CN1434056A - 一种重组人乙肝病毒核心抗原的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组人乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的生产方法,该方法采用化学合成人乙型肝炎病毒核心抗原基因，构建重组质粒，转化大肠杆菌；经高密度发酵后收集菌体，破菌后经分级沉淀、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析纯化，可大规模制备电泳纯度高达95％的人乙型肝炎病毒核心抗原蛋白。该法纯化的重组人乙型肝炎病毒核心抗原可用于人乙型肝炎的预防和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体的说是乙肝病毒核心抗原基因的获得、克隆、表达核心抗原的工程菌种的构建及核心抗原的大规模纯化，制成纯度达95％的成品，用于乙型肝炎的诊断及治疗与预防。
背景技术
科学家对乙型肝炎的研究表明，肝细胞纤维化、肝硬化乃至肝细胞癌与肝脏受损直接相关，肝细胞的损伤不是乙肝病毒攻击的结果，而是机体在清除乙肝病毒的过程中造成的负面结果。有研究表明对乙肝病毒自然耐受或免疫应答低下的个体，尽管有慢性病毒血症，但很少或不发生肝细胞损伤(Dienstag，J.L.In Viral hepatitis and liver disease，135-166，1984；Feitelson M.A.Hepatitis B Virus gene products as immunological targets in chronic infection.Mol.Biol.Med.6，367-393(1989))。
1991年Miller等人(Miller A，Lider O，Weiner HL.Antigen-driven byatandersupression after oral administration of antigen.J Exp Med.1991，174；791)发现了旁观者抑制效应，即调节性T细胞迁移至淋巴器官中，抑制效应细胞产生免疫应答；或迁移至特异器官，通过释放非特异性抑制因子阻止免疫病理反应。旁观者抑制的诱导是抗原特异的，但效应是非特异的。这个实验解决了利用免疫耐受治疗疾病时应该采用何种抗原的问题，自身免疫性疾病往往是和大量抗原相关的，应该采用哪种抗原一直是困扰科学家的一个问题，旁观者效应表明与该疾病相关的抗原理论上都可以引起免疫耐受。
如果能够证实口服HBV主要结构蛋白可诱导对HBV的获得性免疫耐受，这一结果有望将慢性活动性肝炎转变为无症状病毒携带者，即把着重增强抗病毒免疫反应变为诱导宿主对HBV的免疫耐受，藉此降低机体免疫反应对肝组织的损伤，减少发生肝硬化或肝细胞癌的几率(Israel Gotsman，RoyBeinart et.Induction of oral tolerance towards hepatitis B envelope antigens in amurine model.Antiviral Research 48(2000)17-26)。
1998年美国ENZO BIOCHEM公司马上利用这一理论着手EHT899(主要成分为HBsAg)的动物实验；1999年Israel Gotsman(ENZO公司参与)利用HBV表面抗原成功诱导了鼠模型中的免疫耐受，通过口服HBV蛋白(HBsAg+PreS1+PreS2，BioHepB)显著降低了鼠血液中抗HBV抗体的滴度(Israel Gotsman，Roy Beinart et.Induction of oral tolerance towards hepatitis Benvelope antigens in a murine model.Antiviral Research 48(2000)17-26)。
2000年美国ENZO BIOCHEM公司完成一期临床实验，疗效显著，之后着手二期临床实验，2001年10月美国ENZO BIOCHEM公司公告显示二期临床达到预期疗效。
