CN103882042A - 乙肝e抗原的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙肝e抗原的纯化方法，包括以下步骤：将含有5’端或3’端连接了多聚组氨酸编码基因的乙肝e抗原基因的重组质粒转入细菌本体，得到重组细菌；加入诱导剂进行重组细菌培养；将重组细菌裂解，并将裂解液进行离心；将固定化金属螯合亲和层析介质与离心所得上清液或用高浓度变性剂溶解离心所得沉淀制备的沉淀溶解液在允许多聚组氨酸融合乙肝e抗原结合或吸附至所述介质的条件下接触；从所述介质选择性洗脱所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原。本发明利用融合标签技术与亲和层析结合，操作简单方便；以多聚组氨酸作为融合标签，对乙肝e抗原的结构无影响。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乙肝e抗原的纯化方法。
背景技术
传统的乙肝e抗原主要来自感染者的血清，来源困难，每个批次的抗原效价具有差异，作用效果稳定性差，生产人员具有一定的操作风险，且难以纯化。
随着分子生物学的发展，出现了许多利用基因工程技术制备乙肝e抗原的方法，通过构建基因工程菌，大量生产乙肝e抗原。然而，这些基因工程技术生产的乙肝e抗原存在产品效价差，免疫原性低等问题，并且，基因工程菌产物中除了乙肝e抗原，还包括多种杂质。
在乙肝e抗原在达到药学或免疫学上可接受的要求之前需要去除杂质，这些杂质一般包括基因工程菌其他代谢产物，如蛋白或DNA分子，以及乙肝e抗原的变体或错误折叠的形式。这些杂质在给药或免疫过程中可能会引起过敏性反应而对产物的安全性产生负面影响。这些杂质在不同的色谱模式可能具有宽泛的停留模式，因此去除较困难，通常需要涉及多个不同的色谱纯化的步骤。
通常的乙肝e抗原纯化方法大多基于乙肝e抗原蛋白和杂质之间在大小、电荷及溶解性上的差异来进行选择，主要方法包括亲和色谱、离子交换色谱、体积排阻色谱和疏水相互作用色谱等。这些方法存在一定的技术瓶颈，如离子交换和疏水相互作用色谱等技术可能在洗脱过程中因为蛋白质浓度的增加、缓冲液浓度的变化或pH值的变化造成目标产物乙肝e抗原活性的改变。
另外，在多种情况下，目标产物与杂志在等电点上显示出的差异太小，通过离子交换色谱无法将它们进行分离。体积排阻色谱的操作步骤繁琐，且存在对目标产物严重稀释的不足，不适合大规模，高效率的乙肝e抗原生产工艺。亲和色谱易发生渗漏，导致对洗脱目标产物的污染。
近年来出现的融合标签技术，利用亲和纯化定向设计目标蛋白，与纯化基质不发生任何直接相互作用，避免这种直接的相互作用导致目标产物的活性变化。现有技术中用GST（Glutathione S-transferase，谷胱甘肽巯基转移酶）融合乙肝e抗原，但是GST的相对分子量为26000，对乙肝e抗原的蛋白结构产生影响，在达到药学或免疫学上应用的要求前要将GST标签去除，操作繁琐，去除GST标签的乙肝e抗原还需重新进行纯化去除新的杂质。
开发减少操作步骤，并且不破坏或降低乙肝e抗原蛋白活性的纯化方法成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明旨在解决上述现有技术中存在的问题，提出一种乙肝e抗原的纯化方法，包括以下步骤：
将含有重组乙肝e抗原基因的重组质粒转入细菌本体，得到重组细菌，所述重组乙肝e抗原基因包括乙肝e抗原基因和连接于乙肝e抗原基因5’端或3’端的多聚组氨酸编码基因；
加入诱导剂进行重组细菌培养；
将重组细菌裂解，并将裂解液进行离心，收集离心所得上清液，将离心所得沉淀用高浓度变性剂溶解制备沉淀溶解液；
将固定化金属螯合亲和层析介质与上清液或沉淀溶解液在允许多聚组氨酸融合乙肝e抗原结合或吸附至所述介质的条件下接触；
从所述介质选择性洗脱所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原。
优选地，在洗脱之前还包括以下步骤：在所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原保持与所述介质结合的条件下清洗所述结合的介质。
优选地，所述清洗的步骤包括用至少一种多聚组氨酸融合乙肝e抗原清洗缓冲液清洗所述结合的介质，其中所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原清洗缓冲液包含100至200mmol/L NaCl和30至100mmol/L Tris，pH范围在6.5-7.5。
