CN1632582A - 一种纳米免疫磁颗粒、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米免疫磁颗粒、制备方法及应用,其纳米免疫磁颗粒是在纳米级Fe3O4的表面包裹有葡聚糖,葡聚糖与特异性抗体联接,纳米免疫磁颗粒用下述方法制成:(1)葡聚糖纳米磁颗粒的制备;(2)纳米免疫磁颗粒的制备;纳米免疫磁颗粒可用于分离细菌、病毒、寄生虫、细胞和生物大分子,本发明的纳米免疫磁颗粒具有良好的分散性和悬浮稳定性,在蛋白质连接反应和细菌分离过程中不会聚集;而且该成分对被检测物无任何毒性,被分离物的生物学性状和功能不受影响,处于亚致死状态的微生物也能被回收,减少了假阴性的发生,与快速检测技术相结合,可以实现致病微生物及生物大分子的快速检测与诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫磁性材料,特别是涉及一种纳米免疫磁颗粒、制备方法及应用。
背景技术
在人类历史上,传染病曾是人类健康与生命的大敌,夺去过千百万人的生命,给人类造成巨大的灾难。但人类一直在与传染病进行着长期不懈的斗争,并在二十世纪中期消灭了天花,许多传染病受到了控制。然而,进入二十世纪70年代以来,在人类传染病防治方面又出现了许多新情况,主要表现在:一是一些被控制的传染病又死灰复燃、卷土重来,如霍乱、结核等,重新对人类健康构成了威胁;二是一系列新传染病相继出现或被发现,其中一些已经给人类带来了巨大灾难和恐慌,如2003年流行的严重急性呼吸系统综合征(SARS)、2004年波及亚洲的禽流感,在非洲流行的埃博拉出血热、全世界流行的艾滋病等。有科学家预言:21世纪是传染病多发的世纪。根据“控制传染源——切断传播途径——保护易感人群”的流行病防治原则,建立一套快速、准确、敏感的病原体直接检测方法,是实现早期及时地发现病原体,防止传染病流行的重要环节,这对尚无疫苗保护的疾病更为重要。
但在实际检测中经常遇到的情况是:待检测样品中所含的杂菌数量很多,待检测的致病微生物(细菌或病毒)含量相对较低,同时待检测样品本身(如食品、血液、分泌物、排泄物等)或其中所含有的杂质成分也严重影响检测效果的灵敏度和准确性。
对于微量的病原微生物,其传统的检测方法是需要对样品中的目的微生物进行培养、扩增。由于扩增过程复杂,所以费时费力。而免疫学方法,如酶联免疫吸附试验(ELISA);分子生物学方法,如PCR技术、基因芯片技术等,虽然提高了检测的敏感性、具有检测的特异性,但这些技术受限于样本的前增菌和靶细菌或病毒的分离过程。因此,如何从复杂背景中快速分离、纯化、浓集出目的微生物,一直是制约检测与诊断效率的“瓶颈”,所以必须采取有效的分离、浓集措施来充分提高目的微生物的浓度。
蛋白质的检测在生物医学诊断中具有重要意义,而常规的酶联免疫吸附试验(ELISA)技术、仪器检测技术等的敏感度一般为pM~mM水平,待检样品中的杂质往往对检测结果有明显影响。所以,也需要对待检样品中的目的蛋白进行分离纯化。
此外,反映体内多种功能指标的细胞和生物大分子,包括各种免疫细胞、肿瘤细胞、细胞因子等检测对疾病的早期诊断、治疗及预后判断等具有重要意义。现在在分离这些生物大分子时多采用微米级磁颗粒。
磁颗粒可以作为生物大分子的载体,抗体包被的磁颗粒称为免疫磁颗粒,由于其既有结合抗原的特性又有磁性的特点,因此,在从复杂样品中分离、纯化与浓集目的微生物、细胞和生物大分子等方面具有较多优势,包括快速(5~20分钟)、特异性强、操作简便、使用范围广(几乎可用于所有样品的处理)等。在医学上较早即被用于微生物、细胞和生物大分子的分离与浓集,以及致病菌及致病病毒等的分离。但常规微米级免疫磁颗粒的分离效率不高,颗粒间相互作用较强、分散性较差。
纳米材料是20世纪90年代后得到迅猛发展的新材料。纳米磁材料(粒径小于10nm~100nm)在磁结构和磁性方面与一般磁颗粒有很大区别:纳米磁性颗粒,单位体积颗粒数目更多,比表面积更大;具有超顺磁性,磁相互作用很弱;它可在外加磁场作用下定向运动,使得某些特殊成份得以分离、浓集或纯化等。
目前,尚无纳米免疫磁颗粒及制备方法的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足,提供一种纳米免疫磁颗粒。
本发明的第二个目的是提供一种纳米免疫磁颗粒的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种纳米免疫磁颗粒分离细菌的方法。
本发明的第四个目的是提供一种纳米免疫磁颗粒分离病毒的方法。
本发明的第五个目的是提供一种纳米免疫磁颗粒分离寄生虫、细胞和生物大分子的方法。
本发明的技术方案概述如下:
一种纳米免疫磁颗粒,在纳米级Fe3O4的表面包裹有葡聚糖,所述葡聚糖与特异性抗体联接,所述纳米免疫磁颗粒用下述方法制成:(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备;(2)纳米免疫磁颗粒的制备。
一种纳米免疫磁颗粒的制备方法,由下列步骤组成:
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:
①将0.5~1.2mol/L的FeCl3·6H2O溶液10~20份与0.5~2.5mol/L FeCl2·4H2O溶液2~6份混合,在氮气氛下,滴加至10~30份重量/体积百分比为30%~70%的葡聚糖T-40溶液中,混合,50~70℃,水浴10~30分钟,在剧烈搅拌下,10~30分钟内,向混合液中滴加3~7mol/L的氨水35~45份,温度保持50~70℃,并始终通氮气,制成悬液,所述份数为体积份;