旁观者抑制效应的发现启发我们考虑HBcAg能够和HBsAg一样引起乙型肝炎患者针对HBV的免疫耐受，降低肝损伤程度，减少肝癌发病率。临床治疗效果的评价需要大规模制备HBcAg，因此我们构建了HBcAg高表达菌株，用基因工程技术制备HBcAg。
HBcAg的全称为Hepatitis B type virus core antigen(乙肝病毒核心抗原)，它在肝炎病毒中起到合成核壳的作用，它由183个氨基酸组成，为二十面体衣壳，分子量一般认为是23KD，根据亚型不同有所区别，容易形成聚体，等电点为9.6左右。编码HBcAg的基因处于乙肝病毒全基因组第1775-2326位(Paul T.Wingfield，Hepatitis Core Antigen Produced in Escherichiacoli：Subunit Composition，Conformational Analysis，and In Vitro CapsidAssembly.Biochemistry 1995，34，4919-4932；Chisari，F.V.and Ferrari，C.(1995)Hepatitis B virus immunopathogenesis.Annu.Rev.Immunol.13：29-60)。
在HBcAg的183个氨基酸中，含有48位、61位、107位和C末端四个Cys(半胱氨酸)，经研究发现48位和48位，61位和61位之间二硫键形成二聚体和四聚体，183位和183位之间二硫键形成多聚体，由于空间位置太远107位和107位之间无法形成二硫键(Zheng，J.，Schodel，F.and Peterson，D.L(1992)The structure of hepadnaviral core antigens.Identification of freethiols and determination of the disulfide bonding pattem.J.Biol.Chem.267(13)：9422-9429)。
据文献报道，在基因水平酶切，再转录表达出145个氨基酸，与HBcAg相比较C末端缺失了38个氨基酸，C末端半胱氨酸丢失，但仍旧可以合成核壳，仍具有复制病毒的能力，它的分子量约为16KD，其免疫原性与全长HBcAg相比没有明显差异，但16kd HBcAg在E.coli中的表达量要远远高于全长HBcAg的表达。(Paul T.Wingfield，Hepatitis Core Antigen Produced inEscherichia coli：Subunit Composition，Conformational Analysis，and In VitroCapsid Assembly.Biochemistry 1995，34，4919-4932)。
1979年，Mark Pasek在E.coli中表达了HBcAg基因(Pasek，M.，Goto，T.，Gilbert，W.，Zink，B.，Schaller，H.，MacKay，P，Leadbetter，G.and Murray，K.(1979)Hepatitis B virus genes and their expression in E.coli.Nature 282(5739)：575-579)，1982年，B.J.Cohen等成功将HBV的核心基因插入载体，克隆在E.coli里表达，通过电镜与来源于人肝脏的核心抗原比较，无明显差异，颗粒大小均为24-32nm；同时Stephen Stahl也在E.coli里克隆表达了HBV核心基因，通过RIA、免疫扩散(ID)、DNA序列分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳证实表达的是核心抗原(B.J.Cohen & J.E.Richmond，Electron microscopy ofhepatitis B core antigen synthesized in E.coli.Nature Vol.296，15 April 1982)。