CN102127156A

CN102127156A - 一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白及其编码基因和制备方法

Info

Publication number: CN102127156A
Application number: CN2010105621005A
Authority: CN
Inventors: 张光亚; 黄凯宗; 李夏兰; 林毅; 陈国�
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2010-11-16
Filing date: 2010-11-16
Publication date: 2011-07-20

Abstract

本发明公开了一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白，它具有序列表1所示的氨基酸序列或其融合蛋白、或其功能性片段、或其功能性片段衍生物中的一种；以及此种融合标签蛋白的编码基因和融合标签蛋白的制备方法。本发明制备的融合标签能简单、快速与目标蛋白基因链接，实现高效表达；对目标蛋白结构和正常功能无明显影响，安全性高；蛋白表达条件简单，纯化方便，生产成本低廉，因而适宜进行工业化生产。

Description

一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白及其编码基因和制备方法

技术领域

本发明涉及一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白及其编码基因和制备方法。

背景技术

近年来，生物技术尤其是基因工程的迅猛发展，表达蛋白已变得较容易。相对而言，纯化却是一个非常繁杂的工作。蛋白质分子大规模分离纯化是当前生物工程中的关键技术问题，纯化过程所需成本约占总成本的60％-70％。兴起于20世纪末的融合标签技术促进了重组蛋白纯化技术的发展，其主要过程是利用重组DNA技术在靶蛋白编码基因的3′端或5′端融合某种标签的编码基因，通过宿主表达重组蛋白质，该重组蛋白可通过其融合的标签与包被在固相基质上的特异配基结合而得以纯化。此方法已成为后基因组学时代纯化重组蛋白常用手段。它无需了解蛋白质的生化特性或生理活性，就可通过带标签的重组融合蛋白选择性地与层析基质上的配体结合，从而得以纯化蛋白。采用保护蛋白质结构和功能完整性的温和条件，已成功地通过一步亲和层析从粗提物中纯化出了多种重组蛋白，纯度达90％以上。其中最为典型的代表就是聚组氨酸(以镍离子为配基)，此法具有快速、高分辨率等诸多优点。

融合表达在最初的检测和纯化时会很方便，但若对目标蛋白进行生化及功能分析，需要避免亲和标签所带来的潜在干扰，通常必需去掉外源融合标签，尤其是具有治疗和诊断用途的蛋白，往往必需去掉所有外源氨基酸。已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法。早期的化学裂解法虽便宜、有效，但由于裂解位点特异性低和可能对目标蛋白产生不必要修饰，已被酶解法逐步取代。酶解法条件较温和，且普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度特异性，它们均具有较长的底物识别序列，降低了蛋白质中其它无关部位发生断裂的可能性。但酶解法成本高(这些酶价格一般都相当昂贵)、反应时间长(10多个小时)、更重要的是这些酶蛋白不可避免地混入目标蛋白中，造成新的污染，需在裂解后附加层析分离除去，使纯化工艺复杂化。此外，与融合标签结合的特异配基价格昂贵也限制了在大规模分离纯化中的应用。因此，发展简单易行、廉价、可靠的蛋白质纯化方法对于大规模生产重组蛋白及高通量蛋白质组学研究具有重要意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白及其编码基因和制备方法。本发明制备的融合标签蛋白能快速与目标蛋白融合，经过条件的控制，可采用离心或过滤的方法分离重组蛋白，效果显著；蛋白表达条件简单，易于操作，生产成本低廉，因而适宜进行工业化生产。

为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案：

一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白，它具有序列表1所示的氨基酸序列或其融合蛋白、或其功能性片段、或其功能性片段衍生物中的一种。(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCCNO.4185，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏日期：2010年9月17日。)

一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的编码基因，它具有序列表2所示的核苷酸序列。(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC NO.4185，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏日期：2010年9月17日。)

一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，采用序列表2所示核苷酸序列的编码基因融合表达之后经高速离心进行分离制备该融合标签蛋白。

