CN1300318C - 一种编码丝状支原体丝状亚种n端脂蛋白的dna - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的编码丝状支原体丝状亚种N端脂蛋白的DNA、其制备方法、其编码的蛋白质及其在牛传染性胸膜肺炎血清学检测中的用途。本发明利用体外诱变技术将支原体脂蛋白LppQ基因阅读框架N端582个核苷酸其中1个UGA核苷酸诱变为UGG，将诱变后的脂蛋白LppQ DNA序列与表达载体连接后转化宿主细胞进行体外表达，所表达的重组蛋白可作为抗原应用于牛传染性胸膜肺炎的血清学诊断。

Description

一种编码丝状支原体丝状亚种N端脂蛋白的DNA

技术领域

本发明涉及一种DNA，尤其涉及一种编码丝状支原体丝状亚种N端脂蛋白的DNA、其制备方法、其编码的蛋白质及其在医药上的用途。

背景技术

丝状支原体丝状亚种SC型(Mycoplasma mycoide subsp.mycoides SC，MmmSC)是引起牛传染性胸膜肺炎(Contagious Bovine Pleuroneumonia，CBPP)的病原，该病又称牛肺疫，主要以肺小叶间淋巴管浆液—渗出性纤维素性炎和浆液纤维素性胸膜肺炎为特征，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。该病危害严重，这不仅是由于较高的发病率和死亡率，更是由于其严重地限制了牛及牛肉制品的对外贸易。因此有该病流行的国家，对其的控制和消灭都非常重视。CBPP常表现为亚急性或无临床症状感染，这给该病的消灭带来很大困难。在无牛肺疫国家血清学监测和屠宰场肉品监测成为控制该病爆发和流行的重要手段。

从感染动物分离到丝状支原体丝状亚种SC生物型对于CBPP的最终诊断是必须的。MmmSC营养需求非常复杂，依赖于多种营养基质，包括维生素、核苷酸、类脂化合物、脂肪酸和氨基酸。丝状支原体丝状亚种在液体培养基中繁殖需要包括大量血清作为糖的来源。通气培养可以增加丝状支原体丝状亚种培养速度。在生长比较快的培养基中丝状支原体丝状亚种呈丝状生长，在培养到达终点主要呈现串珠状、短丝状，最后仅有少量小球状。

在超过半个世纪的时间中有几种血清学方法被描述，其中包括玻片凝集试验(SAT)，补体结合试验(CFT)，琼脂扩散试验(AGP)，被动血凝抑制试验(PHA)和微量凝集试验(MA)。这些试验的局限性也已经被证明。酶联免疫试验虽然具有很好的敏感性而且操作更加方便，但是CFT方法仍然被建议在欧洲和非洲继续使用。PHA方法看起来实用，在筛选检查时敏感性比CFT高出20％，但在从未发生CBPP的地区假阳性约有2％。

Onoviran and Taylor-Robinson在1979年首次报道了CBPP的酶联免疫试验(ELISA)。Poumarat(1989)应用ELISA、CFT、PHA等几种方法对bovinegroup7、M.capricolum subsp.capricolum、M.mmLC和M.mycoides subsp capri等菌株感染牛的抗体反应进行监测并进行比较。用M.mmSC株制成的ELISA抗原比CFT或PHA更加特异，在bovine group7和M.mmLC感染牛特定时期内检测出的抗体滴度较高。Le Goff(1989，1990)应用ELISA和CFT对M.mmSC感染和对照的5头牛进行了检测。在血清阳转前1-2周气管洗液中就能够分离到支原体。补体结合抗体比ELISA抗体早几周出现，但是与CFT不同的是，ELISA抗体在病原体排泄期间和排泄之后都呈阳性。

吴裕祥等(1988)报道了一个微量凝集试验并与CFT进行了比较，证明MA更敏感、特异，操作简便，适用于大量样品的监测。

支原体感染的最终确认通常依靠生长抑制试验(GI)或免疫荧光试验(IF)。这些试验能够区分2个支原体亚种，但不能区分LC和SC两个生物型。Poumarat(1991)建立了一种快速斑点免疫结合试验，其主要优点是快速并适合大量样品的检测。

到目前为止补体结合试验(CFT)仍然是OIE推荐使用最为广泛的一种血清学诊断方法。该方法在CBPP流行的急性期较为敏感，在急性期过后或感染3个月后，其敏感性大大降低。

