JP4458850B2 - 組換え胎盤成長因子の製造方法 - Google Patents
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Description
1)タンパク質の合成がaraBADプロモーターの制御下に置かれ、その合成がアラビノースを用いて異なる大腸菌(E.Coli)株で誘導可能なpBAD発現系(In vitrogen BV)。
2)タンパク質の合成がT7ファージのRNAポリメラーゼのプロモーターによって制御され、その合成がラクトース又はその類似体(IPTG)を用いて誘導され得るT7発現系(In vitrogen BV又はPromega)。この場合、言い換えれば、ラクトース誘導プロモーターの制御下に置かれたT7ファージのRNAポリメラーゼの遺伝子のコピーを含むDE3(Bl21(DE3)又はJM109(DE3))型の大腸菌誘導体の使用が必要とされる。
3)タンパク質の合成がtrcハイブリッドプロモーターの制御下に置かれているTrc発現系(In vitrogen BV)。こうしたプロモーターは、trpプロモーター及びlacプロモーターを融解することによって得られ、ラクトース又はその類似体(IPTG)を用いて異なる大腸菌株中で誘導され得る。
4)タンパク質の合成がtacプロモーターの制御下に置かれているTac発現系(Amerham biosciences)。この系では、タンパク質合成は、ラクトース又はその類似体(IPTG)を用いて大腸菌株lacIq(JM105型)中で誘導される。
5)タンパク質の合成がPLプロモーターの制御下に置かれ、その合成がトリプトファンを加えることによって誘導され得るPL発現系。この場合、トリプトファン誘導プロモーターの制御下に置かれたλファージのcIリプレッサーをコードする遺伝子のコピーを含む大腸菌誘導体(GI724)の使用が必要とされる。
請求項に係る方法の第1段階は、前記の欧州特許(上記)に記載の菌株に相当する機能的に改変された菌株の培養である。好ましい実施形態において、微生物は、PLGFのヒト遺伝子を含む発現プラスミドで改変した大腸菌(Escherichia Coli)の誘導体である。好ましい微生物は、市販の菌株[B12(DE3)pLysS](米国Promega社)にヒトPLGF−1の遺伝子を組み込むことによって得られる[B12(DE3)pLysS PLGF−1]と呼ばれているものである。しかし、本発明は、ヒトPLGF−1因子に限定されず、動物起源(サル、マウス、ウサギなど)のものにも関連する。まして本発明は、大腸菌誘導体の使用に限定されず、遺伝子改変されやすく、封入体の形態の下で異種タンパク質を発現できる任意の原核微生物の使用を含む。
菌株中で発現された異種タンパク質は、細胞自体の中に封入体の形態で隔離される。したがって、本発明の方法では、細胞の溶解、抽出された核酸物質(DNA)の破壊並びに封入体の回収及び洗浄へと進行する。
次いで、精製したPLGF−1の封入体を含む画分を、尿素、イソチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジンなどの既知の変性剤を含む変性緩衝液に可溶化させる。変性液は、例えば8Mの変性剤濃度の尿素溶液であることが好ましい。可溶化プロセスを促進するためには、画分をホモジナイズ又は音波破砕にかけることが有効である。封入体を可溶化させた後、この溶液を同じ変性緩衝液で、280nmで測定した吸光度が約0.8(OD280 0.8)に達するまで希釈する。その後、この溶液を、さらに希釈緩衝液で、OD280が0.5に達するまで希釈する。適当な希釈液は、塩及びポリエチレングリコール(PEG)が含まれ、塩基性のpH(約8)を有する。希釈液中のPLGF−1タンパク質の再生は、溶液に適切な濃度の酸化剤/還元剤ペアを加え、続いて撹拌下で、10℃〜30℃、好ましくは20℃の温度で、10〜30時間、好ましくは18〜20時間インキュベーションすることによって達成される。こうしたペアの例には、シスチン/システイン、シスタミン/システアミン、2−ヒドロキシエチルジスルフィド/2−メルカプト−エタノールがある。酸化剤/還元剤ペアの好ましい例は、それぞれ0.1mM〜2.5mM(好ましくは0.5mM)及び0.25mM〜6.25mM(好ましくは1.25mM)の濃度における、その酸化型及び還元型のグルタチオンである。再生によって、本質的に単量体型で発現されたPLGF−1タンパク質は、部分的に二量体型に戻る(図5)。
