CN1831009A - 一种对虾白斑综合症病毒（wssv）膜蛋白及其抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了三种对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466，它们具有感染功能，而它们的特异性多克隆抗体则具有抗对虾白斑综合症病毒感染的能力。本发明还涉及三种对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特异性多克隆抗体的应用，以及所述膜蛋白VP68，VP281，VP466和它们的特异性多克隆抗体的生产方法。

Description

一种对虾白斑综合症病毒(WSSV)膜蛋白及其抗体

技术领域：

本发明涉及三种对虾白斑综合症病毒(WSSV)膜蛋白及其特异性多克隆抗体。更具体地说，本发明涉及三种对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的感染功能，而它们的特异性多克隆抗体则具有抗对虾白斑综合症病毒感染的能力。本发明还涉及三种对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特异性多克隆抗体的应用，以及所述膜蛋白VP68，VP281，VP466和它们的特异性多克隆抗体的生产方法。

背景技术：

对虾白斑综合症病毒(WSSV)，是一种短杆状的、无包涵体的包膜病毒，该病毒感染力强，被感染的对虾在一周内死亡率高达90～100％，危害极大。它除了侵染绝大多数种类的对虾之外，还可侵染多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围。

由于对虾病毒病尚无法治疗，因此目前只能从优化养殖环境，阻断病原的传播，提高对虾种质，增强对虾基础免疫力等方面入手，以期实行对养殖对虾病害的有效控制和预防。国内外学者在这些方面做了大量的工作，也取得了一些成果。如利用灭活的弧菌疫苗，可有效地提高养成期及苗期日本对虾的成活率(J ofAquatic Animal Health，1991，3：151-2)；利用口服免疫增强剂(如β-1，3-葡聚糖和肽聚糖)可增强对虾血细胞的吞噬活性及对细菌性感染的抵抗能力(Fish.Chimes.，1996，16：41-42)；一些富含多糖、生物碱、有机酸等多种成分的天然物质对对虾有免疫刺激作用(海洋与湖沼，1995，26：34-41)。但在现有的技术水平和养殖模式下这些方法都无法彻底解决问题。

病毒膜蛋白除了起维持病毒形态、保护病毒核酸的作用以外，另一个重要功能就是参与病毒与宿主的识别，协助病毒进入宿主细胞。

发明内容

本发明的目的之一是提供病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466在病毒感染过程中的作用。即VP68，VP281，VP466直接参与病毒感染过程。

本发明的一个目的是提供一种新的抗对虾白斑综合症病毒感染的方法，即应用对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特异性多克隆抗体来防止对虾白斑综合症病毒感染养殖对虾。

本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的三种对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特异性多克隆抗体的方法。

同时，本发明还包括病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特异性多克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466或其片段。较佳地，指那些能与病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466或其片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段、抗体重链、抗体轻链、遗传工程改造的单链Fv分子或嵌合抗体。本发明的抗体抗原通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物以生产抗体。病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466可以利用重组方法制备或利用合成仪合成。单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。在本发明中，术语“VP68，VP281，VP466编码序列”是指编码具有VP68，VP281，VP466蛋白活性的多肽的核苷酸序列，由于密码子的简并性，所以与VP68，VP281，VP466位核苷酸同源性低至约70％的简并序列也能编码出VP68，VP281，VP466的序列。该术语还包括能编码具有与VP68，VP281，VP466相同功能的蛋白的VP68，VP281，VP466序列的变异形式。这些变异形式包括：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地10个以内，最佳地5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“VP68，VP281，VP466蛋白多肽”指具有VP68，VP281，VP466蛋白活性的多肽。该术语还包括具有抗病毒功能的VP68，VP281，VP466蛋白的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括VP68，VP281，VP466蛋白的活性片段和活性衍生物。

在本发明中，“纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少50％，较佳地至少75％，更佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯化可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC测量多肽的纯度。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”指原核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。

本发明中的对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466及其特异性多克隆抗体是如此获得的：将编码对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的多核苷酸序列分别克隆到质粒载体pGEX4T-2中，转染至大肠杆菌中并诱导表达出对虾白斑综合症病毒膜蛋白的融合蛋白VP68，VP281，VP466，用纯化的融合蛋白VP68，VP281，VP466分别免疫小鼠，制备VP68，VP281，VP466的特异性多克隆抗体，证明这些抗体具有抗对虾白斑综合症病毒感染的能力。在本发明被公布之前，没有人证明病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466与感染过程密切相关，也没有任何人公开过本申请中涉及的VP68，VP281，VP466的特异性多克隆抗体具有抗病毒功能。本发明将可能为对虾病害的防治提供新的途径，促进对虾养殖业的健康持续发展。

