材料為Fe3O4。
  5. 如申請專利範圍第1項之檢測試劑，其中該界面活性劑包含有機酸、蛋白質A、蛋白質G、葡萄聚醣或微脂粒。
  6. 如申請專利範圍第1項之檢測試劑，其中界面活性劑為葡萄聚醣。
  7. 如申請專利範圍第1項之檢測試劑，其中水產動物病毒包含神經壞死病毒、虹彩病毒和感染性胰臟壞死病毒。
  8. 一種檢測水產動物病毒之方法，其包含：(1)　提供如申請專利範圍第1項所述之試劑；(2)　萃取腦組織內的病毒；(3)　將萃取物與試劑混合後，量測免疫磁減量訊號；及(4)　藉由一邏輯函數，以定量該受測病毒濃度，其中A係噪音強度，B係飽和值參數，Φ NNV 係神經壞死病毒濃度，Φ o 係隨著Φ NNV 變化的參數，γ係密合參數。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中萃取組織內病毒的步驟為：(1)取出水產動物之組織；(2)加入萃取溶液至含有組織的容器中；(3)將含有組織的容器放在冰上，並磨碎該組織；及(4)取出容器中的上清液進行檢測萃取效率。
  10. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該水產動物病毒為神經壞死病毒。
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