CN1261765C - 一种纳米免疫磁颗粒的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米免疫磁颗粒、制备方法及应用，其纳米免疫磁颗粒是在纳米级Fe3O4的表面包裹有葡聚糖，葡聚糖与特异性抗体联接，纳米免疫磁颗粒用下述方法制成：(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备；(2)纳米免疫磁颗粒的制备；纳米免疫磁颗粒可用于分离细菌、病毒、寄生虫、细胞和生物大分子，本发明的纳米免疫磁颗粒具有良好的分散性和悬浮稳定性，在蛋白质连接反应和细菌分离过程中不会聚集；而且该成分对被检测物无任何毒性，被分离物的生物学性状和功能不受影响，处于亚致死状态的微生物也能被回收，减少了假阴性的发生，与快速检测技术相结合，可以实现致病微生物及生物大分子的快速检测与诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫磁性材料，特别是涉及一种纳米免疫磁颗粒的制备方法及应用。
背景技术
在人类历史上，传染病曾是人类健康与生命的大敌，夺去过千百万人的生命，给人类造成巨大的灾难。但人类一直在与传染病进行着长期不懈的斗争，并在二十世纪中期消灭了天花，许多传染病受到了控制。然而，进入二十世纪70年代以来，在人类传染病防治方面又出现了许多新情况，主要表现在：一是一些被控制的传染病又死灰复燃、卷土重来，如霍乱、结核等，重新对人类健康构成了威胁；二是一系列新传染病相继出现或被发现，其中一些已经给人类带来了巨大灾难和恐慌，如2003年流行的严重急性呼吸系统综合征(SARS)、2004年波及亚洲的禽流感，在非洲流行的埃博拉出血热、全世界流行的艾滋病等。有科学家预言：21世纪是传染病多发的世纪。根据“控制传染源——切断传播途径——保护易感人群”的流行病防治原则，建立一套快速、准确、敏感的病原体直接检测方法，是实现早期及时地发现病原体，防止传染病流行的重要环节，这对尚无疫苗保护的疾病更为重要。但在实际检测中经常遇到的情况是：待检测样品中所含的杂菌数量很多，待检测的致病微生物(细菌或病毒)含量相对较低，同时待检测样品本身(如食品、血液、分泌物、排泄物等)或其中所含有的杂质成分也严重影响检测效果的灵敏度和准确性。
对于微量的病原微生物，其传统的检测方法是需要对样品中的目的微生物进行培养、扩增。由于扩增过程复杂，所以费时费力。而免疫学方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)；分子生物学方法，如PCR技术、基因芯片技术等，虽然提高了检测的敏感性、具有检测的特异性，但这些技术受限于样本的前增菌和靶细菌或病毒的分离过程。因此，如何从复杂背景中快速分离、纯化、浓集出目的微生物，一直是制约检测与诊断效率的“瓶颈”，所以必须采取有效的分离、浓集措施来充分提高目的微生物的浓度。
蛋白质的检测在生物医学诊断中具有重要意义，而常规的酶联免疫吸附试验(ELISA)技术、仪器检测技术等的敏感度一般为pM～mM水平，待检样品中的杂质往往对检测结果有明显影响。所以，也需要对待检样品中的目的蛋白进行分离纯化。
此外，反映体内多种功能指标的细胞和生物大分子，包括各种免疫细胞、肿瘤细胞、细胞因子等检测对疾病的早期诊断、治疗及预后判断等具有重要意义。现在在分离这些生物大分子时多采用微米级磁颗粒。
磁颗粒可以作为生物大分子的载体，抗体包被的磁颗粒称为免疫磁颗粒，由于其既有结合抗原的特性又有磁性的特点，因此，在从复杂样品中分离、纯化与浓集目的微生物、细胞和生物大分子等方面具有较多优势，包括快速(5～20分钟)、特异性强、操作简便、使用范围广(几乎可用于所有样品的处理)等。在医学上较早即被用于微生物、细胞和生物大分子的分离与浓集，以及致病菌及致病病毒等的分离。但常规微米级免疫磁颗粒的分离效率不高，颗粒间相互作用较强、分散性较差。
纳米材料是20世纪90年代后得到迅猛发展的新材料。纳米磁材料(粒径小于10nm～100nm)在磁结构和磁性方面与一般磁颗粒有很大区别：纳米磁性颗粒，单位体积颗粒数目更多，比表面积更大；具有超顺磁性，磁相互作用很弱；它可在外加磁场作用下定向运动，使得某些特殊成份得以分离、浓集或纯化等。
目前，尚无纳米免疫磁颗粒及制备方法的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种纳米免疫磁颗粒的制备方法。
本发明的第二个目的是提供一种纳米免疫磁颗粒分离细菌、沙眼衣原体、支原体和梅毒螺旋体的方法。
本发明的第三个目的是提供一种纳米免疫磁颗粒分离病毒的方法。
本发明的第四个目的是提供一种纳米免疫磁颗粒分离寄生虫、细胞和生物大分子的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，由下列步骤组成：
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：
①将0.5～1.2mol/L的FeCl3·6H2O溶液10～20份与0.5～2.5mol/L FeCl2·4H2O溶液2～6份混合，在氮气氛下，滴加至10～30份重量/体积百分比为30％～70％的葡聚糖T-40溶液中，混合，50～70℃，水浴10～30分钟后，在剧烈搅拌下，10～30分钟内，向混合液中滴加3～7mol/L的氨水35～45份，温度保持50～70℃，并始终通氮气，制成悬液，所述份数为体积份；
②将悬液用乙酸或稀盐酸调至pH为6.0～8.0；
③将悬液中的聚集体在离心力为600×g，离心10～20分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为pH 6～8的0.005～0.02mol/L磷酸盐缓冲液，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5～10mg/ml；
④取步骤③制得的葡聚糖纳米磁颗粒悬液0.5～2.0份，加入10～30mmol/L NaIO4溶液0.1～0.5份，150转/分钟避光阻氧震荡0.5～12小时，加入1～3mol/L 乙二醇0.1～0.3份终止氧化，用0.005-0.02mol/L磷酸盐缓冲液，4℃透析18～48小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3～8mg/ml，所述份数为体积份；