附图说明：

附图1：VP281多克隆抗体的抗病毒作用。在注射病毒12，24，48，72小时后检测对虾体内的病毒含量，由图可见同时注射病毒与VP281多克隆抗体的对虾，其体内病毒的含量低于单纯注射病毒的对虾。

附图2：VP68，VP281，VP466多克隆抗体的抗病毒作用。由图可见同时注射病毒与VP68，VP281，VP466多克隆抗体的对虾，其14天的累计死亡率低于单纯注射病毒的对虾。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466在大肠杆菌中的表达：

1.病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466 cDNA的扩增

分别将编码病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的cDNA序列用对应于该DNA的开读框的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的DNA插入片段。

2.病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的DNA的重组

采用基因工程工具酶，将扩增的VP68，VP281，VP466的DNA片段分别连接到质粒载体pGEX4T-2中。然后用连接混合物转化大肠杆菌DH-5a感受态细胞，涂布在LB平板(含Amp 100μg/ml)上。挑取菌落，提取质粒，用PCR、酶切和测序的方法鉴定的VP68，VP281，VP466DNA片段已分别正确插入了载体。

3.重组病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的表达、纯化

分别挑取含有病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的重组质粒的单菌落于4ml LB液体培养基(含Amp 100μg/ml)，37℃摇培过夜。吸取1ml菌液于新的200ml LB液体培养基(含Amp 100μg/ml)，37℃摇培至OD600为0.6左右，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续摇培4hr。

离心菌液去上清，将细胞重悬于PBS缓冲液中，超声裂解，离心去沉淀，上清中的重组病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466用GST柱进行亲和纯化。

实施例2抗体制备

将实施例1中获得的纯化的重组病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466分别用等体积的完全Freund’s佐剂乳化，用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白对小鼠进行皮下注射。10天后用非完全Freund’s佐剂乳化的同样剂量的同样抗原再注射进行加强免疫来免疫动物以产生抗体，每隔10天进行一次加强免疫，至少进行3次。分析所获抗血清的滴度和特异性。

在阅读了本发明的上述讲授内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例3抗病毒实验

将施例2中获得的多克隆抗体分别与对虾白斑综合症病毒液混匀，在室温下放置1小时，而后通过皮下肌肉各注射到2O只实验对虾体内，每只对虾注射106个病毒颗粒，观察14天，统计对虾在14天内的累计死亡率，并与只注射生理盐水或只注射对虾白斑综合症病毒的对虾比较，分析VP68，VP281，VP466多克隆抗体的抗病毒功能。其实验结果见附图1、附图2。