②将悬液用乙酸或稀盐酸调至pH为6.0~8.0;
③将悬液中的聚集体在离心力为600×g,离心10~20分钟去除;游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离,洗脱平衡液为pH 6~8的0.005~0.02mol/L磷酸盐缓冲液,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5~10mg/ml;
④取步骤③制得的葡聚糖纳米磁颗粒悬液0.5~2.0份,加入10~30mmol/L NaIO4溶液0.1~0.5份,150转/分钟避光阻氧震荡0.5~12小时,加入1~3mol/L乙二醇0.1~0.3份终止氧化,用0.005-0.02mol/L磷酸盐缓冲液,4℃透析18~48小时,去除过量的NaIO4,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3~8mg/ml,所述份数为体积份;
(2)纳米免疫磁颗粒的制备
向浓度为3~8mg/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10~30μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗体,混匀,4℃避光放置6~24小时,加入0.2~1mol/LNaBH4溶液还原,加入NaBH4的量为0.1~0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液,10~60分钟,多余的抗体用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
一种纳米免疫磁颗粒的制备方法,优选的是:
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备为:
①将0.7mol/L FeCl3·6H2O溶液16份与1.6mol/L FeCl2·4H2O溶液4份混合,在氮气氛下,滴加至20份重量/体积百分比为50%葡聚糖T-40溶液中,混合,60℃水浴15分钟,在剧烈搅拌下,15分钟内,向混合液中滴加5mol/L的氨水40份,温度保持60℃,并始终通氮气,制成悬液,所述份数为体积份;
②将悬液用乙酸调至pH为7.0;
③将悬液中的聚集体在600×g,离心15分钟去除;游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与-葡聚糖纳米磁颗粒分离,洗脱平衡液为pH 7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml;
④取步骤③制得葡聚糖纳米磁颗粒1份,加入25mmol/L NaIO4溶液0.25份,150转/分钟避光阻氧震荡6小时后,加入2mol/L乙二醇0.2份终止氧化,用0.01mol/L磷酸盐缓冲液,4℃透析24小时,去除过量的NaIO4,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为6mg/ml,所述份数为体积份;
(2).纳米免疫磁性颗粒的制备为:
向浓度为6mg/ml葡聚糖纳米磁性颗粒悬液中加入25μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗体,混匀,4℃避光放置8小时,加入0.5mol/LNaBH4溶液还原,加入NaBH4的量为0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液,30分钟,多余的抗体用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
所述抗体为抗致病性大肠杆菌抗体、沙门氏菌属抗体、志贺氏菌属抗体、金黄色葡萄球菌抗体、嗜肺军团杆菌抗体、霍乱弧菌抗体、副溶血弧菌抗体、小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体、单核细胞增生李斯特氏菌抗体、结核分枝杆菌抗体、变形杆菌抗体、腊样芽孢杆菌抗体、淋球菌抗体之一,或沙眼衣原体抗体、支原体抗体,梅毒螺旋体特异性抗体之一。
所述抗体还可以是甲型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、艾滋病病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体、脊髓灰质炎病毒抗体、柯萨奇病毒抗体、埃可病毒抗体、乙型肝炎表面抗原的抗体之一。
所述抗体也可以是隐孢子虫抗体、蓝氏贾第边毛虫抗体、蛔虫抗体,巨噬细胞抗体、巨核细胞抗体、淋巴细胞抗体、单核细胞抗体、各种肿瘤细胞抗体,类风湿因子抗体、p53抗体、甲胎蛋白抗体、癌胚抗原抗体、白介素-2抗体、表皮细胞生长因子特异性抗体之一。
一种纳米免疫磁颗粒分离细菌的方法,由如下步骤组成:在1ml检测样本中加入权利要求4制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2-20μl,孵育5~30分钟,磁板吸引2-10分钟,弃上清后用含体积百分比为0.05%~0.1%的吐温-20的0.005~0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次,在10~20分钟内使相应靶细菌分离。
