CN1763104A - 基因vii型新城疫病毒np抗体的重组原核表达检测抗原及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原及制备方法。基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原是应用RT－PCR技术扩增基因VII型新城疫病毒NP基因基础上，将NP基因定向亚克隆到原核表达载体pGEX－6p上，然后转化大肠杆菌表达系统进行诱导表达所得到的基因工程蛋白，该蛋白的表达形式是融合蛋白，表达的融合蛋白的分子量为81.9ku。通过本方法制备的基因工程重组蛋白可用于VII型新城疫抗NP蛋白抗体的检测。
Description
(一)技术领域
本专利涉及的是一种基因工程制品，本发明也涉及这种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种应用基因工程技术制备检测基因VII型新城疫抗体的检测抗原及其制备方法。
(二)背景技术
1997年以来，在我国许多地区爆发了以消化道和呼吸道病变为主要特征的基因VII型新城疫，给养殖业带来了严重的危害。由于该病具有高度发病率和死亡率，如何对该病进行及时准确的诊断具有重要的意义。
以往对基因VII型新城疫血清抗体的检测都是利用全病毒作为抗原，此方法必须将病毒浓缩提纯，再用去污剂裂解后并适当浓缩才能用作抗原，这就使得全病毒抗原制备过程复杂，不易于推广，特别是利用全病毒抗原作为诊断抗原，在亚单位疫苗或活载体疫苗免疫接种时，不能鉴别疫苗免疫和自然感染的抗体。利用原核表达系统表达外源蛋白是一种简便和高效的方法。原核表达系统生产的一些基因工程蛋白可保持必要的抗原性，能够用于病毒感染抗体的检测。研究表明，基因VII型新城疫病毒NP蛋白即属于此类蛋白，因此应用基因工程NP蛋白作为抗原，能够建立鉴别基因VII型新城疫免疫接种和自然感染抗体的检测方法，这将为应用基因工程疫苗预防和控制基因VII型新城疫提供重要的技术支撑。
(三)专利内容
本专利的目的在于提供一种具有无散毒危险、稳定性好、灵敏度高、可实现工业化生产、成本低的用于检测基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原，本发明的目的还在于提供这种检测抗原的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原是应用RT-PCR技术扩增基因VII型新城疫病毒NP基因基础上，将NP基因定向亚克隆到原核表达载体pGEX-6p(是一种带有GST前导肽的融合表达载体)上，然后转化大肠杆菌表达系统进行诱导表达所得到的基因工程蛋白，该蛋白的表达形式是融合蛋白(GST-NP)，表达的融合蛋白的分子量为80-82ku。经Western blot、Dot-ELISA进行析表明：该蛋白具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。
基因VII型新城疫病毒NP基因的核苷酸序列及其推倒的氨基酸序列如下：
1 ATGTCGTCFGTTTTCGACGAATACGAGCAGCTTCTCGCTGCTCAGACCCGCCCTAACGGA
1 M S S V F D E Y E Q L L A A Q T R P N G
61 ACTCATGGAGGGGGAGAGAAAGGGAGCACTTTAAAGGTTGAGGTCCCAGTATTTACCCTA
21 T H G G G E K G S T L K V E V P V F T L
121 AACAGTGATGATCCAGAGGATAGATGGAATTTTGCGGTATTCTGTCTTCGGATTGCTGTT
41 N S D D P E D R W N F A V F C L R I A V
181 AGCGAGGATGCCAACAAACCACTCAGGCAAGGTGCTCTTATATCCCTCTTATGCTCCCAT
61 S E D A N K P L R Q G A L I S L L C S H
241 TCTCAGGTGATGAGAAACCATGTTGCCCTTGCAGGGAAACAGAATGAGGCCACACTGGCT
81 S Q V M R N H V A L A G K Q N E A T L A
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101 V L E I D G F A N S V P Q F N N R S G V
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141 N G T P F V T A G V E D D A P E D I T D
481 ACTCTGGAAAGAATCCTATCTATCCAAGTTCAGGTATGGGTCACAGTAGCAAAGGCCATG
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201 G R V Q K K Y I L H P V C R S A I Q L T
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221 I R H S L A V R I F L V S E L K R G R N
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461 A P N P A Q S T T H P E P P P F P G A S
1441 CAAGACAACGACACTGACTGGGGGTACTGA
481 Q D N D T D W G Y *
本发明的产品是采用这样的方法来加工的：