1986年Peter J.Kniskern等人在酵母Saccharomyces cerevisiae中表达了HBcAg，其表达量占酵母可溶性蛋白的40％，同人血清中分离到的HBcAg几何学上没有差异，同为28nm颗粒，实验证明这种HBcAg在小鼠体内具有较高的免疫活性(Peter J.Kniskem，Arpi Hagopian et.Unusually high-levelexpression of a foreign gene(hepatitis B virus core antigen)in Saccharomycescerevisiae.Gene，46(1986)135-141)。1995年Paul T.Wingfield等人也在E.coli里成功表达了HBcAg和HbeAg，E.coli表达的核心抗原，不以包涵体形式存在，也没有分泌在胞外，而是聚集装配成28nm大小的颗粒。
尽管以前在E.coli和Saccharomyces里面已经成功表达了HBcAg，但是目前公开的与HBcAg纯化有关的资料仍旧很少，在HBcAg纯化方面做的工作不多。1997年，M.Naito等人利用热处理法处理E.coli表达的HBcAg，电泳纯度达到90％，但经热处理后的蛋白经HPLC检测仍残留大量核酸等杂质(M.Naito，K.lshii et.Simple method for efficient production of hepatitis B viruscore antigen in Escherichia coli.Res virol.1997，148.299-305)；1999年H.Wizemann等人在E.coli里面表达了HIS耦联的HBcAg，这种蛋白可以利用Ni2+螯和层析法纯化，但是在工艺放大时会有较大的困难，要得到无HIS耦联的HBcAg，还需加上切割HIS工艺，成本也将增高(H.Wizemann，A.vonBrunn.Purification of E.coli-expressed HIS-tagged hepatitis B core antigen byNi2+-chelate affinity chromatography. Joumal of Virological Methods；77(1999)189-197)；2001年D.Rolland等人利用分子筛层析和超速离心法纯化了E.coli和酵母Pichia pastoris表达的HBcAg，虽然超速离心可得到纯度大于90％的HBcAg，分子筛层析可得到纯度约50％HBcAg，但是超速离心无法实现有效地、大规模地纯化，而且由于E.coli表达的HBcAg以28nm颗粒形式存在，分子筛层析无法去除大分子蛋白。国内王光荣等研究了利用重组表达的核心抗原蛋白制备e抗原的技术(王光荣黄耀煊，CN 85100276)。
本发明的创新之处在于通过基因工程的下游纯化技术，包括离子交换层析、疏水层析和分子筛层析，可有效的去除杂蛋白、核酸等杂质，电泳纯度达到95％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人乙肝病毒核心抗原的生产方法，通过基因工程的离子交换层析、疏水层析和分子筛层析等纯化技术，可有效的去除杂蛋白、核酸等杂质，电泳纯度达到95％。
本发明的目的是这样实现的，提供了一种重组人乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的生产方法，其特征在于合成HBcAg的基因，构建重组质粒，转化E.coli菌；筛选阳性克隆，高密度发酵，收集菌体；破菌；经分级沉淀、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析纯化，最终可得到SDS-PAGE纯度95％的HBcAg蛋白，可用于乙型肝炎的预防与治疗。
本发明的乙肝病毒核心抗原可以依据天然的全长HBcAg基因序列和蛋白质氨基酸序列，构建工程菌和蛋白，也可以将全长的HBcAg基因序列和蛋白质氨基酸序列，切除部分免疫原性较弱的片段即C末端的38个氨基酸，C末端半胱氨酸丢失，减少目的抗原片段基因长度，转录表达出145个氨基酸，有利于工程菌的构建和蛋白的表达。SEQ ID No.3为NCBI公布的183基因序列，其中1-3位atg为起始密码子，550-552位tag为终止密码子；SEQID No.4为NCBI公布的145基因序列，其中10-12位atg为起始密码子，445-447位tag为终止密码子。