优选地，所述细菌本体选自Escherichia coli，Shigella sonnei，Shigelladysenteriae，Shingella flexneri，Salmonella typhimurium，Salmonellaenterica，Enterobacter aerogenes，Serratia marcescens，Yersinia pestis，或者Klebsiella pneumoniae。
优选地，所述重组质粒由重组乙肝e抗原基因转入原核表达质粒形成。
优选地，所述介质为载有过渡态金属离子的固定化金属螯合亲和层析介质。
优选地，所述过渡态金属离子为Cu2+、Zn2+、Ni2+或Co2+。
优选地，所述诱导剂为IPTG，所述重组细菌的培养温度为37℃，培养时间为3h。
优选地，所述洗脱的步骤包括用至少一种多聚组氨酸融合乙肝e抗原洗脱缓冲液洗脱吸附的多聚组氨酸融合乙肝e抗原，其中，所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原洗脱缓冲液包含5至80mmol/L咪唑或5至20mmol/L EDTA；和30至100mmol/L Tris。
优选地，在选择性洗脱后还进一步包括以下的一种或多种：羟基磷灰石色谱、阳离子交换色谱、亲和色谱、体积排阻色谱、疏水相互作用色谱、渗滤或超滤。
本发明的有益效果在于，利用融合标签技术与亲和层析结合，操作简单方便；以多聚组氨酸作为融合标签，对乙肝e抗原的结构无影响。
附图说明
图1是本发明的乙肝e抗原的纯化方法的实现流程图。
图2是本发明的乙肝e抗原的纯化方法的一个优选方案的实现流程图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本申请的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
本发明利用融合标签技术，将乙肝e抗原基因的5’端或3’端融合多聚组氨酸编码基因，形成乙肝e抗原重组DNA，再通过细菌宿主来表达重组乙肝e抗原，表达的重组乙肝e抗原的5’端或3’端有多聚组氨酸（His标签），利用His标签与固定化金属螯合亲和层析介质结合的亲和色谱模式对乙肝e抗原进行纯化，如图1所示，具体步骤如下：
首先，将含有5’端或3’端连接了多聚组氨酸编码基因的乙肝e抗原基因的重组质粒转入细菌本体，得到重组细菌。
本发明的技术方案中选择多聚组氨酸作为融合标签，多聚组氨酸由6-10个连续组氨酸组成，分子量较小，将其置于乙肝e抗原的氨基或羧基末端，不会影响乙肝e抗原的蛋白结构。在本发明的一个实施例中多聚组氨酸融合标签优选为六聚组氨酸。
本发明将5’端或3’端连接了多聚组氨酸编码基因的乙肝e抗原基因（乙肝e抗原重组DNA）进行原核表达，所述重组质粒由乙肝e抗原重组DNA转入原核表达质粒形成。在本发明的一个实施例中原核表达质粒选用PET质粒，优选为pET-28a-c（+）质粒。
所述细菌本体选自Escherichia coli，Shigella sonnei，Shigelladysenteriae，Shingella flexneri，Salmonella typhimurium，Salmonellaenterica，Enterobacter aerogenes，Serratia marcescens，Yersinia pestis，或者Klebsiella pneumoniae。在本发明的一个实施例中优选Escherichiacoli作为细菌本体。
接着，加入诱导剂进行重组细菌培养。为了增加重组DNA的表达量，在重组细菌培养时可加入诱导剂，在本发明的一个实施例中选用Escherichiacoli作为细菌本体，pET-28a-c（+）质粒作为原核表达质粒，因此选择乳糖操纵子诱导剂，如别乳糖、半乳糖或IPTG（异丙基硫代半乳糖苷），优选为IPTG，在本发明的一个优选实施例中，IPTG的诱导浓度为0.6mmol/L，诱导温度为37℃。
接着，将重组细菌裂解，并将裂解液进行离心。重组细菌的裂解可以采用物理或化学方式，如进行超声波裂解或加入裂解液使重组细菌裂解。
在本发明的一个实施例中采用超声波处理重组细胞，使重组细胞裂解。在本发明的另一个实施例中，采用如下配方的裂解液对重组细菌进行处理：含有1mg/mL溶菌酶、0.2%脱氧胆酸钠、1mmol/L PMSF和50mmol/LTris-HCl。