(2)纳米免疫磁颗粒的制备
向浓度为3～8mg/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10～30μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗体，混匀，4℃避光放置6～24小时，加入0.2～1mol/LNaBH4溶液还原10～60分钟，加入NaBH4的量为0.1～0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，多余的抗体用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，优选的是：
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备为：
①将0.7mol/L FeCl3·6H2O溶液16份与1.6mol/L FeCl2·4H2O溶液4份混合，在氮气氛下，滴加至20份重量/体积百分比为50％葡聚糖T-40溶液中，混合，60℃水浴15分钟后，在剧烈搅拌下，15分钟内，向混合液中滴加5mol/L的氨水40份，温度保持60℃，并始终通氮气，制成悬液，所述份数为体积份；
②将悬液用乙酸调至pH为7.0；
③将悬液中的聚集体在600×g，离心15分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与-葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为pH 7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml；
④取步骤③制得葡聚糖纳米磁颗粒1份，加入25mmol/L NaIO4溶液0.25份，150转/分钟避光阻氧震荡6小时后，加入2mol/L乙二醇0.2份终止氧化，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液，4℃透析24小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为6mg/ml，所述份数为体积份；
(2).纳米免疫磁性颗粒的制备为：
向浓度为6mg/ml葡聚糖纳米磁性颗粒悬液中加入25μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗体，混匀，4℃避光放置8小时，加入0.5mol/LNaBH4溶液还原30分钟，加入NaBH4的量为0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，多余的抗体用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
所述抗体为抗致病性大肠杆菌抗体、沙门氏菌属抗体、志贺氏菌属抗体、金黄色葡萄球菌抗体、嗜肺军团杆菌抗体、霍乱弧菌抗体、副溶血弧菌抗体、小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体、单核细胞增生李斯特氏菌抗体、结核分枝杆菌抗体、变形杆菌抗体、腊样芽孢杆菌抗体、淋球菌抗体之一，或沙眼衣原体抗体、支原体抗体，梅毒螺旋体特异性抗体之一。
所述抗体还可以是甲型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、爱滋病病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体、脊髓灰质炎病毒抗体、柯萨奇病毒抗体、埃可病毒抗体、乙型肝炎表面抗原的抗体之一。
所述抗体也可以是隐孢子虫抗体、蓝氏贾第边毛虫抗体、蛔虫抗体，巨噬细胞抗体、巨核细胞抗体、淋巴细胞抗体、单核细胞抗体、各种肿瘤细胞抗体，类风湿因子抗体、p53抗体、甲胎蛋白抗体、癌胚抗原抗体、白介素-2抗体、表皮细胞生长因子特异性抗体之
一种纳米免疫磁颗粒分离细菌、沙眼衣原体、支原体和梅毒螺旋体的方法，由如下步骤组成：在1ml检测样本中加入权利要求3制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2-20μl，孵育5～30分钟，磁板吸引2-10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温-20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10～20分钟内使相应靶细菌、沙眼衣原体、支原体和梅毒螺旋体分离。
一种纳米免疫磁颗粒分离病毒的方法，由如下步骤组成：在1ml检测样本中加入权利要求4制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2～20μl，孵育5～30分钟，磁板吸引2～10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温-20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10～20分钟内使相应靶病毒分离。
一种纳米免疫磁颗粒分离寄生虫、细胞和生物大分子的方法，由如下步骤组成：在1ml检测样本中加入权利要求5制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2～20μl，孵育5～30分钟，磁板吸引2～10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温-20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10～20分钟内使相应寄生虫、细胞和生物大分子分离。
本发明的纳米免疫磁颗粒是以Fe3O4为核心，外面包裹葡聚糖，葡聚糖通过功能基团与特异性抗体连接。该颗粒制备方法简单，葡聚糖作为包被材料，使得颗粒具有良好的分散性和悬浮稳定性，在蛋白质连接反应和细菌分离过程中不会聚集；而且该成分对被检测物无任何毒性，被分离物的生物学性状和功能不受影响，处于亚致死状态的微生物也能被回收，减少了假阴性的发生。在微生物和生物大分子的实际分离应用中，纳米免疫磁颗粒具有快速、高效、特异性分离、纯化、浓集目的微生物和生物大分子的特点。与快速检测技术相结合，可以实现致病微生物及生物大分子的快速检测与诊断。与常规微米级免疫磁颗粒的分离效率比，由于颗粒间相互作用较弱，分散性较好。