本发明以大肠杆菌表达外源蛋白所偏爱的密码子替代天然基因的密码子，设计所表达HBcAg基因的双链DNA序列。SEQ ID No.1为SEQ ID No.3的替代设计后基因序列，其中1-3位atg为起始密码子，550-552位tag为终止密码子；SEQ ID No.2为SEQ ID No.4的替代设计后的基因序列，其中1-3位atg为起始密码子，436-438位tag为终止密码子。
根据设计的DNA序列，通过化学合成基因片段，再用DNA连接酶连接得到完整的基因。合成的基因片段纯化后通过PCR扩增，得到两端带有供载体连接用的接头。经酶切和质粒载体pET-21a(+)直接重组连接得到重组质粒pET-21(+)-16，并转化到E.coliBL21-SI受体菌中，得到受体菌单克隆扩大培养。抽取重组菌的质粒DNA，作电泳分析，证明含有乙型肝炎病毒核心抗原的结构基因，抽取的DNA作测序表明，其DNA的序列与合成的基因序列完全一致。
本法所用的表达型重组质粒的构建，是利用引物寡核苷酸引入HBcAg结构基因两端的BamHI和XhoI酶切点，酶切回收目的基因，插入连接到以pUC19为基础，T7噬菌体启动子启动转录的质粒载体pET-21a(+)，表达载体各组分来源：复制子(ori)E.coli的coliE1型，选择标记Ampr，启动子T7噬菌体φ10基因的启动子，终止序列T7噬菌体φ10基因的终止序列，插入点BamHI-XhoI。重组体转化E.coli BL21-SI受体菌中，然后筛选获得表达HBcAg的工程菌。
取保藏的菌种划线于含有培养基(如含有蛋白胨、酵母粉、琼脂的培养基)的平板上，在培养箱中培养18-20小时，挑取平板中的单菌落接种于含有培养基(如含有蛋白胨、酵母粉的培养基)的摇瓶中，在摇床上200-300rpm培养15-16小时，使OD600长到1.5-2.5。摇瓶培养后的种子液接种到含有培养基的发酵罐中培养，培养条件为温度25-32℃。(如发酵罐内培养基为蛋白胨60g、酵母粉30g、葡萄糖30g溶解于6000ml的蒸馏水中，罐内121℃灭菌20min，冷却到30℃后接种。)溶解氧为38-70％，搅拌转速250-400rpm，通气1∶1-1∶3，NaOH调节pH为6.9-7.2。连续培养约5-7小时后，OD600长到19-21左右，加入NaCl诱导表达，继续培养4-5小时(补料培养基可以为蛋白胨300g、酵母粉150g，溶解到1000ml的蒸馏水中，121℃灭菌30min，冷却后10小时内匀速补完。)，OD600长到30-40，离心收集菌体。
大肠杆菌发酵结束后，离心收集菌体沉淀。配制破菌缓冲液(如100mMNaOH-Gly，1mM EDTA)，按照菌体∶破菌缓冲液＝1∶18-1∶21(g/ml)比例混合，悬浮完全后超声，超声过程中冰浴预冷；然后离心，去沉淀，取上清。
发酵上清没有目标蛋白，发酵后离心收集菌体，破菌后离心取上清，通过控制破菌条件可使目标蛋白90％存在于上清中；使用盐的分级沉淀比如硫酸铵分级沉淀。硫酸铵分级沉淀，14-17％(g/v)硫酸铵可沉淀大部分的杂蛋白，核心抗原蛋白残留在上清中，再用20-25％(g/v)硫酸铵浓度沉淀目标蛋白，离心取沉淀，上清里面没有残留核心抗原蛋白，90％均在该硫酸铵沉淀里。硫酸铵沉淀可使目标蛋白纯度达到约50％，对破菌后产生的核酸等杂质也有去除效果。
然后用离子交换层析，填料采用DEAE、Q或QAE，HBcAg(16KD)等电点介于4.5-5.0，离子交换层析流动相1为20-50mmol/L巴比妥钠-盐酸、Tris-盐酸、硼酸-硼砂、NaOH-甘氨酸、硼砂-NaOH缓冲液，pH7.0-10，平衡离子交换柱，硫酸铵沉淀用平衡液溶解后上样，再用1.0mol/L NaCl梯度洗脱，可去除部分杂蛋白及大量其它非蛋白类杂质。经过离子交换层析可使蛋白纯度达到60-70％。
接着用疏水层析，填料采用Sepharose High Performance、Fast Flow系列介质，疏水层析流动相1为20-50mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸氢二钠或钾-磷酸二氢钠或钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、Tris-盐酸、硼酸-硼砂缓冲液，pH7.5-8.5，离子交换洗脱样品中加入硫酸铵或其它盐类至终浓度1-2mol/L，平衡Phenyl Sepharose High Performance，流速50-300cm/hr，上样后，再用不加硫酸铵的流动相1洗脱，可去除核酸杂质。经疏水层析可使蛋白纯度达到75％。