Le Goff和Thiaucourt从133株支原体中筛选出1株特异性单抗，该单抗能够识别一种分子量约为80KDa的MmmSC抗原决定簇并建立了用于CBPP血清学诊断的竞争ELISA(C-ELISA)方法。我们引进了CFT和C-ELISA两种诊断试剂，发现C-ELISA方法对CFT标准阳性血清检测为阴性，而且其所识别的约80KDa的蛋白质抗原性尚未确定。所以C-ELISA诊断方法的应用还需做大量的试验来予以确认。

脂蛋白LppQ的抗原性已经确定并广泛认为存在于MmmSC非洲株、欧洲株和疫苗株，而在丝状支原体簇的其他成员中未发现。据报道LppQ基因的N末端编码的脂蛋白在自然感染和试验感染牛体内均可诱导产生强大的早期免疫反应，且抗体持续期长，是一种比较理想的诊断抗原。

但是通过对脂蛋白LppQ全基因测序结果发现，在支原体的蛋白质翻译系统中UGA并不代表终止密码子，而代表色氨酸，而且使用频率比UGG高得多。在体外表达中必须对目的基因进行体外诱变，将UGA改造成UGG，这样才能进行体外表达。

MmmSC脂蛋白基因全长1764bp，阅读框架1335bp，编码445个氨基酸，分子量约为52.08Kda。经过对该蛋白质抗原性分段分析，结果表明N末端具有良好的抗原特性，在自然感染和试验感染牛体内均可诱导产生强大的早期免疫反应，且抗体持续期长，是一种比较理想的诊断抗原。但在该蛋白质阅读框架中存在10个UGA密码子，这些密码子必须改造成同义密码子UGG才能在体外进行表达。

Joachim Frey等人根据脂蛋白LppQ的抗原性对其阅读框架1335个核苷酸进行了改造，将其中9个UGA诱变为UGG，表达的蛋白质分子量约为48kDa。但体外诱变脂蛋白LppQ基因的9个核苷酸操作异常复杂，成功率非常低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的编码丝状支原体丝状亚种N端脂蛋白的DNA，其编码的蛋白质可作为抗原应用于牛传染性胸膜肺炎的血清学诊断。

本发明要解决的技术问题是通过以下途径来实现的：

利用体外诱变技术将脂蛋白LppQ基因阅读框架N端582个核苷酸其中1个UGA核苷酸诱变为UGG，其诱变后的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1所述，将诱变后的脂蛋白LppQ DNA序列与表达载体连接后转化宿主细胞进行体外表达，将所表达的重组蛋白(其氨基酸序列见序列表SEQ ID No.2所述)收集纯化后作为抗原用于牛传染性胸膜肺炎的血清学诊断。

本发明的详细描述：

首先提取支原体的基因组DNA，设计含有酶切位点的一对特异性引物，以所提取的DNA为模板进行PCR扩增，回收扩增的特异性片段经酶切后将回收的片断连接到PUC载体上，以该载体作为模板，加入一对载体通用引物和一对突变引物进行聚合酶链式反应，将再次扩增到的特异性片断连接到测序载体中进行核苷酸序列测定，经序列测定后证实所扩增的特异性片段为所需的突变片段，将该突变目的片断定向克隆到Pet32a载体中，在IPTG诱导下进行表达，SDS-PAGE显示表达蛋白质分子量为43Kda，利用亲和层析技术对该蛋白质进行纯化，将纯化后的蛋白质作为包被抗原利用间接ELISA方法检测牛传染性胸膜肺炎，结果表明该抗原具有非常好的特异性和敏感性。

目前应用的牛传染性胸膜肺炎血清学诊断方法一补体结合试验操作非常繁琐，需进行专业培训才能进行，另外该方法尚存在特异性不高的缺点。而重组N端脂蛋白具有非常好的特异性，但脂蛋白体外表达的技术难度高，不易获得。本项发明利用体外定点诱变技术解决了脂蛋白体外表达的技术难题，与国外进行的N端脂蛋白表达相比，本项发明采用更加简单的方法而得到相同的效果，完全可以替代国外产品，重组表达的脂蛋白N端可以作为抗原用于血清学诊断，将所表达的蛋白质作为包被抗原用间接ELISA方法检测牛传染性胸膜肺炎，结果表明该抗原具有非常好的特异性和敏感性，用该抗原建立的间接ELISA方法操作非常简单，容易推广应用，适合进行大规模血清学调查，与国外技术相比操作更加简单，特异性、敏感性均符合要求。