所述的序列表2所示的编码基因插入到经人工改造后的表达载体pET-22b(购于上海捷瑞生物工程有限公司)，转化到大肠杆菌BL21(DE3)或者BLR菌株中，用热击法转化到大肠杆菌BL21(DE3)或者大肠杆菌BLR菌株中(二者均为商业化菌株，可直接从上海超研生物科技有限公司、上海博亚生物科技有限公司购买)。BL21(DE3)基因型：F_omp T hsdSB(rB_mB_)dcm gal(DE3)pLysS Cam r，特点：该菌株带有质粒pLysS，具有氯霉素抗性。大肠杆菌BLR菌株为BL21(DE3)的衍生株，它是recA-，RecA是大肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。它的缺失，可以保证质粒的稳定。质粒中含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。

经过质粒酶切分析、PCR鉴定，筛选出阳性转化子，阳性转化子经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(购于Sigma公司)诱导使编码基因获得融合高效表达，细胞破碎后，利用高速离心对表达的蛋白进行纯化。

所述的表达载体pET-22b的人工改造包括如下步骤：1)人工合成序列表3的基因片段(委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，该序列来源于文献Improved non-chromatographic purification of a recombinant protein by cationic elastin-like polypeptides，Biomacromolecules.20078(5)：1417-1424.作者：Dong Woo Lim，Kimberly Trabbic-Carlson，J.Andrew MacKay，and Ashutosh Chilkoti)；2)用上述基因片段替换初始pET-22b(+)中NdeI与EcoRI酶切位点之间的序列。

所述的高效表达为低温诱导表达，包括如下步骤：1)将甘油菌(购于上海捷瑞生物工程有限公司)按1∶100的体积比接入到含氨苄青霉素(Amp)(100mg/L)的LB液体中培养(OD₆₀₀值为0.6-1.0，时间为10-12h)，4℃保存，离心收集细胞；2)将细胞重悬浮于2ml的含氨苄青霉素(Amp)(100mg/L)2ml的Luria-Bertani培养基(LB)液体中，再培养(OD₆₀₀值为0.6-1.0，时间为10-12小时)，以此接种；按1∶100的接种量接种于TB培养基中，置于37℃摇床，以200r/min的速度，培养4-5小时；加入IPTG诱导剂(终浓度为1mM)诱导7小时；之后，4℃下以4000r/min的速度，离心15分钟，按照1L菌液40mlPBS缓冲液(须预先冰浴冷却)重悬菌体。

所述的细胞破碎采用超声波法，包括如下步骤：1)取出加入IPTG诱导剂，诱导7小时后的锥形瓶，冰浴，使细胞停止生长，将菌液分装于100ml离心管中，使处于对称位置的离心管质量相等(配平)，离心，离心条件转速4000r/min，时间15min；2)离心机停止后，取离心管，弃上清，按1∶25(PBS缓冲溶液∶菌液)的比例加入PBS缓冲溶液洗涤菌体，在旋涡混合器上充分振荡，直至将离心管底的菌体冲洗干净，收集；3)用超声波破碎机进行细胞破碎，条件为超2s，停2s，80个循环，之后收集细胞破碎液。

所述的纯化采用高速离心法纯化蛋白，包括如下步骤：1)加入聚乙烯亚胺(终浓度为0.5％W/V)，振荡，使其充分混匀，去除核酸；2)将蛋白质溶液分装于10ml的离心管，冰浴15min，离心，其条件为4℃，14000r/min，离心时间15min；3)取出离心管，将上清液移到干净的离心管，弃沉淀，按体积比1∶2(NaCl溶液∶上清液)加入NaCl溶液，45℃恒温水浴15min，离心，离心条件为38℃，13500r/min，时间为5min；4)取出离心管，迅速弃上清，每管加2mlPBS缓冲溶液，沿管壁缓慢滴加，使壁上的蛋白质充分溶解，冰浴15min后离心，离心条件为4℃，14000r/min，时间为5min；5)重复步骤3)和4)一次。最终弃沉淀，收集上清，保存在-20℃冰箱中；6)透析后冷冻干燥。