1)设计扩增基因VII型新城疫病毒NP基因的特异性引物；
2)通过RT-PCR扩增NP基因片段；
3)对NP基因进行克隆、测序鉴定；
4)将NP基因定向亚克隆至pGEX-6p原核表达载体；
5)重组表达质粒pGEX-6p-NP转化大肠杆菌中进行诱导表达；
6)重组蛋白的纯化
通过离心收集培养物中的基因工程菌，用PBS洗涤3次，沉淀用PBS溶液重悬，加入溶菌酶至终浓度为1％即1mg/ml，然后进行超声处理，超声处理必须于冰浴条件下进行；以4℃、10000g离心10min，取上清并加入1％的TritionX-100及1mmol/L的DTT至终浓度为1mmol/L；沉淀即为包涵体，将沉淀用组成为30％蔗糖，100mol/L NaCl，50mmol/LTris，pH8.0，1％TritionX-100的包涵体洗涤液洗涤2次，重悬沉淀，加入组成为1.5％(m/v)N-十二烷基肌氨酸钠，25mmol/L三乙醇胺，1mmol/LEDTA，pH8.0的包涵体裂解液重悬，4℃处理2h，再超声处理20S，以12000r/m，4℃离心20min，除去不溶性沉淀，取上清即为可溶性包涵体蛋白，向其中立即加入终浓度为2％的Trition X-100，加入9倍体积的组成为0.8mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSH)，2mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH)，2mmol/L EDTA，20mmol/L Tris，pH8.5]的复性缓冲液，用0.01mol/L PBS、pH7.4透析48h，每12h更换一次透析液。取出复性的包涵体蛋白液，经聚乙醇-8000进行浓缩，加入2％的Trition X-100后，于-20℃保存备于纯化。
将复性后的表达蛋白经SDS-PAGE电泳后，用KCl染色，将凝胶中的目的蛋白带切下、研碎，加入PBS，反复冻融，1000r/min离心10min，上清即为纯化蛋白。
7)重组蛋白抗原性检测
通过免疫印迹、Dot-ELISA方法的检测该蛋白的抗原性。
免疫印记试验：将纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，再将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维膜上，以1∶150倍稀释基因VII型新城疫阳性的鸡血清作为一抗，1∶10000倍稀释的辣根标记的兔抗鸡IgG作为二抗，底物为4-氯-1-萘酚，结果在约80ku处观察到了特异性的反应条带。
Dot-ELISA(免疫酶斑点技术)实验：一抗、二抗和底物同上，结果纯化后的重组蛋白与基因VII型新城疫阳性的鸡血清形成了明显的斑点。
采用本专利的方法生产的产品可作为检测基因VII型新城疫的间接-ELISA及Dot-ELISA等抗体检测方法的检测抗原。
其产品优点体现在：
1)由于所制备检测抗原是NP基因原核表达重组蛋白，并非全病毒，因此应用该检测抗原无散毒危险。
2)可用于鉴别亚单位疫苗或活载体疫苗免疫接种与自然感染抗体。
3)所制备的检测基因VII型新城疫的检测抗原具有检测灵敏度高，特异性强，无交叉反应的特点。
4)制备工艺简单、产品性能稳定，成本低，产品付加值高，适合工厂化生产，市场应用前景广。
通过该方法制备的重组蛋白可用于基因VII型新城疫的自然感染与亚单位疫苗或活载体疫苗免疫抗体的鉴别。
融合表达的优点一是便于亲合层析纯化，二是增加蛋白分子量后免疫原性得到提高；该融合蛋白在表达时，大部分以非可溶性的包涵体形式表达，在纯化之前对包涵体采用了较为温和的包涵体裂解方式，因此包涵体蛋白裂解后又经复性处理后，根据Dot-ELISA及Western blot鉴定表明，融合蛋白具有与自然感染新城疫病毒NP蛋白抗体特异性结合的活性，经裂解的包涵体蛋白经24个月仍保持良好的均质胶体状态，无析出和沉淀现象，表明状态稳定。
应用本方法制备的重组蛋白作为检测抗原可以鉴别基因VII型新城疫病毒的自然感染与亚单位疫苗或活载体疫苗免疫的抗体；此外制备的重组蛋白是病毒NP基因的表达产物，并非全病毒，因此在应用该抗原进行检测过程中绝无散毒危险；同时还具有检测反应灵敏度高，无交叉反应现象的优点。
(四)具体实施方案
1)设计扩增基因VII型新城疫病毒NP基因的特异性引物；
上游引物：5′CCGGATCCTCTACCGATATGTCGTCTG 3′
下游引物：5′GGG从TTCGGTGTTGTCGATCAGTACC 3′
2)通过RT-PCR扩增NP基因片段；
3)对NP基因进行克隆、测序鉴定；
基因VII型新城疫病毒NP基因的核苷酸序列及其推倒的氨基酸序列如下：
1 ATGTCGTCTGTTTTCGACGAATACGAGCAGCTTCTCGCTGCTCAGACCCGCCCTAACGGA
1 M S S V F D E Y E Q L L A A Q T R P N G
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4)将NP基因定向亚克隆至pGEX-6p原核表达载体；
5)重组表达质粒pGEX-6p-NP转化大肠杆菌中进行诱导表达；
表达的融合蛋白的分子量为81.9ku。
6)重组蛋白的纯化