附图说明

图1第一次PCR扩增结果

图2第一次PCR扩增产物的重组质粒酶切鉴定结果

图3重组表达蛋白SDS-PAGE电泳结果

图4重组表达蛋白Western blotting结果

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。

[实施例1]编码丝状支原体丝状亚种N端脂蛋白的突变DNA的制备

首先提取支原体(购买自中国兽药监察所)的基因组DNA，设计含有酶切位点EcoR I/Sal I的一对特异性引物，引物序列分别为A：5，GCGGAATTCCCATTAGTTGTTGTTTCATGTA，3(SEQ ID No.3)和D：5，GACGTCGACATTAAAGTTTCTAGCTTGTTG，3(SEQ ID No.4)，以所提取的支原体基因组DNA为模板，利用Pyrobest^TM DNA聚合酶和引物A、D扩增脂蛋白LppQ N末端基因，100μl反应体系如下：

10xBuffer                       10.0μl

2.5mMdNTPs                      8.0μl

10μmol引物A                    5.0μl

10μmol引物D                    5.0μl

模板DNA                         1.0μl

10u/μl Taqpolymerase           1.0μl

纯水                            70μl

扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸10min。得到了582bp的特异性扩增片断，见图1，其中第1和第2泳道为扩增产物，第3泳道为DL2000 Marker；将扩增的产物经EcoR I/Sal I酶切，酶切结果见图2，其中泳道1为DL2000 Marker，泳道2为EcoR I/Sal I酶切结果，泳道3为EcoR I酶切结果，泳道4为Sal I酶切结果。将酶切后的扩增片断连接到PUC载体上。设计了一对突变引物，引物序列分别：5，TCTTGTTTTTGCCACTCATTTTTTG，3(SEQ ID No.5)和：5，CAAAAAATGAGTGGCAAAAACAAGA，3(SEQ ID No.6)。以该重组PUC载体为模板，加入一对载体通用引物和该突变引物进行PCR扩增，100μl反应体系如下：

10xBuffer                        10.0μl

2.5mMdNTPs                       8.0μl

10μmol通用引物                  5.0μl

10μmol引物B                     5.0μl

10μmol引物C                     5.0μl

模板DNA                          1.0μl

10u/μl Taqpolymerase            1.0μl

纯水                             65μl

扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸10min，将获得的特异性片断连接到测序载体中进行核苷酸序列测定，其核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1所述，其编码的蛋白质的氨基酸序列见序列表SEQ ID No.2所述。

[实施例2]重组编码丝状支原体丝状亚种N端脂蛋白的突变DNA的表达

经突变后的LppQ N末端基因和Pet32a载体(购自Navagen公司)用EeoRI/Sal I酶切，胶回收酶切片段，用T₄DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物转化BL21(DE3)感受态细胞，转化后的细菌涂布于含50μg/ml的氨基苄青霉素钠LB细菌培养基平板上。挑取白色菌落，接种于LB(含50μg/ml氨基苄青霉素钠)液体培养基内，37℃摇床培养16h后，提取质粒DNA。用PCR及限制性内切酶鉴定重组质粒，阳性者按1％接种LB(含50μg/ml氨基苄青霉素钠)液体培养基，37℃摇床培养3h后(OD值为0.6-0.8)，加入IPTG至终浓度为1mm，诱导3h。将培养液以16000g离心10min，收集菌体，将收集到的粗蛋白上样进行SDS-PAGE₄电泳，其蛋白质SDS-PAGE电泳图谱与Westernblotting结果分别见图3和图4，最后使用Novagen公司蛋白纯化试剂盒将所得蛋白质纯化即得。