所述的TB培养基(体积为900ml)配方为：蛋白胨(Tryptone)12g，酵母粉24g(购于OXOID公司)，丙三醇(Glycerol)8ml；将TB培养基经高压蒸汽灭菌，与经高压蒸汽灭菌后的磷酸盐缓冲液按9∶1的比例混合后使用；其中所述的磷酸盐缓冲液(体积为100ml)配方为：磷酸氢二钾(K₂HPO₄)12.54g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)2.31g。

所述的PBS缓冲溶(1000ml)液配方为：NaCl 8g、KCl 0.2g、NaH₂PO₄0.66g，溶解在二次水中，调节pH为7.3。

本发明的有益效果是：类弹性蛋白多肽(Elastin-Like Polypeptide，ELP)是一种生物高分子，由于其特殊的性质，成为构建“非色谱法”分离纯化蛋白的宠儿。它包含有一个重复的序列(VPGXG)，其中X代表除脯氨酸以外的任何一个氨基酸。在室温下，ELP在水溶液当中有很高的溶解度，而当温度升至30-40℃之间时便从溶液中析出。某一特定ELP精确的相变温度(T_t)与多种因素有关：多肽链长度、浓度，残基X的类型和多少、溶液中盐浓度以及与其相连目标蛋白的性质等，这为精确控制T_t提供了可能。每纯化1kg蛋白质所需原材料的费用分别为：利用His尾巴亲和层析$838124.73，使用IMPACT-CN纯化系统$989606.23，而采用ELP体系仅$74509.75，不到前两者的10％。采用ELP进行非色谱纯化操作简易、成本低廉，给重组蛋白的分离纯化技术带来革命性的变化。本发明的融合标签蛋白及其基因的用途为：本发明制备的融合标签蛋白中的ELP能快速与目标蛋白融合，融合后能通过高速离心的方法快速、简便的将目标蛋白纯化，同时可浓缩蛋白溶液，避免了色谱分离的繁琐操作及对蛋白样品的稀释。且具有以下特点：1)能简单、快速与目标蛋白基因链接，实现高效表达；2)对目标蛋白结构和正常功能无明显影响，安全性高；3)蛋白表达条件简单，纯化方便，生产成本低廉，因而适宜进行工业化生产。本发明为重组蛋白的分离提供了一条新途径，在生物分离领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明最后获得的融合标签蛋白中的ELP对目标蛋白进行分离，使目标蛋白能发生明显的相变现象图；

图2是本发明产品经高速离心后ITC纯化前后对照图；

图3是本发明产品经高速离心后ITC纯化后电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明作进一步的描述。

实施例1

一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白，其特征在于：它具有序列表1所示的氨基酸序列或其融合蛋白、或其功能性片段、或其功能性片段衍生物中的一种。本实施例的一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白(KV8F)的制备方法：采用序列表2所示序列的编码基因插入到经改造后高效表达载体pET-22b。改造的方法为利用序列表3的基因片段CAT ATG AGC AAA GGG CCG GGC TGG CCG TGA TAA GAA TTC替换pET-22b(+)中自Nde I至EcoR I基因片段。使用pf1MI与Bg1 I进行限制性酶切，电泳分离后回收ELP[KV₈F-20]基因片断，再将此基因导入到用SfiI酶切修饰后的pET-22b(+)表达载体中，构建pET-22b(+)-ELPs表达载体，经测序，表达载体构建正确。将pET-22b(+)-ELPs导入到大肠杆菌BL21(DE3)(购于上海超研生物科技有限公司)或者BLR菌株(购于上海博亚生物科技有限公司)宿主菌中，构建工程菌。阳性转化子经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导使编码基因获得低温诱导高效表达，其中高效表达步骤为：1)将甘油菌按1∶100的体积比接入到含氨苄青霉素(Amp)(100mg/L)的LB液体中培养(OD₆₀₀值为0.6-1.0，，时间为10-12h)，4℃保存，离心收集细胞。2)将细胞重悬浮于2ml的含氨苄青霉素(Amp)(100mg/L)2ml的LB液体中(以去除β-内酰胺酶)，再培养(OD₆₀₀值为0.6-1.0，，时间为10-12小时)，以此接种。按1∶100的接种量接种于TB培养基中，置于37℃摇床，以200r/min的速度，培养4-5小时。加入IPTG(终浓度为1mM)诱导7小时。之后，4℃下以4000r/min的速度，离心15分钟，按照1L菌液40mlPBS缓冲液重悬菌体。所用的PBS缓冲液须预先冰浴冷却。