最后用分子筛层析，填料采用低吸附的Sepharcryl系列、Superdex系列的介质；其流动相为20-50mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸氢二钠或钾-磷酸二氢钠或钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、Tris-盐酸、硼酸-硼砂缓冲液，pH6.5-10.5，其中加入0-3％巯基乙醇或0-4％DTT。缓冲液平衡分子筛柱，样品浓缩后上样，分步收集样品，目标蛋白峰经电泳检测最高纯度可达95％。
本发明制备的重组人乙肝病毒核心抗原可按需要制成各种口服剂型，用于乙型肝炎的预防和治疗。剂型包括溶液剂、乳剂、混悬剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂等。
本发明提供一种具有药用前景的、大规模获得重组人乙肝病毒核心抗原的方法，其突出优点在于：
(1)利用E.coli表达16kdHBcAg，其表达量比用E.coli表达全长HBcAg的表达量高约2倍；我们也用酵母系统表达了HBcAg，虽然酵母是分泌表达的，利于后期的蛋白纯化，但是由于其表达量比E.coli表达系统低约4倍，且发酵周期要远远长于E.coli表达系统，不易放大生产，成本会大大提高。
(2)采用硫酸铵分级沉淀，操作简便，无须昂贵的仪器设备，一步纯度可达50％，有效去除核酸等物质。
(3)采用离子交换层析，核心抗原可挂柱，经过梯度洗脱，能去除部分杂质。
(4)疏水层析可去除核酸、脂类等杂质。
(5)分子筛层析，目标蛋白的出峰位置位于内水峰，而不是外水峰，这样能和大分子杂蛋白实现有效分离，纯度可达95％。而已经报道的核心抗原分子筛层析，其核心抗原都是出现在外水峰，与大分子杂蛋白一起流出，无法有效提高蛋白纯度。
附图说明
图1为质粒pET-21(+)-16的构建图。
图2为Westem-blotting检测E.coli表达核心抗原。
图2(1)为HBcAg电泳图。图2(2)为转膜后Western-blotting检测图。1-蛋白低分子量标准；2-全菌；3-硫酸铵沉淀样品；4-破菌后样品；5-空白；6-牛血清白蛋白。
图3为破菌及硫酸铵分级沉淀各步样品的SDS-PAGE电泳图。
1-破菌前；2-破菌后；3-破菌液离心沉淀；4-15％硫酸铵沉淀；5-15％硫酸铵沉淀；6-25％硫酸铵沉淀；7-25％硫酸铵沉淀。8-25％硫酸铵沉淀上清。
图4为DEAE层析图谱。
图5为DEAE层析样品的SDS-PAGE电泳图。
1-上样前样品(稀释5倍)；2-上样前样品(稀释5倍)；3-DEAE流出液；4-DEAE流出液；5-DEAE洗脱液；6-DEAE洗脱液。
图6为疏水层析图谱。
图7为疏水层析样品的SDS-PAGE电泳图
1-上样前样品为；2、3、4、5、6-HIC流出样品；9-HIC洗脱样品；10-HIC洗脱样品。
图8为分子筛层析图谱。
图9为分子筛层析样品的SDS-PAGE电泳。
具体实施方式
以下的实施例是为了详细说明本发明，但并不限制本发明。
实验材料和方法简要说明：
1.试剂、材料
PCR仪RoboCycle@Tc-48/H(a)。
BamHI酶和XhoI酶Clontech生产。
发酵罐：15L B.Braun生产。
超声设备JY92-II型超声波细胞粉碎机(宁波科生公司)。
离心机SoRvall@Rc26 Plus。
层析设备AKTATM explore(Amersham Biosciences)。
所用层析填料均为Amersham Biosciences生产。
巯基乙醇Sigma生产。
所用其它试剂均为国产分析纯。
2.常规分子学操作
DNA抽提采用酚抽提和乙醇沉淀的方法(Marmur，J.1961)，先用25∶24∶1(V/V/V)酚/氯仿/异戊醇抽提DNA，取水相，70％乙醇沉淀，风干后TE缓冲液溶解。