一种纳米免疫磁颗粒分离病毒的方法,由如下步骤组成:在1ml检测样本中加入权利要求5制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2~20μl,孵育5~30分钟,磁板吸引2~10分钟,弃上清后用含体积百分比为0.05%~0.1%的吐温-20的0.005~0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次,在10~20分钟内使相应靶病毒分离。
一种纳米免疫磁颗粒分离寄生虫、细胞和生物大分子的方法,由如下步骤组成:在1ml检测样本中加入权利要求6制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2~20μl,孵育5~30分钟,磁板吸引2~10分钟,弃上清后用含体积百分比为0.05%~0.1%的吐温-20的0.005~0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次,在10~20分钟内使相应寄生虫、细胞和生物大分子分离。
本发明的纳米免疫磁颗粒是以Fe3O4为核心,外面包裹葡聚糖,葡聚糖通过功能基团与特异性抗体连接。该颗粒制备方法简单,葡聚糖作为包被材料,使得颗粒具有良好的分散性和悬浮稳定性,在蛋白质连接反应和细菌分离过程中不会聚集;而且该成分对被检测物无任何毒性,被分离物的生物学性状和功能不受影响,处于亚致死状态的微生物也能被回收,减少了假阴性的发生。在微生物和生物大分子的实际分离应用中,纳米免疫磁颗粒具有快速、高效、特异性分离、纯化、浓集目的微生物和生物大分子的特点。与快速检测技术相结合,可以实现致病微生物及生物大分子的快速检测与诊断。与常规微米级免疫磁颗粒的分离效率比,由于颗粒间相互作用较弱,分散性较好。
附图说明
图1为本发明采用TECNAI-20透射电子显微镜拍得的葡聚糖纳米磁颗粒电镜照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:
①将0.7mol/L FeCl3·6H2O溶液16ml与1.6mol/L FeCl2·4H2O溶液4ml混合,在氮气氛下,滴加至20ml 50%(w/v)葡聚糖T-40溶液中,将此混合液60℃水浴15分钟后,在剧烈搅拌下,向混合液中滴加5mol/L的氨水40ml,15分钟滴完,温度仍保持60℃,并始终通氮气防止氧化,制成悬液;
②生成的悬液用乙酸调至pH为7.0;
③将悬液中的聚集体经600×g离心15分钟去除;游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl)S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离,洗脱平衡液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4),收集的颗粒冷冻干燥,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml;
④取葡聚糖纳米磁颗粒1ml,加入25mmol/L NaIO4溶液0.25ml,150转/分钟避光阻氧震荡6小时后,加入2mol/L乙二醇0.2ml终止氧化,用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析24小时,去除过量的NaIO4,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为6mg/ml;
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备
向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗致病性大肠杆菌抗体,混匀后,4℃避光放置8小时,再用0.5mol/LNaBH4溶液还原30分钟,加入NaBH4的量为0.3ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液,使生成物具有稳定结构,多余的抗体用SephacrylS-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
图1为本发明采用TECNAI-20透射电子显微镜拍得的葡聚糖纳米磁颗粒电镜照片,放大倍数:×100000。照片显示葡聚糖纳米磁颗粒核心大小为5~10nm。
实施例2
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:
①将0.5mol/L FeCl3·6H2O溶液12ml与1.4mol/L FeCl2·4H2O溶液3ml混合,在氮气氛下,滴加至15ml 30%(w/v)葡聚糖T-40溶液中,将此混合液70℃水浴10分钟后,在剧烈搅拌下,向混合液中滴加3mol/L的氨水30ml,10分钟滴完,温度仍保持70℃,并始终通氮气防止氧化,制成悬液;
②生成的悬液用稀盐酸调至pH为6.0;
③将悬液中的聚集体经600×g离心10分钟去除;游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl)S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离,洗脱平衡液为0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0),收集的颗粒冷冻干燥,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5mg/ml;