[试验例1]利用补体结合试验进行血清学检测

一、材料准备

1、试验用巴比妥缓冲液，使用时作1∶5稀释，配制方法如下：

                       巴比妥缓冲液(VB)配制

        氯化钠                                85克

        巴比妥酸                              5.75克

        巴比妥钠                              3.75克

        氯化美(MgCl₂·6H₂O)                1.68克

        氯化钙(CaCl₂·2H₂O)                0.37克

        灭菌双蒸水                            2000ml

      用盐酸调节pH至7.3。使用时用灭菌双蒸水作1∶5稀释。

2、绵羊红细胞悬液使用阿氏液，制备方法如下：

                            阿氏液配制

                         A液

        葡萄糖                            20.5克

        灭菌双蒸水                        200ml

                         B液

        柠檬酸钠                          12.0克

        氯化钠                            4.2

        灭菌双蒸水                        800ml

用5％柠檬酸调节B液PH至6.1。混合A液、B液，用蔡氏滤器过滤除菌。

3、6％绵羊红细胞悬液制备方法如下：

无菌采集健康公绵羊静脉血，脱纤后用爱氏液悬浮，1500g洗涤3次，每次10分钟。收集红细胞沉淀，用爱氏液配成6％悬液，4℃放置48小时后使用，但最多使用不超过2周。

4、供试样品：所用抗原为国际标准牛传染性胸膜肺炎补体结合试验抗原(从普通生物试剂公司购买得到)，阳性血清、阴性血清由葡萄牙国家兽医参考实验室惠赠(也可从普通生物试剂公司购买得到，效果等同)，为用国际标准品。溶血素、补体由中国兽药监察所购买，按说明书使用。溶血素效价滴定如下：

溶血素效价的测定：取0.1ml溶血素连续作10倍稀释至1∶1000作为基础液，其稀释方法见表1。

                               表1 溶血素稀释法    单位ml

试管号	1	2	3	4	5	6	7	8
									稀释度	1∶2000	1∶3000	1∶4000	1∶5000	1∶6000	1∶8000	1∶10000	1∶15000
1∶1000溶血素	1	1	1	1	1	1	1	1
									VB	1.0	2.0	3.0	4.0	5.0	7.0	9.0	14.0
总量	2.0	3.0	4.0	5.0	6.0	8.0	10.-	15.0

按照表1程序加入各种试验成份，在37-38℃水浴30分钟，1500g离心10分钟。将100％溶血管的液体与等体积VB混合制成50％溶血比色管。能使红细胞液50％溶血(HD50)的溶血素最大稀释度作为溶血素效价，使用12个单位的HD50。

如表2中第8管溶血程度达到50％，而对照管都没有溶血现象，则该批溶血素的效价即为1∶8000，使用12个单位的HD50，则应将溶血素作8000/12＝666.6倍稀释。

                                            表2 溶血素效价测定                                          单位ml

试管号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
												溶血素稀释度	1∶100	1∶1000	1∶2000	1∶3000	1∶4000	1∶5000	1∶6000	1∶8000	1∶10000	1∶15000
溶血素用量	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
												1∶20补体	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	-
6％红细胞	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
												VB	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.8
振荡后37-38℃水浴30分钟
												结果判定	-	-	-	-	-	-	±	±	±	±	+

符号说明：“+”抑制溶血，“±”部分溶血，“-”全部溶血。

5、致敏绵羊红细胞制备：使用12HD50(50％溶血程度)的溶血素与等体积的6％绵羊红细胞混合，37℃水浴30分钟，期间间隔5分钟摇动一次。

6、补体购买自哈尔滨兽医生物药品厂，效价滴定方法如下：

使用VB稀释补体，具体操作如表3和表4。

                                     表3

管号	1	2	3	4	5	6
							VB(ml)	1.45	1.70	1.95	2.20	2.45	2.70
C’(ml)	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
							稀释度	1∶30	1∶35	1∶40	1∶45	1∶50	1∶55

                                        表4

管号	1	2	3	4	5	6
							补体稀释度	1∶30	1∶35	1∶40	1∶45	1∶50	1∶55
VB(ml)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
							C’(ml)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
最终补体稀释度	1∶60	1∶70	1∶80	1∶90	1∶100	1∶110

将1∶30到1∶110各稀释度补体25μl加入96孔微量反应板中，每个补体稀释度孔中加入25μl抗原，25μlVB，震荡混匀后37℃水浴30分钟。加入25μl致敏后的绵羊红细胞，震荡混匀后37℃水浴30分钟后125g离心2分钟判定结果。

补体效价判定：使绵羊红细胞100％溶解的补体最高稀释度即是该补体效价。检测时使用2.5U补体。例如补体在1∶60时使绵羊红细胞100％溶解，那么该补体效价为60，使用时应作60/2.5＝24倍稀释。