PCR扩增采用方法见(Saili et al.，1988)。
DNA测序采用化学测序(Maxam-Gilbert法)(Maxam-Gilbert，1977；1980)。
质粒构建采用常规方法(《分子克隆—实验指南》，科学出版社)
实施例1 表达HBcAg(16KD)蛋白的工程菌构建
依据大肠杆菌所偏爱的密码子，按照碱基的简并性、连续性，将天然基因见SEQ ID No.3的部分碱基加以修改，修改方法见下表1，切除天然基因的第436位-552位，序列末端加上tag终止密码子，修改后的基因序列见SEQID No.2，与Genebank M54923.报道的序列相比，改动的序列及变化的氨基酸序列见下表2：
表1 碱基序列的比较
| 位置 | 34 | 51 | 77 | 78 | 81 | 82 | 90 | 93 | 105 | 117 | 120 | 135 | 143 | 159 | 174 |
| HbcAg(145aa)碱基 | A | G | C | G | C | A | C | A | A | A | A | T | C | T | C |
| NCBI发表的碱基 | T | T | t | a | T | C | T | C | T | G | G | G | T | G | T |
| 位置 | 178 | 180 | 183 | 189 | 192 | 200 | 206 | 219 | 221 | 234 | 243 | 244 | 249 | 250 | 252 |
| HbcAg(145aa)碱基 | C | C | C | G | A | C | C | T | A | T | T | A | T | C | T |
| NCBI发表的碱基 | T | g | T | T | G | a | T | A | G | C | C | C | A | T | A |
| 位置 | 258 | 260 | 267 | 271 | 272 | 276 | 282 | 283 | 288 | 294 | 312 | 315 | 318 | 321 |
| HbcAg(145aa)碱基 | A | A | T | A | C | C | T | T | G | G | T | A | T | C |
| NCBI发表的碱基 | C | G | C | g | T | a | c | C | A | A | C | T | C | T |
| 位置 | 345 | 360 | 366 | 390 | 393 |
| HBcAg(145aa)碱基 | A | C | C | A | C |
| NCBI发表的碱基 | T | G | T | T | A |
表2 氨基酸序列的比较
| 位置 | 12 | 27 | 56 | 67 | 74 | 83 | 87 | 91 | 93 |
| HBcAg(145aa)氨基酸 | Thr | Val | Met | Thr | Asn | Asp | Asn | Thr | Val |
| NCBI发表的氨基酸 | Ser | Ile | Arg | Asn | Ser | Glu | Ser | Val | Met |
然后设计基因SEQ ID No.2第-1至-3位GGG为酶切保护位点，第-4至-9位为BamHI酶切位点，第1-435为改造过HBcAg(145kd)基因，436-438为TAG终止密码，第439-445位为Xho I酶切位点，第445-446位为酶切保护位点。
根据设计的DNA序列，通过化学合成全基因片段。合成的基因片段纯化后通过PCR扩增。
PCR扩增所用的引物为：
N端引物：5’GAAGGATCCATGGACGTTGACCC 3’
C端引物：5’GGCTCGAGCTATTCCGGAAGTG 3’
本方法所用的PCR反应条件为：
第一次反应：37℃2min→65℃2min→95℃1min循环5次
再42℃ 2min→65℃2min→95℃1min循环30次
再72℃保温5min
第二次反应：55℃1min→65℃2min→95℃1min循环30次
再72℃保温5min