④取葡聚糖纳米磁颗粒0.5ml,加入10mmol/L NaIO4溶液0.5ml,150转/分钟避光阻氧震荡0.5小时后,加入1mol/L乙二醇0.3ml终止氧化,用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析18小时,去除过量的NaIO4,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3mg/ml;
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备
向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的甲型肝炎病毒抗体,混匀后,4℃避光放置6小时,再用0.2mol/LNaBH4溶液还原10分钟,加入NaBH4的量为0.1ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液,使生成物具有稳定结构,多余的抗体用Sephacryl S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
实施例3
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:
①将1.2mol/L FeCl3·6H2O溶液10ml与2.5mol/L FeCl2·4H2O溶液3ml混合,在氮气氛下,滴加至13ml 70%(w/v)葡聚糖T-40溶液中,将此混合液50℃水浴30分钟后,在剧烈搅拌下,向混合液中滴加7mol/L的氨水26ml,30分钟滴完,温度仍保持50℃,并始终通氮气防止氧化,制成悬液;
②生成的悬液用稀盐酸调至pH为8.0;
③将悬液中的聚集体经600×g离心20分钟去除;游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl)S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离,洗脱平衡液为0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0),收集的颗粒冷冻干燥,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为10mg/ml;
④取葡聚糖纳米磁颗粒2.0ml,加入30mmol/L NaIO4溶液0.4ml,150转/分钟避光阻氧震荡12小时后,加入3mol/L乙二醇0.1ml终止氧化,用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析48小时,去除过量的NaIO4,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml;
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备
向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入30μg/mg颗粒量的隐孢子虫抗体,混匀后,4℃避光放置24小时,再用1mol/LNaBH4溶液还原60分钟,加入NaBH4的量为0.5ml/ml磁颗粒悬液,使生成物具有稳定结构,多余的抗体用Sephacryl S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
实施例4
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:
①将1.2mol/L FeCl3·6H2O溶液10ml与0.5mol/L FeCl2·4H2O溶液6ml混合,在氮气氛下,滴加至10ml 70%(w/v)葡聚糖T-40溶液中,将此混合液50℃水浴30分钟后,在剧烈搅拌下,向混合液中滴加7mol/L的氨水35ml,10分钟滴完,温度仍保持50℃,并始终通氮气防止氧化,制成悬液;(其余同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的沙门氏菌属抗体,(其余同实施例1)。
实施例5
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:
①将1.2mol/L FeCl3·6H2O溶液20ml与2.5mol/L FeCl2·4H2O溶液6ml混合,在氮气氛下,滴加至30ml 70%(w/v)葡聚糖T-40溶液中,将此混合液50℃水浴30分钟后,在剧烈搅拌下,向混合液中滴加7mol/L的氨水45ml,30分钟滴完,温度仍保持50℃,并始终通氮气防止氧化,制成悬液;(其余同实施例1)。
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入15μg/mg颗粒量的志贺氏菌属抗体,(其余同实施例1)。
实施例6
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:①②③(同实施例1),④取葡聚糖纳米磁颗粒2.0ml,加入30mmol/L NaIO4溶液0.1ml,150转/分钟避光阻氧震荡12小时后,加入3mol/L乙二醇0.1ml终止氧化,用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析48小时,去除过量的NaIO4,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml;