重组细菌裂解后，氨基端或羧基端连接有多聚组氨酸的重组乙肝e抗原从细菌细胞内释放出来。原核表达过程中，正确折叠的乙肝e抗原具有蛋白活性，为可溶性蛋白，一部分乙肝e抗原会发生错误折叠，不具有蛋白活性，并且会发生聚集，成为包涵体，包涵体是错误折叠的乙肝e抗原聚集形成的，是一种不溶性的物质，当对裂解液进行离心时，可溶性的正确折叠抗原不会被沉淀而存在于上清液中，错误折叠的抗原发生聚集，以不溶的包涵体形式存在于沉淀中。
离心所得上清液中含有正确折叠的乙肝e抗原，可直接进行纯化。离心所得沉淀中含有错误折叠的乙肝e抗原形成的包涵体，将所述沉淀用高浓度变性剂溶解，高浓度的变性剂可以溶解包涵体，所述变性剂可选用任何可使包涵体溶解的蛋白变性剂，如尿素或胍。在本实施例中优选为尿素溶液，所述尿素溶液浓度优选为1-8mol/L（pH=8.0）。
然后，将固定化金属螯合亲和层析介质与上清液或沉淀溶解液在允许多聚组氨酸融合乙肝e抗原结合或吸附至所述介质的条件下接触。
固定化金属螯合亲和层析介质中载有过渡态金属离子，如Cu2+、Ni2+、Zn2+或Co2+，过渡态金属离子能够与多聚组氨酸的氮原子以配位键结合，本实施例中使用的介质的金属离子优选为Ni2+或Co2+。
将所述过渡态金属离子固定于所述亲和介质中。所述亲和层析介质可以采用琼脂糖凝胶；以及纤维素、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚羟乙基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇、聚丙烯环氧烷、树脂及上述物质的衍生物或共聚物；及多孔玻璃珠、大孔硅胶、磷灰石等无机材料；或亲和层析色谱也是常用的技术手段，如色谱柱、扩张柱床（膨胀床）等。
在本发明的一个优选实施例中选用固定Ni2+或Co2+螯合亲和层析色谱柱，如镍离子金属螯合亲和层析柱（Ni-NTA层析柱）。
在离心所得上清液与固定化金属螯合亲和层析介质接触的过程中，上清液中的乙肝e抗原被吸附于所述介质上。在用高浓度变性剂溶解离心所得沉淀制备的沉淀溶解液与固定化金属螯合亲和层析介质接触的过程中，沉淀溶解液中的乙肝e抗原被吸附于所述介质上，同时变性剂被除去，发生变性的乙肝e抗原可以逐步折叠复性，因此，在包涵体的纯化过程中，同时实现了乙肝e抗原的复性。
最后，从所述介质选择性洗脱所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原。
所述洗脱的步骤包括用至少一种多聚组氨酸融合乙肝e抗原洗脱缓冲液洗脱吸附的多聚组氨酸融合乙肝e抗原，其中，所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原洗脱缓冲液包含约5至80mmol/L咪唑或约5至20mmol/L EDTA；和约30至约100mmol/L Tris。
在本实施例的一个优选方案中，在洗脱之前还包括以下步骤（图2所示）：在所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原保持与所述介质结合的条件下清洗所述结合的介质。
将与乙肝e抗原一起吸附于所述介质上的其他污染物（其他蛋白或DNA）去除，可以使用平衡溶液对所述介质进行平衡，所述平衡溶液包括约10至约200mmol/L NaCl和约30至约100mmol/L Tris，pH范围在6.5-7.5。例如，在本发明的一个实施例中，所述平衡溶液（多聚组氨酸融合乙肝e抗原清洗缓冲液）包含约100至约200mmol/L NaCl和约30至约100mmol/L Tris，pH范围在约7。
本发明的纯化方法还可以与至少一种其他的纯化方法组合使用，如与羟基磷灰石色谱、阳离子交换色谱、亲和色谱、体积排阻色谱、疏水相互作用色谱、渗滤或超滤中的一种或几种组合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
溶液配制
缓冲液A：50mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.0；
缓冲液B：用缓冲液A配制浓度为5mmol/L的咪唑溶液；
缓冲液C：用缓冲液A配成50mmol/L的咪唑溶液，pH 8.0；
缓冲液D：用缓冲液A配成80mmol/L咪唑溶液，pH8.0；
变性液1：缓冲液A配成1mol/L尿素溶液，pH 8.0；
变性液2：缓冲液A配成8mol/L尿素溶液，pH 8.0；
清洗液1：10mmol/L NaCl和30mmol/L Tris；
清洗液2：100mmol/L NaCl和50mmol/L Tris。