附图说明
图1为本发明采用TECNAI-20透射电子显微镜拍得的葡聚糖纳米磁颗粒电镜照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：
①将0.7mol/L FeCl3·6H2O溶液16ml与1.6mol/L FeCl2·4H2O溶液4ml混合，在氮气氛下，滴加至20ml 50％(w/v)葡聚糖T-40溶液中，将此混合液60℃水浴15分钟后，在剧烈搅拌下，向混合液中滴加5mol/L的氨水40ml，15分钟滴完，温度仍保持60℃，并始终通氮气防止氧化，制成悬液；
②生成的悬液用乙酸调至pH为7.0；
③将悬液中的聚集体经600×g离心15分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl)S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，收集的颗粒冷冻干燥，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml；
④取葡聚糖纳米磁颗粒1ml，加入25mmol/L NaIO4溶液0.25ml，150转/分钟避光阻氧震荡6小时后，加入2mol/L乙二醇0.2ml终止氧化，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析24小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为6mg/ml；
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备
向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗致病性大肠杆菌抗体，混匀后，4℃避光放置8小时，再用0.5mol/LNaBH4溶液还原30分钟，加入NaBH4的量为0.3ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，使生成物具有稳定结构，多余的抗体用SephacrylS-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
图1为本发明采用TECNAI-20透射电子显微镜拍得的葡聚糖纳米磁颗粒电镜照片，放大倍数：×100000。照片显示葡聚糖纳米磁颗粒核心大小为5～10nm。
实施例2
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：
①将0.5mol/L FeCl3·6H2O溶液12ml与1.4mol/L FeCl2·4H2O溶液3ml混合，在氮气氛下，滴加至15ml 30％(w/v)葡聚糖T-40溶液中，将此混合液70℃水浴10分钟后，在剧烈搅拌下，向混合液中滴加3mol/L的氨水30ml，10分钟滴完，温度仍保持70℃，并始终通氮气防止氧化，制成悬液；
②生成的悬液用稀盐酸调至pH为6.0；
③将悬液中的聚集体经600×g离心10分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl)S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)，收集的颗粒冷冻干燥，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5mg/ml；
④取葡聚糖纳米磁颗粒0.5ml，加入10mmol/L NaIO4溶液0.5ml，150转/分钟避光阻氧震荡0.5小时后，加入1mol/L乙二醇0.3ml终止氧化，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析18小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3mg/ml；
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备
向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的甲型肝炎病毒抗体，混匀后，4℃避光放置6小时，再用0.2mol/LNaBH4溶液还原10分钟，加入NaBH4的量为0.1ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，使生成物具有稳定结构，多余的抗体用Sephacryl S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
实施例3
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：
①将1.2mol/L FeCl3·6H2O溶液10ml与2.5mol/L FeCl2·4H2O溶液3ml混合，在氮气氛下，滴加至13ml 70％(w/v)葡聚糖T-40溶液中，将此混合液50℃水浴30分钟后，在剧烈搅拌下，向混合液中滴加7mol/L的氨水26ml，30分钟滴完，温度仍保持50℃，并始终通氮气防止氧化，制成悬液；
②生成的悬液用稀盐酸调至pH为8.0；
③将悬液中的聚集体经600×g离心20分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl)S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)，收集的颗粒冷冻干燥，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为10mg/ml；
④取葡聚糖纳米磁颗粒2.0ml，加入30mmol/L NaIO4溶液0.4ml，150转/分钟避光阻氧震荡12小时后，加入3mol/L乙二醇0.1ml终止氧化，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析48小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml；
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备