基因经PCR扩增后，电泳时可明显看到455bp的DNA带，用第二次PCR扩增的产物纯化后酶切，与质粒载体pET-21a(+)直接重组连接，得到重组质粒pET-21(+)-16(见图1)，然后转化到E.coli BL21-SI受体菌中，得到受体菌单克隆扩大培养。抽取重组菌的质粒DNA，作电泳分析，证明含有乙型肝炎病毒核心抗原的结构基因，抽取的DNA作测序表明，其DNA的序列与合成的基因序列完全一致。(参见图2、3)
本法所用的表达型重组质粒的构建，是利用引物寡核苷酸引入HBcAg结构基因两端的BamHI和XhoI酶切点，酶切回收目的基因，插入连接到以pUC19为基础，T7噬菌体启动子启动转录的质粒载体pET-21a(+)，表达载体各组分来源：复制子(ori)E. coli的coli E1型，选择标记Ampr，启动子T7噬菌体φ10基因的启动子，终止序列T7噬菌体φ10基因的终止序列，插入点BamHI-XhoI。重组体转化E.coli BL21-SI受体菌中，然后筛选获得高表达HBcAg的工程菌。
实施例2 发酵
取-70℃保藏的菌种划线于含有以下培养基的平板上，于30℃的培养箱中培养18-20小时，平板上有菌落生长。
平板培养基配方：
蛋白胨： 10g
酵母粉(酵母提取物)： 5g
琼脂： 20g
以上成份溶解于1000ml的蒸馏水中，用NaOH调节pH到7.0。121℃蒸气灭菌20min，冷却到50℃，加入氨苄西林100mg，摇匀后倒平板。
挑取平板中的单菌落接种于含有以下培养基的摇瓶中，30℃的摇床中250rpm培养15-16小时，使OD600长到2.0左右。
摇瓶培养基配方：
蛋白胨： 10g
酵母粉： 5g
以上成份溶解于1000ml的蒸馏水中，用NaOH调节pH到7.0。121℃蒸气灭菌20min，冷却到室温，加入氨苄西林100mg，摇匀后接种。
摇瓶培养后的种子液接种到含有以下培养基的10L发酵罐中培养，培养条件为温度30℃，溶解氧大于40％，搅拌大于300rpm，通气1∶2，NaOH调节pH为7.0。连续培养约6小时后，OD600长到20左右，加入NaCl诱导表达，继续培养4-5小时，OD600长到30-40，离心收集菌体。
发酵培养基配方：
发酵罐内培养基：
蛋白胨： 60g
酵母粉： 30g
葡萄糖： 30g
以上成份溶解于6000ml的蒸馏水中，罐内121℃灭菌20min，冷却到30℃后接种。
补料培养基：
蛋白胨： 300g
酵母粉： 150g
以上成份溶解到1000ml的蒸馏水中，121℃灭菌30min，冷却后10小时内匀速补完。
实施例3 破菌
大肠杆菌发酵结束后，离心收集菌体沉淀。配制破菌缓冲液(100mMNaOH-Gly，1mM EDTA)，按照菌体∶破菌缓冲液＝1∶20(g/ml)比例混合，悬浮完全后，超声每次3s、间隔3s、共40次，功率500w，50ml/次，超声过程中冰浴预冷；然后10,000rpm，10分钟，2-8℃离心，去沉淀，取上清。(电泳结果见图3)。
实施例4 分级沉淀
取破菌后离心上清，缓慢加入固体硫酸铵(硫酸铵用前干燥磨碎)使终浓度达到15％(g/v)，边加边搅拌，室温搅拌10分钟，以使沉淀充分；10,000rpm，10分钟，2-8℃离心，去除沉淀取上清。再同样加入固体硫酸铵使终浓度达到22.5％(g/v)，室温搅拌10分钟；10,000rpm，10分钟，2-8℃，离心去除上清，取沉淀(电泳结果见附图3)。
实施例5 离子交换层析
硫酸铵分级沉淀最终产物加入pH 9.5 NaOH-Gly 20mmol/L，溶解后使蛋白总浓度小于0.5mg/ml。透析过夜，外透液pH9.5 NaOH-Gly 20mmol/L。
用pH 9.5 NaOH-Gly 20mmol/L(流动相1)平衡DEAE-Sepharose FF柱，流速100cm/h，上样后，再用流动相1加1.0mol/L NaCl洗脱，收集洗脱峰(层析图谱见图4，电泳结果见图5)。
实施例6 疏水层析
离子交换层析洗脱样品加入2mol/L硫酸铵至终浓度1mol/L，边加边搅拌，7000rpm，10mins，4-8℃，取上清准备上样。
用pH8.5 Tris-HCl 20mmol/L加入硫酸铵至终浓度1mol/L作为流动相1，平衡Phenyl Sepharose High Performance，流速50-300cm/hr，上样后，再用不加硫酸铵的流动相1洗脱，收集洗脱峰(层析图谱见图6，电泳结果见图7)。