                                序列表

一、VP68的信息

1、VP68的核酸序列

    (1)序列特征

        (A)长度：776bp

        (B)类型：核酸

        (C)链性：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (2)分子类型：cDNA

1   ATGTCTGATA TGACCAGAAA CATCATCGTC GGCTTGGCCG TTGTCGTCAT CGCATTGAGC

61  ATGGTCGCTT TCATGCTTTC TGTTACTCCT GCACTTACCG GATTCCTCCT AGGTTTGGGT

121 GTATCAGCAC TAGGAGTTAC ACTCTTTGGA TGTCCCACTA TGAAATCTCC AGGGGGAGGA

181 AATGCTACAA TCAACCCCGT GGCA

2、VP68的蛋白序列

    (1)序列特征

        (A)长度：68aa

        (B)类型：多肽

        (C)链性：单链

        (D)拓扑结构：三级

    (2)分子类型：多肽

1   MSDMTRNIIV GLAVVVIALS MVAFMLSVTP ALTGFLLGLG VSALGVTLFG CPTMKSPGGG

61  NATINPVA

二、VP281的信息

1、VP281的核酸序列

    (1)序列特征

        (A)长度：846bp

        (B)类型：核酸

        (C)链性：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (2)分子类型：cDNA

  1 CTGGCGGTAA ACTTGGATAA TGTTCTTGTG AATATCAACA ACAAGGATGA AGATCTTACA

 61 AAACTCGTAT CCGAGGCAAT AAAGCGGCGA GCTAAAACTG TATTTGACAC TAAAAATCAA

121 GCAGGGTTTG ACATGAGACG TCAAGTTGAA GCTGCATTAT ATGAAGCAAT ATCCAAAAAG

181 AAAGAAAAGG CCATAAAGGC ATTCGATGAG CTCATACAAG AAAGAGGTGA TGAAATTACA

241 CCTTTGACTA CAATGCAGTA TGAAGAGTGG GTAAACCGTA CAATAACTCC CTCATTGACG

301 ACTGAAAATT TATTAGGTGA TGTTGAGCAC GCCGATTTTT TACTGGACCG AATGACACCC

361 GTAAGCGAGG AAGATATTGA AGGTTTCGCT GCTTCTACTT TTAAGGAGGT ATCAGATTCA

421 AAAACTGCAA CAGTCATAGT TAAGGCAGAT TGTGAAACGG GGGATATCGA TGAAGTGTAT

481 AATCTTGCAC CATCATTCGG CGTCACTCAA GAAATTAAAA TATATAGGTC AAACAATTCC

541 TCGGAATTGG ATAATGTCGC AGATTCTTTC CATATTTATA AAATTTCTGC AACAGATAGC

601 GACAGTGGCA ATACTAAAAA ATTGTTGTAT GGGTTAAGGA ATAAAAAAGC AGGTTATACG

661 TGTTTGTGTA GAATTTTTGC AGAAATTGAA TCAGATGGGA TTATGGCCAA TACAAATATC

721 GGTGTCGCTG AAAACAACAG AGATGAAATT GATGAAAACG AAGAAGGTAA ATATGGTTTT

781 TTAATACCCA AACAACCAGC TGGTGCAAAA TTGATCATCT ACTTCTTTTT AAATTGTTGG

841 ACGTAA

2、VP281的蛋白序列

    (1)序列特征

        (A)长度：281aa

        (B)类型：多肽

        (C)链性：单链

        (D)拓扑结构：三级

    (2)分子类型：多肽

  1 MAVNLDNVLV NINNKDEDLT KLVSEAIKRR AKTVFDTKNQ AGFDMRRQVE AALYEAISKK

 61 KEKAIKAFDE LIQERGDEIT PLTTMQYEEW VNRTITPSLT TENLLGDVEH ADFLLDRMTP

121 VSEEDIEGFA ASTFKEVSDS KTATVIVKAD CETGDIDEVY NLAPSFGVTQ EIKIYRSNNS

181 SELDNVADSF HIYKISATDS DSGNTKKLLY GLRNKKAGYT CLCRIFAEIE SDGIMANTNI

241 GVAENNRDEI DENEEGKYGF LIPKQPAGAK LIIYFFLNCW T

三、VP466的信息

1、VP466的核酸序列

    (1)序列特征

        (A)长度：1401bp

        (B)类型：核酸

        (C)链性：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (2)分子类型：cDNA

  1 ATGTCTGCAT CTTTAATATT GGACGAATAC CTCAAGAAGA CTGCTTCAGC CGTTCTGGAT

 61 GTAGCTGACT CATTTGAGAA AATCAAGGGA GAAATCCAAT CACCTGAGGA GGCTGCGGCT

121 CTTTCTGTTG CTCTCTATGG AGCACCTCCA AAACCTTCAG CTTCGGCTGT GGCCTCTATC

181 ATCACTGGAG AAAGAACATC TTTAAACGAC AAATATCTAT CGGATAATGT CCTATTGAAA

241 ATGTCTGTTG CTCGCGTTGG ACAAGAAAAT AATCGCAAGA GAGCCGACCA GGCAGCTGAT