好ましくは遠心分離及び/又はろ過によって前記ステップから得られた、主に単量体型で部分的に二量体型のタンパク質を含む溶液を、陰イオン交換樹脂上に導入して、二量体型を多く含む混合物にし、且つこの混合物から細菌混入物を取り除く。工業的プロセスに適しているかはさておき、その性能(capacity)、導入(loading)及び流速の特徴がQセファロースファストフローレジン(Amersham biosciences)のものと類似する限り、陰イオン交換クロマトグラフィーに適したいずれの市販基材も同様に使用することができる。好ましい実施形態では、高流動性樹脂(a high−flow resine)、例えばQ−セファロースファストフロー(Amersham biosciences)又は相当物を使用する。樹脂は、洗浄し、イオン強度が低い溶液で平衡化する。こうした溶液の例には、塩含有量が低い又は塩を含まないエタノールアミン−HCl pH8.5が含まれる。同じ溶液を、精製すべきタンパク質混合物の導入、吸着及び洗浄に利用することもできる。使用する樹脂には、大量のタンパク質溶液を1:1〜10:1の異なる導入容積/カラム容積の比で導入することが可能である。カラムの使用の最適化を可能にするので、ほぼ10:1のVol./Vol.比が好ましい。しかし、基材の吸着容量の飽和によって、二量体型のタンパク質が多量に失われるので、10:1よりも高い比率は避けるべきである。
前記ステップから得られた、活性型が豊富なPLGF−1タンパク質を含む画分を回収し、適切な緩衝液で希釈し、逆相クロマトグラフィーカラム上に導入して、活性型のタンパク質をさらに精製する。導入した溶液の量は、クロマトグラフ基材1ミリリットル当りOD280 4.5〜5.5に相当する。このような量は、最大量であると考えられる。
以下の手順は、1mM IPTGを用いた培養容器中での遺伝子改変した微生物(MOGM)[Bl21(DE3)pLysS PLGF−1]の培養及び誘導方法に関する。
溶液SBMは以下のものから構成される:
溶液A(1リットル当り)
バクト酵母エキス(Difco) 34g
硫酸アンモニウム 2.5g
グリセロール 100ml
H2O 十分量:900ml
溶液B(10X)(100ml当り)
KH2PO4 1.7g
KH2PO4−3H2O 20g、又は
KH2PO4 15.26g
H2O 十分量:100ml
培地:SBM+200μg/mlのアンピシリン及び10μg/mlのクロラムフェニコール
温度:37℃
溶存酸素%:30%(空気で飽和した場合)
pH:6.4〜7.4
消泡剤:水で1:10に希釈し;強く撹拌してから培地750ml当り140μlの量で加える。
誘導は、以下の実験条件下で実施する:
誘導物のOD600:16〜20
誘導剤:IPTG最終濃度1mM
溶存酸素%:10%(空気で飽和する場合)
誘導の長さ:3時間20分
以下の手順は、PLGF−1の封入体の調製及びリフォールディングに関する。リフォールディングによって、PLGF−1細菌タンパク質を部分的に二量体型に戻す。
適切な性能をもつミキサー
溶解液:1mM Mg2SO4+20mMトリス−HCl pH8+トリトンX100 1%
洗浄液:0.5%トリトンX100+10mM EDTA pH8
BD(変性緩衝液):8M 尿素、50mMトリス pH8、エチレンジアミン20mM
H2Oに溶解し、ボリュームにする。
酸化型グルタチオン200x:100mMの水溶液
還元型グルタチオン200x:250mMの水溶液
希釈緩衝液:最終濃度600μMのPEG4000(2.4g/l)、50mMトリス−HCl pH8、20mM NaCl
消泡剤:Antifoam O−10(シリコン系ではない)Sigma
PLGF−1封入体の調製。
封入体は、変性緩衝液BD(8M尿素を含む)7ml中に可溶化させ、さらにOD280が0.8になるまでBDで希釈する。続いて、0.6ボリュームの希釈緩衝液を加えて、最終尿素濃度を5Mにする。
以下の手順は、リフォールディング後のPLGF−1タンパク質の精製の第1ステップに関する。試料をカラムに導入した後、吸着していないPLGF−1単量体が大量に失われる。導入量は、カラム容積の10倍を超えないべきである。というのは、このことにより、PLGF−1二量体が著しく失われるからである。
FPLCシステム:FPLCディレクターと称されるソフトフェアによって操作されるAmersham−biosciences
モニターパラメーター
U.V.:波長=280nm;スケール上限=2
温度:20℃(最低15、最高25)
樹脂:Qセファロースファストフロー(Amersham−biosciences)