实施例7 分子筛层析
DEAE洗脱峰浓缩到4-5mg/ml，要求样品内含有2.5％巯基乙醇、20mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl。
分子筛层析柱高径比40∶1，填料为Superdex G75；流动相为2.5％巯基乙醇、20mmol/L pH 8.0 Tris-HCl；流速50cm/hr；样品上样量小于柱床体积的5％(v/v)，分步收集流出峰(层析图谱见附图8，电泳结果见附图9)。
Claims (9)
1.一种重组人乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的生产方法，其步骤包括：合成HBcAg的基因，构建重组质粒，转化E.coli菌；筛选阳性克隆，高密度发酵，收集菌体；破菌；经盐的分级沉淀、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析纯化，最终可得到SDS-PAGE纯度95％的HBcAg蛋白。
2.如权利要求1所述的重组人乙型肝炎病毒核心抗原的生产方法，其特征在于，所述的HBcAg蛋白包括全长HBcAg基因表达产物(23KD)及切除部分免疫原性较弱基因序列后表达的产物，如HBcAg全长基因切除C端部分序列后仅表达氨基酸序列N端145个氨基酸的产物(16KD)。
3.如权利要求1所述的重组人乙型肝炎病毒核心抗原的生产方法，其特征在于，所述的盐的分级沉淀为硫酸铵分级沉淀。
4.如权利要求1所述重组人乙型肝炎病毒核心抗原的生产方法，其特征在于，所述的离子交换层析的填料为DEAE、Q、QAE等阴离子交换剂；疏水层析填料为Sepharose High Performance、Fast Flow系列介质；分子筛层析填料为低吸附的Sepharcryl系列、Superdex系列的介质。
5.如权利要求1所述的重组人乙型肝炎病毒核心抗原的生产方法，其特征在于，所述的离子交换层析的流动相1为20-50mmol/L巴比妥钠-盐酸、Tris-盐酸、硼酸-硼砂、NaOH-甘氨酸、硼砂-NaOH缓冲液，pH7.0-10，流动相2为上述相应的流动相1中加入1.0mol/L NaCl梯度洗脱。
6.如权利要求1所述的重组人乙型肝炎病毒核心抗原的生产方法，其特征在于，所述的疏水层析的流动相1为20-50mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸氢二钠或钾-磷酸二氢钠或钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、Tris-盐酸、硼酸-硼砂缓冲液，pH7.5-8.5，其中加入1-2mol/L硫酸铵或其它盐类，流动相2为20-50mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸氢二钠或钾-磷酸二氢钠或钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、Tris-盐酸、硼酸-硼砂缓冲液，pH7.5-8.5。
7.如权利要求1所述的重组人乙型肝炎病毒核心抗原的生产方法，其特征在于，所述的分子筛层析，其流动相为20-50mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸氢二钠或钾-磷酸二氢钠或钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、Tris-盐酸、硼酸-硼砂缓冲液，pH6.5-10.5，其中加入0-3％巯基乙醇或0-4％DTT。
8.一种用权利要求1-7中任意一项所述的方法生产的重组人乙型肝炎病毒核心抗原，其特征在于，可以用于乙型肝炎的预防和治疗。
9.如权利要求8所述的重组人乙型肝炎病毒核心抗原，其特征在于，可以制成溶液剂、乳剂、混悬剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂等各种剂型。
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