实施例1
乙肝e抗原（HBeAg）基因目的序列的获取
以实验室保存的含HbeAg基因的pADR-1质粒为模板，以含有XmaI酶切位点的SEQ ID No.1为上游引物，以含有Not I酶切位点的SEQ IDNo.2为下游引物进行PCR扩增，得到HBeAg基因。扩增产物回收纯化后在HBeAg基因的3’端引入六聚组氨酸编码基因形成重组HBeAg基因，将重组HBeAg基因经Xma I和Not I双酶切，插入同样经双酶切的pET-28a-c（+）中，得到含有重组HBeAg基因的重组质粒pET-28a-c（+）-HBeAg。将重组质粒转化到大肠杆菌中保存。
重组质粒的诱导表达
对重组细菌进行摇菌培养，使用IPTG诱导重组HbeAg抗原的表达，IPTG的最适诱导浓度为0.6mmol/L，诱导温度为37℃，在上述条件下诱导3h，收集重组细菌沉淀，超声裂解重组细菌，将裂解液置于4℃，10000rpm下离心15min，分别收集裂解液离心后的上清液和沉淀。
可溶性重组Hbe Ag抗原纯化
1、将Ni-NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍Ni-NTA层析柱体积的缓冲液A清洗树脂；
2、把离心所得上清液加到Ni-NTA层析柱中，流速控制在15ml/h，收集漏过部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况；
3、用5倍柱体积的缓冲液B对Ni-NTA层析柱进行洗脱，pH 8.0，流速控制在30ml/h，收集洗脱液；用1.5倍Ni-NTA层析柱体积的缓冲液C对Ni-NTA层析柱进行连续两次洗脱，流速控制在15ml/h，收集洗脱液；再用1.5倍Ni-NTA层析柱体积缓冲液D对Ni-NTA层析柱进行连续三次洗脱，收集洗脱液；
4、用SDS/PAGE确定重组HbeAg抗原在洗脱液中的分布情况。
结果显示，重组HbeAg抗原纯度较高。
不溶性重组HbeAg抗原包涵体的复性纯化
用变性液1洗涤离心所得沉淀两次；再用变性液2对重悬沉淀，室温下作用1h，后于15000rpm，4℃下离心30min，收集上清液用于重组HbeAg抗原包涵体的纯化。
以下步骤与上述可溶性重组HbeAg抗原纯化的步骤相同。
结果显示，洗脱液中含有复性的重组HbeAg抗原。
实施例2
乙肝e抗原（HBeAg）基因目的序列的获取
以实验室保存的含HbeAg基因的pADR-1质粒为模板，以含有XmaI酶切位点的SEQ ID No.1为上游引物，以含有Not I酶切位点的SEQ IDNo.2为下游引物进行PCR扩增，得到HBeAg基因。扩增产物回收纯化后在HBeAg基因的5’端引入六聚组氨酸编码基因形成重组HBeAg基因，将重组HBeAg基因经Xma I和Not I双酶切，插入同样经双酶切的pET-28a-c（+）中，得到含有重组HBeAg基因的重组质粒pET-28a-c（+）-HBeAg。将重组质粒转化到大肠杆菌中保存。
重组质粒的诱导表达
对重组细菌进行摇菌培养，使用IPTG诱导重组HbeAg抗原的表达，IPTG的最适诱导浓度为0.6mmol/L，诱导温度为37℃，在上述条件下诱导3h，收集重组细菌沉淀，用配方为1mg/mL溶菌酶、0.2%脱氧胆酸钠、1mmol/L PMSF和50mmol/L Tris-HCl的裂解液处理重组细菌沉淀得到裂解液，将裂解液置于4℃，10000rpm下离心15min，分别收集裂解液离心后的上清液和沉淀。
可溶性重组HbeAg抗原纯化
1、将Ni-NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍Ni-NTA层析柱体积的缓冲液A清洗树脂；
2、把离心所得上清液加到Ni-NTA层析柱中，流速控制在15ml/h，收集漏过部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况；
3、用1.5倍Ni-NTA层析柱体积的清洗液1对对Ni-NTA层析柱进行连续两次清洗；再用1.5倍Ni-NTA层析柱体积的清洗液2对Ni-NTA层析柱进行连续三次清洗；
4、用5倍柱体积的缓冲液B对Ni-NTA层析柱进行洗脱，pH 8.0，流速控制在30ml/h，收集洗脱液；用1.5倍Ni-NTA层析柱体积的缓冲液C对Ni-NTA层析柱进行连续两次洗脱，流速控制在15ml/h，收集洗脱液；再用1.5倍Ni-NTA层析柱体积缓冲液D对Ni-NTA层析柱进行连续三次洗脱，收集洗脱液；