高效表达后，经过超声波法破碎细胞，其步骤为：1)取出加入诱导剂IPTG诱导7小时后的锥形瓶，冰浴，使细胞停止生长，将菌液分装于100ml离心管中，配平，离心，离心条件转速4000r/min，时间15min，2)离心机停止后，取出离心管，倒出上清液，按1∶25(PBS缓冲溶液∶菌液)的比例加入PBS缓冲溶液洗涤菌体，在旋涡混合器上充分振荡，直至将离心管底的菌体冲洗干净，收集，3)用超声波破碎机进行细胞破碎，设定条件为超2s，停2s，80个循环，然后收集细胞破碎液。

然后利用高速离心法对表达的蛋白进行纯化；其步骤为：1)细胞破碎液中加入聚乙烯亚胺(终浓度为0.5％W/V)，振荡，使其充分混匀，去除核酸；2)将蛋白质溶液分装于10ml的离心管，冰浴15min，离心，其条件为4℃，14000r/min，离心时间15min；3)取出离心管，将上清液移到干净的离心管，弃沉淀，按体积比1∶2(NaCl溶液∶上清液)加入NaCl溶液，45℃恒温水浴15min，离心，条件为38℃，13500r/min，时间为5min；4)取出离心管，迅速弃上清，每管加2mlPBS缓冲溶液，沿管壁缓慢滴加，使壁上的蛋白质充分溶解，冰浴15min后离心，离心条件为4℃，14000r/min，时间为5min；5)重复步骤3)和4)一次。最终弃沉淀，收集上清，保存在-20℃冰箱中；6)透析后冷冻干燥即为本发明的能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白。

本实施例采用的TB培养基，每900ml体积的TB培养基配方为：蛋白胨12g，酵母粉24g，丙三醇8ml；将TB培养基经高压蒸汽灭菌，与经高压蒸汽灭菌后的磷酸盐缓冲液按9∶1的比例混合后使用；其中所述的磷酸盐缓冲液，每100ml体积的磷酸盐缓冲液，其配方为：磷酸氢二钾12.54g，磷酸二氢钾2.31g。所述的PBS缓冲溶液，每1000ml体积的PBS缓冲溶液配方为：NaCl 8g、KCl 0.2g、NaH₂PO₄0.66g，溶解在二次水中，调节pH为7.3。

最后获得的融合标签蛋白中的ELP对目标蛋白进行分离，使目标蛋白能发生明显的相变现象，如图1所示。

产品经高速离心后的纯度鉴定见图2及图3所示。其纯度可达99％。图2是ITC纯化前后对照，1-经2次ITC循环，2-经1次ITC循环，3-未经纯化前。图3是ITC纯化后电泳图；1-稀释10倍后加样，2-稀释5倍后加样，4-原液加样。

由于本产品能发生相变现象，同时它对要分离的其它目标蛋白的结构无明显影响。因此，将其编码基因与需要分离的目标蛋白进行融合后，表达出的融合蛋白，可通过本产品含有的ELP能发生独特的相变现象，经高速离心分离，由于目标蛋白和本产品ELP直接相连。因此，也同时随本产品ELP一起被分离出来，从而达到对目标蛋白的快速、简单的分离，而且该方法不需要借助目前常用的色谱法。

Claims

1.一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白，其特征在于：它具有序列表1所示的氨基酸序列或其融合蛋白、或其功能性片段、或其功能性片段衍生物中的一种；该氨基酸序列由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO.4185，保藏日期：2010年9月17日。

2.一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的编码基因，其特征在于：它具有序列表2所示的核苷酸序列；该核苷酸序列由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO.4185，保藏日期：2010年9月17日。