向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入30μg/mg颗粒量的隐孢子虫抗体，混匀后，4℃避光放置24小时，再用1mol/LNaBH4溶液还原60分钟，加入NaBH4的量为0.5ml/ml磁颗粒悬液，使生成物具有稳定结构，多余的抗体用Sephacryl S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
实施例4
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：
①将1.2mol/L FeCl3·6H2O溶液10ml与0.5mol/L FeCl2·4H2O溶液6ml混合，在氮气氛下，滴加至10ml 70％(w/v)葡聚糖T-40溶液中，将此混合液50℃水浴30分钟后，在剧烈搅拌下，向混合液中滴加7mol/L的氨水35ml，10分钟滴完，温度仍保持50℃，并始终通氮气防止氧化，制成悬液；(其余同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的沙门氏菌属抗体，(其余同实施例1)。
实施例5
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：
①将1.2mol/L FeCl3·6H2O溶液20ml与2.5mol/L FeCl2·4H2O溶液6ml混合，在氮气氛下，滴加至30ml 70％(w/v)葡聚糖T-40溶液中，将此混合液50℃水浴30分钟后，在剧烈搅拌下，向混合液中滴加7mol/L的氨水45ml，30分钟滴完，温度仍保持50℃，并始终通氮气防止氧化，制成悬液；(其余同实施例1)。
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入15μg/mg颗粒量的志贺氏菌属抗体，(其余同实施例1)。
实施例6
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：①②③(同实施例1)，④取葡聚糖纳米磁颗粒2.0ml，加入30mmol/L NaIO4溶液0.1ml，150转/分钟避光阻氧震荡12小时后，加入3mol/L乙二醇0.1ml终止氧化，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析48小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml；
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入20μg/mg颗粒量的金黄色葡萄球菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例7
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的嗜肺军团杆菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例8
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入30μg/mg颗粒量的霍乱弧菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例9
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg颗粒量的副溶血弧菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例10
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入15μg/mg颗粒量的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例12
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例2)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入15μg/mg颗粒量的单核细胞增生李斯特氏菌抗体，(其余同实施例2)。
实施例13
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例2)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的结核分枝杆菌抗体，(其余同实施例2)。
实施例14
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例3)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入30μg/mg颗粒量的变形杆菌抗体，(其余同实施例3)。
实施例15
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg颗粒量的腊样芽孢杆菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例16
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg颗粒量的淋球菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例17
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg颗粒量的沙眼衣原体抗体，(其余同实施例1)。
实施例18
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入20μg/mg颗粒量的支原体抗体，(其余同实施例1)。
实施例19
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入20μg/mg颗粒量的梅毒螺旋体特异性抗体，(其余同实施例1)。
实施例20
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的丙型肝炎病毒抗体，(其余同实施例1)。
实施例21