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入20μg/mg颗粒量的金黄色葡萄球菌抗体,(其余同实施例1)。
实施例7
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的嗜肺军团杆菌抗体,(其余同实施例1)。
实施例8
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入30μg/mg颗粒量的霍乱弧菌抗体,(其余同实施例1)。
实施例9
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg颗粒量的副溶血弧菌抗体,(其余同实施例1)。
实施例10
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入15μg/mg颗粒量的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体,(其余同实施例1)。
实施例12
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例2)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入15μg/mg颗粒量的单核细胞增生李斯特氏菌抗体,(其余同实施例2)。
实施例13
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例2)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的结核分枝杆菌抗体,(其余同实施例2)。
实施例14
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例3)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入30μg/mg颗粒量的变形杆菌抗体,(其余同实施例3)。
实施例15
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg颗粒量的腊样芽孢杆菌抗体,(其余同实施例1)。
实施例16
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg颗粒量的淋球菌抗体,(其余同实施例1)。
实施例17
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg颗粒量的沙眼衣原体抗体,(其余同实施例1)。
实施例18
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入20μg/mg颗粒量的支原体抗体,(其余同实施例1)。
实施例19
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入20μg/mg颗粒量的梅毒螺旋体特异性抗体,(其余同实施例1)。
实施例20
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的丙型肝炎病毒抗体,(其余同实施例1)。
实施例21
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的爱滋病病毒抗体,(其余同实施例1)。
实施例22
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的单纯疱疹病毒抗体,(其余同实施例1)。
实施例23
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的脊髓灰质炎病毒抗体,(其余同实施例1)。
实施例24
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的柯萨奇病毒抗体,(其余同实施例1)。
实施例25
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的埃可病毒抗体,(其余同实施例1)。
实施例26
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的乙型肝炎表面抗原的抗体,(其余同实施例1)。
实施例27
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的蓝氏贾第边毛虫抗体,(其余同实施例1)。
实施例28
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的蛔虫抗体,(其余同实施例1)。
实施例29
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的巨噬细胞抗体,(其余同实施例1)。
实施例30
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的巨核细胞抗体,(其余同实施例1)。
实施例31
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的淋巴细胞抗体,(其余同实施例1)。
实施例32
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的单核细胞抗体,(其余同实施例1)。
实施例33