通过离心收集培养物中的基因工程菌，用PBS洗涤3次，沉淀用PBS溶液重悬，加入溶菌酶至终浓度为1％(1mg/ml)，然后进行超声处理，超声处理必须于冰浴条件下进行。以4℃、10000g离心10min，取上清并加入1％的TritionX-100及1mmol/L的DTT至终浓度为1mmol/L；沉淀即为包涵体，将沉淀用包涵体洗涤液(30％蔗糖，100mol/L NaCl，50mmol/LTris，pH8.0，1％TritionX-100)洗涤2次，重悬沉淀，加入包涵体裂解液[1.5％(m/v)N-十二烷基肌氨酸钠，25mmol/L三乙醇胺，1mmol/L EDTA，pH8.0]重悬，4℃处理2h，再超声处理20S，以12000r/m，4℃离心20min，除去不溶性沉淀，取上清即为可溶性包涵体蛋白，向其中立即加入终浓度为2％的Trition X-100，加入9倍体积的复性缓冲液[0.8mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSH)，2mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH)，2mmol/L EDTA，20mmol/L Tris，pH8.5]，用0.01mol/L PBS(pH7.4)透析48h，每12h更换一次透析液。取出复性的包涵体蛋白液，经聚乙醇-8000进行浓缩，加入2％的Trition X-100后，于-20℃保存备于纯化。
将复性后的表达蛋白经SDS-PAGE电泳后，用KCl染色，将凝胶中的目的蛋白带切下、研碎，加入PBS，反复冻融，1000r/min离心10min，上清即为纯化蛋白。
7)重组蛋白抗原性检测
通过免疫印迹、Dot-ELISA方法的检测该蛋白的抗原性。
免疫印记试验：将纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，再将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维膜上，以1∶150倍稀释基因VII型新城疫阳性的鸡血清作为一抗，1∶10000倍稀释的辣根标记的兔抗鸡IgG作为二抗，底物为4-氯-1-萘酚，结果在约80ku处观察到了特异性的反应条带。
Dot-ELISA(免疫酶斑点技术)实验：一抗、二抗和底物同上，结果纯化后的重组蛋白与基因VII型新城疫阳性的鸡血清形成了明显的斑点。
Claims (4)
1、一种基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原，其特征是：基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原是应用RT-PCR技术扩增基因VII型新城疫病毒NP基因基础上，将NP基因定向亚克隆到原核表达载体pGEX-6p上，然后转化大肠杆菌表达系统进行诱导表达所得到的基因工程蛋白，该蛋白的表达形式是融合蛋白，表达的融合蛋白的分子量为80-82ku。
2、根据权利要求1所述的基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原，其特征是：表达的融合蛋白的分子量为81.9ku。
3、根据权利要求1所述的基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原，其特征是：
基因VII型新城疫病毒NP基因的核苷酸序列及其推倒的氨基酸序列如下：
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4、一种基因VII型新城疫病毒NP抗体的重组原核表达检测抗原的制作方法，其特征是：
1)设计扩增基因VII型新城疫病毒NP基因的特异性引物；
2)通过RT-PCR扩增NP基因片段；
3)对NP基因进行克隆、测序鉴定；
4)将NP基因定向亚克隆至pGEX-6p原核表达载体；
5)重组表达质粒pGEX-6p-NP转化大肠杆菌中进行诱导表达；
6)重组蛋白的纯化
通过离心收集培养物中的基因工程菌，用PBS洗涤3次，沉淀用PBS溶液重悬，加入溶菌酶至终浓度为1％即1mg/ml，然后进行超声处理，超声处理必须于冰浴条件下进行；以4℃、10000g离心10min，取上清并加入1％的TritionX-100及1mmol/L的DTT至终浓度为1mmol/L；沉淀即为包涵体，将沉淀用组成为30％蔗糖，100mol/L NaCl，50mmol/LTris，pH8.0，1％TritionX-100的包涵体洗涤液洗涤2次，重悬沉淀，加入组成为1.5％(m/v)N-十二烷基肌氨酸钠，25mmol/L三乙醇胺，1mmol/LEDTA，pH8.0的包涵体裂解液重悬，4℃处理2h，再超声处理20S，以12000r/m，4℃离心20min，除去不溶性沉淀，取上清即为可溶性包涵体蛋白，向其中立即加入终浓度为2％的Trition X-100，加入9倍体积的组成为0.8mmol/L氧化型谷胱苷肽，2mmol/L还原型谷胱苷肽，2mmol/LEDTA，20mmol/L Tris，pH8.5的复性缓冲液，用0.01mol/L PBS、pH7.4透析48h，每12h更换一次透析液。取出复性的包涵体蛋白液，经聚乙醇-8000进行浓缩，加入2％的Trition X-100后，于-20℃保存备于纯化；
将复性后的表达蛋白经SDS-PAGE电泳后，用KCl染色，将凝胶中的目的蛋白带切下、研碎，加入PBS，反复冻融，1000r/min离心10min，上清即为纯化蛋白；
7)重组蛋白抗原性检测
通过免疫印迹、Dot-ELISA方法的检测该蛋白的抗原性。
免疫印记试验：将纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，再将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维膜上，以1∶150倍稀释基因VII型新城疫阳性的鸡血清作为一抗，1∶10000倍稀释的辣根标记的兔抗鸡IgG作为二抗，底物为4-氯-1-萘酚，结果在约80ku处观察到了特异性的反应条带；
Dot-ELISA实验：一抗、二抗和底物同上，结果纯化后的重组蛋白与基因VII型新城疫阳性的鸡血清形成了明显的斑点。
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