7、抗原效价滴定方法如下：

1)、用VB 2倍连续稀释抗原，从1∶10到1∶640；

2)、用VB 2倍连续稀释阳性血清，从1∶10到1∶1280；

3)、使用96孔微量反应板对抗原进行方阵滴定。具体操作如表5。每孔分别加入对应稀释度的抗原25μl，阳性血清25μl，2.5U补体25μl，震荡混匀后37℃水浴30分钟。每孔加入致敏后的绵羊红细胞25μl，震荡混匀后37℃水浴30分钟。125g离心2分钟判定结果。同时设0.5U、1U、2.5U补体对照，致敏红细胞对照，每个抗原稀释度的抗补体对照。

                                                    表5

	1	2	3	4	5	6	7	8	抗原
										A	++++	++++	++++	++++	+++	+	-	-	1∶10
B	++++	++++	++++	++++	++++	++	+	-	1∶20
										C	++++	++++	++++	++++	++++	+++	+	-	1∶40
D	++++	++++	++++	++++	++++	+++	+	-	1∶80
										E	+	++	+++	++	++	+	-	-	1∶160
F	-	-	-	-	-	-	-	-	1∶320
										G	-	-	-	-	-	-	-	-	1∶640
阳性血清	1∶10	1∶20	1∶40	1∶80	1∶160	1∶320	1∶640	1∶1280

当对照全部成立情况下，补体100％被结合的最高稀释度阳性血清对应的抗原最高稀释度即是抗原效价。如表5所示，当阳性血清1∶160，抗原1∶80时，抗原抗体复合物能够结合100％补体，那么该抗原效价为1∶80。检测时使用2个单位，将抗原作80/2＝40倍稀释。

说明：以上所用所有生化试剂均可从生化试剂公司购买得到。

二、试验方法

1、将被检血清、标准阴、阳性血清均用巴比妥缓冲液作1∶10稀释于56℃水浴中灭活30分钟。

2、在96孔微量反应板中，每孔加入25μl抗原，25μl被检血清，25μl2.5U补体，震荡混匀后37℃水浴30分钟。

3、每孔加入25μl致敏后的绵羊红细胞，震荡混匀后37℃水浴30分钟。

4、设标准阳性血清、阴性血清、补体对照、溶血素对照、以抗原抗补体活性对照。

三、判定

1、96孔微量反应板125g离心2分钟或静止10分钟，当阴性对照、阳性对照、补体对照、红细胞对照成立情况下，判定被检孔补体结合百分率。

2、判定补体结合百分率方法如下∶

表6 补体结合百分率判定

补体结合百分率	判定结果
		100％	++++
75％	+++
		50％	++
25％	+
		0％	-

3、判定标准：

血清1∶10稀释时，++++为阳性；

血清1∶10稀释时，+、++、+++为疑似；

血清1∶10稀释时，-为阴性。

对于疑似样品重新采集血清进行复检，如果仍为疑似，则做病理学和病原学检查。

4、试验结果

试验结果见表7。

表7 应用补体结合试验(CFT)对人工感染牛传染性胸膜肺炎阳性牛血清检测结果

牛号只	人工感染后采血时间(天)	供试样品		阳性对照	阴性对照	补体对照	红细胞对照
								1	21	阳性		阳性	阴性	成立	成立
1	28	阳性		阳性	阴性	成立	成立
								3	9	阳性		阳性	阴性	成立	成立
3	14	阳性		阳性	阴性	成立	成立
								3	43	阳性		阳性	阴性	成立	成立
4	9	阳性		阳性	阴性	成立	成立
								4	14	阳性		阳性	阴性	成立	成立
4	43	阳性		阳性	阴性	成立	成立
								4	58	阳性		阳性	阴性	成立	成立
5	9	阳性		阳性	阴性	成立	成立
								5	14	阳性		阳性	阴性	成立	成立
5	21	阳性		阳性	阴性	成立	成立
								5	28	阳性		阳性	阴性	成立	成立
7	9	阳性		阳性	阴性	成立	成立
								7	14	阳性		阳性	阴性	成立	成立
7	21	阳性		阳性	阴性	成立	成立
								8	9	阳性		阳性	阴性	成立	成立
8	14	阳性		阳性	阴性	成立	成立
								8	21	阳性		阳性	阴性	成立	成立
8	28	阳性		阳性	阴性	成立	成立
								9	9	阳性		阳性	阴性	成立	成立
9	14	阳性		阳性	阴性	成立	成立
								9	28	阳性		阳性	阴性	成立	成立