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的各种肿瘤细胞抗体,(其余同实施例1)。
实施例34
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的类风湿因子抗体,(其余同实施例1)。
实施例35
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的p53抗体,(其余同实施例1)。
实施例36
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的甲胎蛋白抗体,(其余同实施例1)。
实施例37
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的癌胚抗原抗体,(其余同实施例1)。
实施例38
(1)。葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的白介素-2抗体,(其余同实施例1)。
实施例39
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:(同实施例1)
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备:向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的表皮细胞生长因子特异性抗体,(其余同实施例1)。
实施例40
一种纳米免疫磁颗粒分离细菌的方法,在1ml检测样本中,加入实施例1制备的纳米免疫磁性颗粒悬液5μl孵育30分钟,磁板吸引10分钟,弃上清后用含体积百分比为0.05%的吐温-20的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次,在15分钟内使相应的致病性大肠杆菌分离。用此方法,加入不同的实施例制成的纳米免疫磁性颗粒,可以分别分离特异的细菌、病毒、寄生虫、细胞或生物大分子。
实施例41
一种纳米免疫磁颗粒分离病毒的方法,在1ml检测样本中,加入实施例2制备的纳米免疫磁性颗粒悬液20μl孵育5分钟,磁板吸引2分钟,弃上清后用含体积百分比为0.1%的吐温-20的0.005mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次,在10分钟内使相应甲型肝炎病毒分离。用此方法,加入不同的实施例制成的纳米免疫磁性颗粒,可以分别分离特异的细菌、病毒、寄生虫、细胞或生物大分子。
实施例42
一种纳米免疫磁颗粒分离生物大分子的方法,在1ml检测样本中,加入实施例3制备的纳米免疫磁性颗粒悬液2μl孵育20分钟,磁板吸引5分钟,弃上清后用含体积百分比为0.08%的吐温-20的0.008mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次,在20分钟内使相应隐孢子虫分离。用此方法,加入不同的实施例制成的纳米免疫磁性颗粒,可以分别分离特异的细菌、病毒、寄生虫、细胞或生物大分子。
实施例43
实验结果
1.葡聚糖纳米磁颗粒及纳米免疫磁颗粒的性质
葡聚糖纳米磁颗粒为黑色的悬液。颗粒近似球形,粒径为40-60nm,核心为5nm。在生理缓冲液中保持稳定,在pH4-10溶液中不会聚集沉降。在磁场作用下颗粒迅速聚集,而不存在静磁场时颗粒没有磁矩,即具有超顺磁性。经氧化和抗体连接后,所制得的纳米免疫磁颗粒与葡聚糖纳米磁颗粒性质基本相同,为棕色悬液。
2.敏感性和特异性
当靶分子(应用时分别以致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、军团杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、变形杆菌、副溶血弧菌、腊样芽孢杆菌、霍乱弧菌、淋球菌,甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、乙型肝炎表面抗原,隐孢子虫,T淋巴细胞,肿瘤细胞、白介素-2等为靶分子)在水或磷酸盐缓冲液中稀释至102CFU/ml(克隆形成单位)或102PFU/ml(噬斑形成单位)或1pM时,回收率仍保持在90%以上。进一步实验证实,即使样品中只含有10个待检测的微生物或0.5pM的细胞因子,颗粒仍可捕获7-8个微生物或检出细胞因子。在杂菌数量为108CFU/ml或杂蛋白1μM时,敏感性为101-102CFU/ml或PFU/ml或1pM。特异性实验表明,该磁性纳米颗粒具有较强的特异性,未见交叉反应和非特异结合。
性质 | 微米免疫磁颗粒 | 纳米免疫磁颗粒 |
粒径(nm) | 1000~5000 | 20~100 |
加入量(μl/ml样品) | 20 | 5~10 |
富集时间(小时) | 18~24 | 2~4 |
检出限(cfu/ml或pfu/ml) | 100 | 10 |
实施例44
实际应用