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的爱滋病病毒抗体，(其余同实施例1)。
实施例22
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的单纯疱疹病毒抗体，(其余同实施例1)。
实施例23
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的脊髓灰质炎病毒抗体，(其余同实施例1)。
实施例24
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的柯萨奇病毒抗体，(其余同实施例1)。
实施例25
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的埃可病毒抗体，(其余同实施例1)。
实施例26
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的乙型肝炎表面抗原的抗体，(其余同实施例1)。
实施例27
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的蓝氏贾第边毛虫抗体，(其余同实施例1)。
实施例28
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的蛔虫抗体，(其余同实施例1)。
实施例29
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的巨噬细胞抗体，(其余同实施例1)。
实施例30
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的巨核细胞抗体，(其余同实施例1)。
实施例31
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的淋巴细胞抗体，(其余同实施例1)。
实施例32
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的单核细胞抗体，(其余同实施例1)。
实施例33
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的各种肿瘤细胞抗体，(其余同实施例1)。
实施例34
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的类风湿因子抗体，(其余同实施例1)。
实施例35
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的p53抗体，(其余同实施例1)。
实施例36
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的甲胎蛋白抗体，(其余同实施例1)。
实施例37
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的癌胚抗原抗体，(其余同实施例1)。
实施例38
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的白介素-2抗体，(其余同实施例1)。
实施例39
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备：向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的表皮细胞生长因子特异性抗体，(其余同实施例1)。
实施例40
一种纳米免疫磁颗粒分离细菌的方法，在1ml检测样本中，加入实施例1制备的纳米免疫磁性颗粒悬液5μl孵育30分钟，磁板吸引10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％的吐温-20的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在15分钟内使相应的致病性大肠杆菌分离。用此方法，加入不同的实施例制成的纳米免疫磁性颗粒，可以分别分离特异的细菌、病毒、寄生虫、细胞或生物大分子。
实施例41
一种纳米免疫磁颗粒分离病毒的方法，在1ml检测样本中，加入实施例2制备的纳米免疫磁性颗粒悬液20μl孵育5分钟，磁板吸引2分钟，弃上清后用含体积百分比为0.1％的吐温-20的0.005mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10分钟内使相应甲型肝炎病毒分离。用此方法，加入不同的实施例制成的纳米免疫磁性颗粒，可以分别分离特异的细菌、病毒、寄生虫、细胞或生物大分子。
实施例42
一种纳米免疫磁颗粒分离生物大分子的方法，在1ml检测样本中，加入实施例3制备的纳米免疫磁性颗粒悬液2μl孵育20分钟，磁板吸引5分钟，弃上清后用含体积百分比为0.08％的吐温-20的0.008mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在20分钟内使相应隐孢子虫分离。用此方法，加入不同的实施例制成的纳米免疫磁性颗粒，可以分别分离特异的细菌、病毒、寄生虫、细胞或生物大分子。
实施例43
实验结果
1.葡聚糖纳米磁颗粒及纳米免疫磁颗粒的性质
葡聚糖纳米磁颗粒为黑色的悬液。颗粒近似球形，粒径为40-60nm，核心为5nm。在生理缓冲液中保持稳定，在pH4-10溶液中不会聚集沉降。在磁场作用下颗粒迅速聚集，而不存在静磁场时颗粒没有磁矩，即具有超顺磁性。经氧化和抗体连接后，所制得的纳米免疫磁颗粒与葡聚糖纳米磁颗粒性质基本相同，为棕色悬液。
2.敏感性和特异性
当靶分子(应用时分别以致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、军团杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、变形杆菌、副溶血弧菌、腊样芽孢杆菌、霍乱弧菌、淋球菌，甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、乙型肝炎表面抗原，隐孢子虫，T淋巴细胞，肿瘤细胞、白介素-2等为靶分子)在水或磷酸盐缓冲液中稀释至102CFU/ml(克隆形成单位)或102pFU/ml(噬斑形成单位)或1pM时，回收率仍保持在90％以上。进一步实验证实，即使样品中只含有10个待检测的微生物或0.5pM的细胞因子，颗粒仍可捕获7-8个微生物或检出细胞因子。在杂菌数量为108CFU/ml或杂蛋白1μM时，敏感性为101-102CFU/ml或PFU/ml或1pM。特异性实验表明，该磁性纳米颗粒具有较强的特异性，未见交叉反应和非特异结合。