301 GAAATTAGAA CCATCATGGA AGATATTACA GGGAGTTTGT CCGGTGCGTA CAGGCAATAT

361 AGCCCGCTCG AGGAAGAAAA TAAGGTGCAT ATAGGCATCA TGAATAACAA AACGCCTAGC

421 ATTGTTTGTG GATATTATAC AATGGACACA TCTATTTCTT CCGAACCTCT TTCTCTAACA

481 GATTTTCAAA ACCCCACTGT CATTGCCAAT GTGACTAAGC GGATGGAGAG CATTTTTTCA

541 AAGGTCGACT CTGCTAGGTC TACAAGATTC GACGCTTTTG TTAATGGTGT TGCGAATAAT

601 ATGGATATAA AGTCATCAAT AGATTGGGCA AATATGGTAG AAAATGTGAT CAAATTACCA

661 GATTCTACAC CTAACCCTTG TTCAGTTGAC ACTATTGTGT CCAGAGACGC AAGTGTAGTT

 721 AAAACAGCAG TTAATGATAT ATACGCTTCT GTTGGAAAAT CTTATTGTCG TCCTGCAACA

 781 CAGCTAACCT TTATGAGCGA GATTGAAAAA CTGCGAAAGG CTGCAGTTGT ATGTTTTGAG

 841 GCACTCATGT CCGATACTAG GGAGAGGGCA TTCGTAGAGT TCCTATTTTA CGTTAGCTTT

 901 AAGGAAGATG CATCAAATAC CAATTCAAAA TTGTTTGTTC AGAATAAGCT ATCTTCCATG

 961 TCTGGAAACC CCAGACAGCC CATAAAATTG GTACGCCGTT CTGCTGAGGA AACACTATTC

1021 GGGCTCTGTT TCATGTTTAA GGTAATGCCT CCAGAATTCA TGAACTGTAT ATTTAACTTC

1081 CCTACCATTC CCCATTCAAC ACAATACCAT GGTCTATATG GTACATGTTT AACCCCTCTA

1141 CTTAGAAAAT ACGGTTCTTC ATTCGAAAAG TCCTGGGCTC ATTTTGAGGA AATTTTAAGC

1201 GAAAGAGCCA ATGCAGTGAA AAAATTTGGT GTAAACGATA CGAGGATAGA TTGTCTAGAT

1261 GCAGTAGCAA ATCTCACCGG ACCTGTGTAT GTTCTCATTT TAGATCTTGT ACGTACTCTA

1321 AGTGCGCAGA GATCGTGTTC AACTAAATTT CTCCGTGAAA TTAAGGAAAA CTATCTTTTG

1381 TGGAATAGGT TTGTGTCATA A

2、VP466的蛋白序列

    (1)序列特征

        (A)长度：466aa

        (B)类型：多肽

        (C)链性：单链

        (D)拓扑结构：三级

    (2)分子类型：多肽

  1 MSASLILDEY LKKTASAVLD VADSFEKIKG EIQSPEEAAA LSVALYGAPP KPSASAVASI

 61 ITGERTSLND KYLSDNVLLK MSVARVGQEN NRKRADQAAD EIRTIMEDIT GSLSGAYRQY

121 SPLEEENKVH IGIMNNKTPS IVCGYYTMDT SISSEPLSLT DFQNPTVIAN VTKRMESIFS

181 KVDSARSTRF DAFVNGVANN MDIKSSIDWA NMVENVIKLP DSTPNPCSVD TIVSRDASVV

241 KTAVNDIYAS VGKSYCRPAT QLTFMSEIEK LRKAAVVCFE ALMSDTRERA FVEFLFYVSF

301 KEDASNTNSK LFVQNKLSSM SGNPRQPIKL VRRSAEETLF GLCFMFKVMP PEFMNCIFNF

361 PTIPHSTQYH GLYGTCLTPL LRKYGSSFEK SWAHFEEILS ERAKAVKKFG VNDTRIDCLD

421 AVANLTGPVY VLILDLVRTL SAQRSCSTKF LREIKENYLL WNRFVS

Claims (9)

1、一种对虾白斑综合症病毒膜蛋白，该膜蛋白与对虾白斑综合症病毒感染对虾的过程相关。

2、根据权利要求1所述的一种对虾白斑综合症病毒膜蛋白，其特征在于编码具有VP68蛋白活性的多肽的核苷酸序列，或至少与VP68的核苷酸同源性70％的简并序列。

3、根据权利要求1所述的一种对虾白斑综合症病毒膜蛋白，其特征在于编码具有VP281蛋白活性的多肽的核苷酸序列，或至少与VP281的核苷酸同源性70％的简并序列。

4、根据权利要求1所述的一种对虾白斑综合症病毒膜蛋白，其特征在于编码具有VP466蛋白活性的多肽的核苷酸序列，或至少与VP466的核苷酸同源性70％的简并序列。

5、一种抗对虾白斑综合症病毒感染的方法，其特征在于应用对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特异性多克隆抗体来防止对虾白斑综合症病毒感染养殖对虾。

6、一种利用重组技术生产三种对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP68，VP281，VP466的特异性多克隆抗体的方法。

7、一种能与权利要求2所述的对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP68特异性结合的抗体。

8、一种能与权利要求3所述的对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP281特异性结合的抗体。

9、一种能与权利要求4所述的对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP466特异性结合的抗体。

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