将10克不同食品(米饭、蔬菜、肉制品、牛奶、饮料,固体样本切碎)装入250ml三角烧瓶中,加入90ml灭菌生理盐水,再加入1ml靶微生物(致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、结核分枝杆菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌、淋球菌,甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、爱滋病病毒、单纯疱疹病毒、髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、乙型肝炎表面抗原,沙眼衣原体和支原体,梅毒螺旋体,一种或一种以上)悬液(101CFU/ml或PFU/ml)。37℃富集培养0.5-8小时,每隔半小时取出样本,静置2分钟后,吸取1ml上清液按实施例40或实施例41或实施例42的方法进行检测,实验结果表明,即使在杂菌数量超过108CFU/ml下,经2.5小时富集后(牛奶需要4小时),靶微生物便可从食品样本中被分离、检测出来,比常规分离(先经营养肉汤富集18-24小时,再经选择性培养基富集18-24小时)短得多。各种食物(成份)对免疫磁性分离没有大的干扰。
实施例45
取100ml河水、湖水、自来水、纯净水或污水样本,在其中加入靶微生物(致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、结核分枝杆菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌、淋球菌,甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、爱滋病病毒、单纯疱疹病毒、髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、乙型肝炎表面抗原,沙眼衣原体和支原体,梅毒螺旋体,一种或一种以上),使其终浓度在101CFU/ml或PFU/ml。取1ml样本,不必富集,直接加入制备的上述免疫磁颗粒悬液2~20μl,孵育5~30分钟,磁板吸引2~10分钟,弃上清后洗涤一次,在短时间内(5~30分钟)可将靶细菌分离、检测出来。
实施例46
取1ml或1g分泌物或排泄物(唾液、尿、粪便等)、血清样本或血液样本,10倍稀释后,加入0.1ml靶物质(致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、结核分枝杆菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌、淋球菌,甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、爱滋病病毒、单纯疱疹病毒、髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、乙型肝炎表面抗原,沙眼衣原体和支原体,梅毒螺旋体,隐孢子虫,T淋巴细胞、单核细胞,各种肿瘤细胞,白介素-2,一种或一种以上)悬液(101CFU/ml或PFU/ml或1pM)。检测微生物时样品需37℃富集培养0.5-8小时,每隔半小时取出样本,静置2分钟后,吸取1ml上清液进行检测(即在1ml检测样本中加入制备的上述纳米免疫磁颗粒悬液2~20μl,孵育5~30分钟,磁板吸引2~10分钟,弃上清后洗涤一次,即可达到对靶细菌的分离目的)。非微生物样品不需要富集培养。结果表明,粪便、血清经2小时富集,唾液、尿液经4小时富集,可从样本中分离、检测出靶微生物。样品中的细胞和生物大分子也可以被检测出来。样品本身对免疫磁性分离效果没有明显干扰。
Claims (9)
1.一种纳米免疫磁颗粒,其特征是,在纳米级Fe3O4的表面包裹有葡聚糖,所述葡聚糖与特异性抗体联接,所述纳米免疫磁颗粒用下述方法制成:(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备;(2)纳米免疫磁颗粒的制备。
2.一种纳米免疫磁颗粒的制备方法,其特征是由下列步骤组成:
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备:
①将0.5~1.2mol/L的FeCl3·6H2O溶液10~20份与0.5~2.5mol/L FeCl2·4H2O溶液2~6份混合,在氮气氛下,滴加至10~30份重量/体积百分比为30%~70%的葡聚糖T-40溶液中,混合,50~70℃,水浴10~30分钟,在剧烈搅拌下,10~30分钟内,向混合液中滴加3~7mol/L的氨水35-45份,温度保持50~70℃,并始终通氮气,制成悬液,所述份数为体积份;
②将悬液用乙酸或稀盐酸调至pH为6.0-8.0;
③将悬液中的聚集体在离心力为600×g,离心10~20分钟去除;游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离,洗脱平衡液为pH6-8的0.005~0.02mol/L磷酸盐缓冲液,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5~10mg/ml;
④取步骤③制得的葡聚糖纳米磁颗粒悬液0.5~2.0份,加入10~30mmol/L NaIO4溶液0.1~0.5份,150转/分钟避光阻氧震荡0.5~12小时,加入1~3mol/L乙二醇0.1~0.3份终止氧化,用0.005~0.02mol/L磷酸盐缓冲液,4℃透析18-48小时,去除过量的NaIO4,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3~8mg/ml,所述份数为体积份;
(2)纳米免疫磁颗粒的制备