| 性质 | 微米免疫磁颗粒 | 纳米免疫磁颗粒 |
| 粒径(nm) | 1000～5000 | 20～100 |
| 加入量(μl/ml样品) | 20 | 5～10 |
| 富集时间(小时) | 18～24 | 2～4 |
| 检出限(cfu/ml或pfu/ml) | 100 | 10 |
实施例44
实际应用
将10克不同食品(米饭、蔬菜、肉制品、牛奶、饮料，固体样本切碎)装入250ml三角烧瓶中，加入90ml灭菌生理盐水，再加入1ml靶微生物(致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、结核分枝杆菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌、淋球菌，甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、爱滋病病毒、单纯疱疹病毒、髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、乙型肝炎表面抗原，沙眼衣原体和支原体，梅毒螺旋体，一种或一种以上)悬液(101CFU/ml或PFU/ml)。37℃富集培养0.5-8小时，每隔半小时取出样本，静置2分钟后，吸取1ml上清液按实施例40或实施例41或实施例42的方法进行检测，实验结果表明，即使在杂菌数量超过108CFU/ml下，经2.5小时富集后(牛奶需要4小时)，靶微生物便可从食品样本中被分离、检测出来，比常规分离(先经营养肉汤富集18-24小时，再经选择性培养基富集18-24小时)短得多。各种食物(成份)对免疫磁性分离没有大的干扰。
实施例45
取100ml河水、湖水、自来水、纯净水或污水样本，在其中加入靶微生物(致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、结核分枝杆菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌、淋球菌，甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、爱滋病病毒、单纯疱疹病毒、髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、乙型肝炎表面抗原，沙眼衣原体和支原体，梅毒螺旋体，一种或一种以上)，使其终浓度在101CFU/ml或PFU/ml。取1ml样本，不必富集，直接加入制备的上述免疫磁颗粒悬液2～20μl，孵育5～30分钟，磁板吸引2～10分钟，弃上清后洗涤一次，在短时间内(5～30分钟)可将靶细菌分离、检测出来。
实施例46
取1ml或1g分泌物或排泄物(唾液、尿、粪便等)、血清样本或血液样本，10倍稀释后，加入0.1ml靶物质(致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、结核分枝杆菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌、淋球菌，甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、爱滋病病毒、单纯疱疹病毒、髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、乙型肝炎表面抗原，沙眼衣原体和支原体，梅毒螺旋体，隐孢子虫，T淋巴细胞、单核细胞，各种肿瘤细胞，白介素-2，一种或一种以上)悬液(101CFU/ml或PFU/ml或1pM)。检测微生物时样品需37℃富集培养0.5-8小时，每隔半小时取出样本，静置2分钟后，吸取1ml上清液进行检测(即在1ml检测样本中加入制备的上述纳米免疫磁颗粒悬液2～20μl，孵育5～30分钟，磁板吸引2～10分钟，弃上清后洗涤一次，即可达到对靶细菌的分离目的)。非微生物样品不需要富集培养。结果表明，粪便、血清经2小时富集，唾液、尿液经4小时富集，可从样本中分离、检测出靶微生物。样品中的细胞和生物大分子也可以被检测出来。样品本身对免疫磁性分离效果没有明显干扰。
Claims (8)
1.一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，其特征是由下列步骤组成：
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备：
①将0.5～1.2mol/L的FeCl3·6H2O溶液10～20份与0.5～2.5mol/L FeCl2·4H2O溶液2～6份混合，在氮气氛下，滴加至10～30份重量/体积百分比为30％～70％的葡聚糖T-40溶液中，混合，50～70℃，水浴10～30分钟后，在剧烈搅拌下，10～30分钟内，向混合液中滴加3～7mol/L的氨水35-45份，温度保持50～70℃，并始终通氮气，制成悬液，所述份数为体积份；
②将悬液用乙酸或稀盐酸调至pH为6.0-8.0；
③将悬液中的聚集体在离心力为600×g，离心10～20分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为pH 6-8的0.005～0.02mol/L磷酸盐缓冲液，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5～10mg/ml；
④取步骤③制得的葡聚糖纳米磁颗粒悬液0.5～2.0份，加入10～30mmol/L NaIO4溶液0.1～0.5份，150转/分钟避光阻氧震荡0.5～12小时，加入1～3mol/L乙二醇0.1～0.3份终止氧化，用0.005～0.02mol/L磷酸盐缓冲液，4℃透析18-48小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3～8mg/ml，所述份数为体积份；
(2)纳米免疫磁颗粒的制备