3.一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于：采用序列表2所示核苷酸序列的编码基因融合表达之后经高速离心进行分离制备该融合标签蛋白。

4.根据权利要求3所述的一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于：所述的序列表2所示的编码基因插入到经人工改造后的表达载体pET-22b，转化到大肠杆菌BL21(DE3)或者BLR菌株中，经过质粒酶切分析、PCR鉴定，筛选出阳性转化子，阳性转化子经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导使编码基因获得融合高效表达，细胞破碎后，利用高速离心对表达的蛋白进行纯化。

5.根据权利要求4所述的一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于：所述的表达载体pET-22b的人工改造包括如下步骤：1)人工合成序列表3的基因片段；2)用上述基因片段替换初始pET-22b(+)中NdeI与EcoRI酶切位点之间的序列。

6.根据权利要求4所述的一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于所述的高效表达为低温诱导表达，包括如下步骤：1)将甘油菌按1∶100的体积比接入到含100mg/L氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基液体中培养，4℃保存，离心收集细胞；2)将细胞重悬浮于2ml含100mg/L氨苄青霉素2ml的LB液体中，再培养，以此接种；按1∶100的接种量接种于TB培养基中，置于37℃摇床，以200r/min的速度，培养4-5小时；加入终浓度为1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂，诱导7小时；之后，4℃下以4000r/min的速度，离心15分钟，按照1L菌液40mlPBS缓冲液重悬菌体。

7.根据权利要求4所述的一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于所述的细胞破碎采用超声波法，包括如下步骤：1)取出加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂，诱导7小时后的锥形瓶，冰浴，使细胞停止生长，将菌液分装于100ml离心管中，使处于对称位置的离心管质量相等，离心，离心条件转速PBS缓冲溶液∶菌液4000r/min，时间15min；2)离心机停止后，取离心管，弃上清，按PBS缓冲溶液∶菌液＝1∶25的体积比加入PBS缓冲溶液洗涤菌体，在旋涡混合器上充分振荡，直至将离心管底的菌体冲洗干净，收集；3)用超声波破碎机进行细胞破碎，条件为超2s，停2s，80个循环，之后收集细胞破碎液。

8.根据权利要求4所述的一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于所述的纯化采用高速离心法纯化蛋白，包括如下步骤：1)加入终浓度为0.5％W/V聚乙烯亚胺，振荡，使其充分混匀，去除核酸；2)将蛋白质溶液分装于10ml的离心管，冰浴15min，离心，其条件为4℃，14000r/min，离心时间15min；3)取出离心管，将上清液移到干净的离心管，弃沉淀，按NaCl溶液∶上清液＝1∶2的体积比加入NaCl溶液，45℃恒温水浴15min，离心，离心条件为38℃，13500r/min，时间为5min；4)取出离心管，迅速弃上清，每管加2mlPBS缓冲溶液，沿管壁缓慢滴加，使壁上的蛋白质充分溶解，冰浴15min后离心，离心条件为4℃，14000r/min，时间为5min；5)重复步骤3)和4)一次。最终弃沉淀，收集上清，保存在-20℃冰箱中；6)透析后冷冻干燥。

9.根据权利要求6所述的一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于所述的TB培养基，每900ml体积的TB培养基配方为：蛋白胨12g，酵母粉24g，丙三醇8ml；将TB培养基经高压蒸汽灭菌，与经高压蒸汽灭菌后的磷酸盐缓冲液按9∶1的比例混合后使用；其中所述的磷酸盐缓冲液，每100ml体积的磷酸盐缓冲液，其配方为：磷酸氢二钾12.54g，磷酸二氢钾2.31g。

10.根据权利要求6或7或8所述的一种能对目标蛋白进行非色谱分离的融合标签蛋白的制备方法，其特征在于：所述的PBS缓冲溶液，每1000ml体积的PBS缓冲溶液配方为：NaCl 8g、KCl 0.2g、NaH₂PO₄0.66g，溶解在二次水中，调节pH为7.3。