结果表明：采用本发明重组表达的蛋白质作为抗原运用补体结合试验方法检测牛传染性胸膜肺炎，检测结果准确率高，说明该抗原具有很高的特异性和敏感性，可用于牛传染性胸膜肺炎的血清学诊断。

[试验例2]利用重组表达的突变丝状支原体丝状亚种N端脂蛋白进行牛传染性胸膜肺炎血清学检测

一、试验材料：

1、供试样品：用本发明实施例所纯化的蛋白质作为包被抗原

2、阳性对照、阴性对照由葡萄牙国家兽医参考实验室惠赠(也可从普通生物试剂公司购买得到，效果等同)，为用国际标准品。空白对照为100μl底物溶液加50μl终止液。

3、试剂：鱼明胶、吐温20、OPD(邻苯二胺)(均可从普通生物试剂公司购买得到)。

二、试验方法

将实施例2所纯化的蛋白以1μg/ml包被96孔平底聚苯乙烯酶标板，具体试验程序如下：

1、包被抗原：用pH 9.6，0.05M的碳酸盐缓冲液将抗原稀释到工作浓度，用微量加样器每孔加入100μl，覆上石蜡封口膜(Parafilm)，4℃包被过夜。次日倾去包被液，用Stat Fax 2600型全自动洗板机洗涤。

2、封闭：每孔加入100μl 3％鱼明胶，置湿盒中37℃孵育90min，甩干后同上洗涤。

3、加被检血清：用含0.05％吐温20的PBS(PBST)将血清以1∶80倍稀释，每孔加100μl。置湿盒中37℃孵育30min，甩干后同上洗涤。

4、加酶结合物：用PBST(磷酸盐缓冲液)将酶结合物以1∶2000倍稀释，每孔加100μl，置湿盒中37℃孵育1h，甩干后同上洗涤。

5、加底物溶液：每孔加入OPD(邻苯二胺)溶液100μl，置暗盒中室温放置30min。

6、加终止液：每孔加入2M H₂SO₄ 50μl，终止反应。

7、测定光密度值(OD)：终止反应后，用Stat Fax 2600型全自动酶标仪以492nm测定各孔OD值。

在每次试验中均设标准阳性、标准阴性和底物终止液空白对照孔。标准阳性血清样品OD值为0.8-1.0之间；标准阴性血清样品OD值为0.20-0.25之间。

三、试验结果

试验结果见表8。

表8 应用间接ELISA试验对人工感染牛传染性胸膜肺炎阳性牛血清检测结果

牛号只	人工感染后采血时间(天)	阳性对照	阴性对照	底物终止液空白对照	供试样品
						1	21	0.97	0.23	0.08	0.779
1	28	0.97	0.23	0.08	0.682
						3	9	0.97	0.23	0.08	0.304
3	14	0.97	0.23	0.08	0.622
						3	43	0.97	0.23	0.08	0.233
4	9	0.97	0.23	0.08	1.732
						4	14	0.97	0.23	0.08	0.919
4	43	0.97	0.23	0.08	0.962
						4	58	0.97	0.23	0.08	0.592
5	9	0.97	0.23	0.08	0.375
						5	14	0.97	0.23	0.08	0.528
5	21	0.97	0.23	0.08	0.547
						5	28	0.97	0.23	0.08	0.682
7	9	0.97	0.23	0.08	0.84
						7	14	0.97	0.23	0.08	0.728
7	21	0.97	0.23	0.08	1.78
						8	9	0.97	0.23	0.08	0.59
8	14	0.97	0.23	0.08	0.692
						8	21	0.97	0.23	0.08	0.802
8	28	0.97	0.23	0.08	0.801
						9	9	0.97	0.23	0.08	0.276
9	14	0.97	0.23	0.08	0.311
						9	28	0.97	0.23	0.08	0.309

说明：供试样品的数值结果大于或等于0.25为阳性

结果表明：采用本发明重组表达的蛋白质作为抗原运用间接ELISA试验方法检测牛传染性胸膜肺炎，检测结果准确率高，说明该抗原具有很高的特异性和敏感性，可用于牛传染性胸膜肺炎的血清学诊断。