5、用SDS/PAGE确定重组HbeAg抗原在洗脱液中的分布情况。
结果显示，重组HbeAg抗原纯度略高于实施例1中此步骤所得重组HbeAg抗原的纯度。
不溶性重组HbeAg抗原包涵体的复性纯化
用变性液1洗涤离心所得沉淀两次；再用变性液2对重悬沉淀，室温下作用1h，后于15000rpm，4℃下离心30min，收集上清液用于重组HbeAg抗原包涵体的纯化。
以下步骤与上述可溶性重组HbeAg抗原纯化的步骤相同。
结果显示，洗脱液中含有复性的重组HbeAg抗原。
虽然本发明参照当前的较佳实施方式进行了描述，但本领域的技术人员应能理解，上述较佳实施方式仅用来说明本发明，并非用来限定本发明的保护范围，任何在本发明的精神和原则范围之内，所做的任何修饰、等效替换、改进等，均应包含在本发明的权利保护范围之内。
Claims (10)
1.一种乙肝e抗原的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含有重组乙肝e抗原基因的重组质粒转入细菌本体，得到重组细菌，所述重组乙肝e抗原基因包括乙肝e抗原基因和连接于乙肝e抗原基因5’端或3’端的多聚组氨酸编码基因；
加入诱导剂进行重组细菌培养；
将重组细菌裂解，并将裂解液进行离心，收集离心所得上清液，将离心所得沉淀用高浓度变性剂溶解制备沉淀溶解液；
将固定化金属螯合亲和层析介质与上清液或沉淀溶解液在允许多聚组氨酸融合乙肝e抗原结合或吸附至所述介质的条件下接触；
从所述介质选择性洗脱所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在洗脱之前还包括以下步骤：在所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原保持与所述介质结合的条件下清洗所述结合的介质。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述清洗的步骤包括用至少一种多聚组氨酸融合乙肝e抗原清洗缓冲液清洗所述结合的介质，其中所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原清洗缓冲液包含100至200mmol/L NaCl和30至100mmol/L Tris，pH范围在6.5-7.5。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述细菌本体选自Escherichia coli，Shigella sonnei，Shigella dysenteriae，Shingellaflexneri，Salmonella typhimurium，Salmonella enterica，Enterobacteraerogenes，Serratia marcescens，Yersinia pestis，或者Klebsiellapneumoniae。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述重组质粒由重组乙肝e抗原基因转入原核表达质粒形成。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述介质为载有过渡态金属离子的固定化金属螯合亲和层析介质。
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述过渡态金属离子为Cu2+、Zn2+、Ni2+或Co2+。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述诱导剂为IPTG，所述重组细菌的培养温度为37℃，培养时间为3h。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述洗脱的步骤包括用至少一种多聚组氨酸融合乙肝e抗原洗脱缓冲液洗脱吸附的多聚组氨酸融合乙肝e抗原，其中，所述多聚组氨酸融合乙肝e抗原洗脱缓冲液包含5至80mmol/L咪唑或5至20mmol/L EDTA；和30至100mmol/LTris。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的纯化方法，其特征在于，在选择性洗脱后还进一步包括以下的一种或多种：羟基磷灰石色谱、阳离子交换色谱、亲和色谱、体积排阻色谱、疏水相互作用色谱、渗滤或超滤。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140625 |