向浓度为3~8mg/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10~30μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗体,混匀,4℃避光放置6~24小时,加入0.2~1mol/LNaBH4溶液还原,加入NaBH4的量为0.1~0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液,10~60分钟,多余的抗体用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
3.据权利要求2所述的一种纳米免疫磁颗粒的制备方法,其特征是所述
(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备为:
①将0.7mol/L FeCl3·6H2O溶液16份与1.6mol/L FeCl2·4H2O溶液4份混合,在氮气氛下,滴加至20份重量/体积百分比为50%葡聚糖T-40溶液中,混合,60℃水浴15分钟,在剧烈搅拌下,15分钟内,向混合液中滴加5mol/L的氨水40份,温度保持60℃,并始终通氮气,制成悬液,所述份数为体积份;
②将悬液用乙酸调至pH为7.0;
③将悬液中的聚集体在600×g,离心15分钟去除;游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离,洗脱平衡液为pH7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml;
④取步骤③制得葡聚糖纳米磁颗粒1份,加入25mmol/L NaIO4溶液0.25份,150转/分钟避光阻氧震荡6小时后,加入2mol/L乙二醇0.2份终止氧化,用0.01mol/L磷酸盐缓冲液,4℃透析24小时,去除过量的NaIO4,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为6mg/ml,所述份数为体积份;
(2).纳米免疫磁性颗粒的制备为:
向浓度为6mg/ml葡聚糖纳米磁性颗粒悬液中加入25μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗体,混匀,4℃避光放置8小时,加入0.5mol/LNaBH4溶液还原,加入NaBH4的量为0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液,30分钟,多余的抗体用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
4.根据权利要求2或3所述的一种纳米免疫磁颗粒的制备方法,其特征所述抗体为抗致病性大肠杆菌抗体、沙门氏菌属抗体、志贺氏菌属抗体、金黄色葡萄球菌抗体、嗜肺军团杆菌抗体、霍乱弧菌抗体、副溶血弧菌抗体、小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体、单核细胞增生李斯特氏菌抗体、结核分枝杆菌抗体、变形杆菌抗体、腊样芽孢杆菌抗体、淋球菌抗体之一,或沙眼衣原体抗体、支原体抗体,梅毒螺旋体特异性抗体之一。
5.根据权利要求2或3所述的一种纳米免疫磁颗粒的制备方法,其特征所述抗体为甲型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、爱滋病病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体、脊髓灰质炎病毒抗体、柯萨奇病毒抗体、埃可病毒抗体、乙型肝炎表面抗原的抗体之一。
6.根据权利要求2或3所述的一种纳米免疫磁颗粒的制备方法,其特征所述抗体为隐孢子虫抗体、蓝氏贾第边毛虫抗体、蛔虫抗体,巨噬细胞抗体、巨核细胞抗体、淋巴细胞抗体、单核细胞抗体、各种肿瘤细胞抗体,类风湿因子抗体、p53抗体、甲胎蛋白抗体、癌胚抗原抗体、白介素-2抗体、表皮细胞生长因子特异性抗体之一。
7.一种纳米免疫磁颗粒分离细菌的方法,其特征是由如下步骤组成:在1ml检测样本中加入权利要求4制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2-20μl,孵育5-30分钟,磁板吸引2-10分钟,弃上清后用含体积百分比为0.05%~0.1%的吐温-20的0.005~0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次,在10-20分钟内使相应靶细菌分离。
8.一种纳米免疫磁颗粒分离病毒的方法,其特征是由如下步骤组成:在1ml检测样本中加入权利要求5制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2-20μl,孵育5-30分钟,磁板吸引2-10分钟,弃上清后用含体积百分比为0.05%~0.1%的吐温-20的0.005~0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次,在10-20分钟内使相应靶病毒分离。
9.一种纳米免疫磁颗粒分离寄生虫、细胞和生物大分子的方法,其特征是由如下步骤组成:在1ml检测样本中加入权利要求6制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2-20μl,孵育5-30分钟,磁板吸引2-10分钟,弃上清后用含体积百分比为0.05%~0.1%的吐温-20的0.005~0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次,在10-20分钟内使相应寄生虫、细胞和生物大分子分离。
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