                            序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>一种编码丝状支原体丝状亚种N端脂蛋白的DNA

<160>6

<210>1

<211>573

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ccattagttg ttgtttcatg taaaacttca aattttaata acaataaacc taataataat     60

caacaaaaaa aagagcaagt aagtaaaatt gatatttcaa gttttaaaga taaaattgaa    120

ccaaaaaatg agtggcaaaa acaagatgtt ttacaagcat tactaaaaat aaaagggcta    180

gataaattaa ctcaaaatga ttttaatttt aatattaaga aagctaattt attacgtaat    240

ggacaattga taattaaatc taaagacgat tctaaaatta taaaaggtga actaagttta    300

gaaattaaaa aactaaatag agttaaaaaa gttgaaacaa aatataatga tactagaact    360

gaggttttag taattggtta tgatgaaaat ggaaaaattt ctgggtttgc tcaaactgtt    420

aaaaaagttc ctgaaaaact accagaagaa attattagtc tagagcgtgc ttttttaaaa    480

aataattctg ataaaattga aaatcttgat aaatgggaca catctaatat agtaagtatg    540

tcttcaatgt ttcaacaagc tagaaacttt aat                                 573

<210>2

<211>191

<212>PRt

<213>人工序列

<400>2

Pro Leu Val Val Val Ser cys Lys Thr Ser Asn Phe Asn Asn Asn

 1               5                   10                  15

Lys Pro Asn Asn Asn Gln Gln Lys Lys Glu Gln Val Ser Lys Ile

                20                   25                  30

Asp Ile Ser Ser Phe Lys Asp Lys Ile Glu Pro Lys Asn Glu Trp

                35                   40                  45

Gln Lys Gln Asp Val Leu Gln Ala Leu Leu Lys Ile Lys Gly Leu

                50                   55                  60

Asp Lys Leu Thr Gln Asn Asp Phe Asn Phe Asn Ile Lys Lys Ala

                65                   70                  75

Asn Leu Leu Arg Asn Gly Gln leu Ile Ile Lys Ser Lys Asp Asp

                80                   85                  90

Ser Lys Ile Ile Lys Gly Glu Leu Ser Leu Glu Ile Lys Lys Leu

                95                  100                 105

Asn Arg Val Lys Lys Val Glu Thr Lys Thr Asn Asp Thr Arg Thr

                110                 115                 120

Glu Val Leu Val Ile Gly Thy Asp Glu Asn Gly Lys Ile Ser Gly

                125                 130                 135

Phe Ala Gln Thr Val Lys Lys Val Pro Glu Lys Leu Pro Glu Glu

                140                 145                 150

Ile Ile Ser Leu Glu Arg Ala Phe Leu Lys Asn Asn Ser Asp Lys

                155                 160                 165

Ile Glu Asn Leu Asp Lys Trp Asp Thr Ser Asn Ile Val Ser Met

                170                 175                 180

Ser Ser Met Phe Gln Gln Ala Arg Asn Phe Asn

                185                 190

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gcggaattcc cartagttgt tgtttcatgt a 31

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gacgtcgaca ttaaagtttc tagcttgttg 30

<210>5

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tcttgttttt gccactcatt ttttg 15

<210>6

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

caaaaaatga gtggcaaaaa caaga 15

Claims (7)

1.一种编码丝状支原体丝状亚种SC型(Mycoplasma mycoide subsp.mycoides SC，MmmSC)N端脂蛋白的DNA，其特征在于：该DNA是序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1的DNA所编码的蛋白质，其特征在于：该蛋白质是序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的DNA的制备方法，包括以下步骤：

1)提取支原体的基因组DNA，设计一对特异性引物，以所提取的支原体基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增到的特异性片段经酶切后连接到PUC载体上；其中，所述的特异性引物是序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的序列；

2)设计一对为序列表SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的突变引物，以该重组PUC载体为模板，加入一对载体通用引物和该突变引物进行PCR扩增，收集所扩增到的特异性片段即得。

4.含有权利要求1所述DNA的表达载体。

5.按照权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为含有权利要求1所述DNA的Pet32a载体。

6.含有权利要求1所述DNA的大肠杆菌细胞。

7.权利要求2所述蛋白质在制备牛传染性胸膜肺炎血清学检测试剂中的应用。

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