向浓度为3～8mg/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10～30μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗体，混匀，4℃避光放置6～24小时，加入0.2～1mol/LNaBH4溶液还原10～60分钟，加入NaBH4的量为0.1～0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，多余的抗体用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
2.根据权利要求1所述的一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，其特征是所述
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备为：
①将0.7mol/L FeCl3·6H2O溶液16份与1.6mol/L FeCl2·4H2O溶液4份混合，在氮气氛下，滴加至20份重量/体积百分比为50％葡聚糖T-40溶液中，混合，60℃水浴15分钟后，在剧烈搅拌下，15分钟内，向混合液中滴加5mol/L的氨水40份，温度保持60℃，并始终通氮气，制成悬液，所述份数为体积份；
②将悬液用乙酸调至pH为7.0；
③将悬液中的聚集体在600×g，离心15分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为pH 7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml；
④取步骤③制得葡聚糖纳米磁颗粒1份，加入25mmol/L NaIO4溶液0.25份，150转/分钟避光阻氧震荡6小时后，加入2mol/L乙二醇0.2份终止氧化，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液，4℃透析24小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为6mg/ml，所述份数为体积份；
(2).纳米免疫磁性颗粒的制备为：
向浓度为6mg/ml葡聚糖纳米磁性颗粒悬液中加入25μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗体，混匀，4℃避光放置8小时，加入0.5mol/LNaBH4溶液还原30分钟，加入NaBH4的量为0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，多余的抗体用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
3.根据权利要求1或2所述的一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，其特征所述抗体为抗致病性大肠杆菌抗体、沙门氏菌属抗体、志贺氏菌属抗体、金黄色葡萄球菌抗体、嗜肺军团杆菌抗体、霍乱弧菌抗体、副溶血弧菌抗体、小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体、单核细胞增生李斯特氏菌抗体、结核分枝杆菌抗体、变形杆菌抗体、腊样芽孢杆菌抗体、淋球菌抗体之一，或沙眼衣原体抗体、支原体抗体，梅毒螺旋体特异性抗体之一。
4.根据权利要求1或2所述的一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，其特征所述抗体为甲型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、爱滋病病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体、脊髓灰质炎病毒抗体、柯萨奇病毒抗体、埃可病毒抗体、乙型肝炎表面抗原的抗体之一。
5.根据权利要求1或2所述的一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，其特征所述抗体为隐孢子虫抗体、蓝氏贾第边毛虫抗体、蛔虫抗体，巨噬细胞抗体、巨核细胞抗体、淋巴细胞抗体、单核细胞抗体、各种肿瘤细胞抗体，类风湿因子抗体、p53抗体、甲胎蛋白抗体、癌胚抗原抗体、白介素-2抗体、表皮细胞生长因子特异性抗体之一。
6.一种纳米免疫磁颗粒分离细菌、沙眼衣原体、支原体和梅毒螺旋体的方法，其特征是由如下步骤组成：在1ml检测样本中加入权利要求3制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2-20μl，孵育5-30分钟，磁板吸引2-10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温-20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10-20分钟内使相应靶细菌、沙眼衣原体、支原体和梅毒螺旋体分离。
7.一种纳米免疫磁颗粒分离病毒的方法，其特征是由如下步骤组成：在1ml检测样本中加入权利要求4制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2-20μl，孵育5-30分钟，磁板吸引2-10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温-20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10-20分钟内使相应靶病毒分离。
8.一种纳米免疫磁颗粒分离寄生虫、细胞和生物大分子的方法，其特征是由如下步骤组成：在1ml检测样本中加入权利要求5制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2-20μl，孵育5-30分钟，磁板吸引2-10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温-20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10-20分钟内使相应寄生虫、细胞和生物大分子分离。
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