カラム容積/高さ: 容積:導入すべき試料の容積の1/10;高さ:13〜16cm
平衡化:緩衝液B 2カラム容積(CV)、次いで緩衝液A 1.5CV
試料:再生、遠心分離及び/又はろ過したPLGF−1。その10CV以下を導入する。
緩衝液A:20mMエタノールアミン−HCl pH8.5
緩衝液B:緩衝液A+1M NaCl
注入速度:1cm/分(小型カラムで試験した最高速度=1.887cm/分;試験した最低速度=0.5cm/分)
溶出速度:1cm/分(小型カラムで試験した最高速度=1.887cm/分;試験した最低速度=0.5cm/分)
注入後の洗浄:緩衝液Bを0%含む1.5CV
回収したピーク:緩衝液B 20%の定組成条件で約3CV流して溶出したピーク。
最終洗浄:100%Bで2CV
緩衝液B 20%の定組成条件下で溶出したピークを回収し、次いでそこに0.271容量の水、0.0045容量のTFA及び0.225容量のエタノールを加える。このように、試料は、1.5倍に希釈され、エタノール15%及びTFA 0.3%を含むことになる。これら2種類の物質を追加することにより、逆相樹脂へのPLGF−1の結合が容易になる(実施例5参照のこと)。
以下の手順は、平均粒径が15ミクロン又は30ミクロンのRPソース樹脂を用いて行うことができる。しかし、30ミクロンのRPソース樹脂は、精製プロセスの任意の改変を伴わずに、樹脂自体の経済的な節約(約50%)を可能にし、カラムの充填手順をより容易にし、背圧をより低くする。
材料及びパラメーター:
FPLCシステム:FPLCディレクターと称されるソフトフェアによって操作されるAmersham−biosciences
モニターパラメーター
U.V.:波長=280nm;フルスケール=0.05
温度:20℃(最低15、最高25)
樹脂:逆相ソース30(Amersham−biosciences)
樹脂容積/高さ: 容積:導入すべき試料の全OD280の1/5〜1/6;高さ:27〜33cm
平衡化:緩衝液Bを2カラム容積(CV)、次いで緩衝液Aを2CV
試料:前記ステップ(実施例4)で得られたPLGF−1。1.5倍に希釈され、エタノール15%及びTFA 0.3%を含む。導入の最大値は、樹脂1ml当り4.5〜5.5 OD280。
緩衝液A:エタノール40%+TFA0.1%
緩衝液B:エタノール70%+TFA0.1%
注入速度:1.887cm/分
溶出速度:1.887cm/分
注入後の洗浄:4%緩衝液B 1.5CV
単量体ピーク:12CVにおいてBの勾配が4〜40%(3%B/CV)。このピークの溶出を開始した直後、OD280がフルスケールの25%に達することにより、その瞬間に達した緩衝液Bの濃度の定組成条件で、ピーク溶出が完了するまで溶出を続ける(約2.5〜3.5CV)。
「単量体」ピークに相当する適当な量の溶液を取り、それを濃縮して検査する(図5のmon)。
材料及びパラメーター:
カラムを再度平衡化しないが、UVモニターのスケール範囲を値2に単にシフトさせることによって、勾配が10〜100%の緩衝液Bを2.2CV(40.9%B/CV)で流す。
「二量体」ピークに相当する画分を取る。図4はその例を示す。それらを回収し、その容積及び280nmにおける吸光度を測定する。
Claims (27)
- 改変した原核細胞の誘導的発現系で発現させることによって、単量体型が1.5%以下となる、2量体型及び多量体型の組換え胎盤成長因子(PLGF)を抽出及び精製する方法であって、
I)前記原核細胞を培養し、II)封入体を抽出、精製し、III)前記発現されたタンパク質を再生し、IV)イオン交換クロマトグラフィーを行ない、V)逆相クロマトグラフィーを行う、ステップを含み、
ステップ(I)を、600nmにおける培地の吸光度が14〜50(OD600 14〜50)となるまで、1種又は複数の選択薬剤、酵母エキス、グリセロール及びアンモニウム塩を含む培地中で行った後、誘導を行い、
ステップ(II)は、前記培養細胞を溶解し、DNAを破壊し、前記封入体を単離することを含み、
ステップ(III)では、前記封入体を変性緩衝液中で可溶化し、前記発現されたタンパク質を少なくとも部分的に二量体型に戻し、
ステップ(IV)では、陰イオン交換クロマトグラフィーにより、前記発現された前記二量体型及び多量体型のタンパク質を単量体型から分離し、
ステップ(V)では、定組成条件下の溶出段階を間に挟む、有機溶媒の勾配が増大する、2つの連続する溶出段階を有する逆相クロマトグラフィーにより、前記発現されたタンパク質の前記二量体型及び多量体型を前記単量体型から更に分離し、最終的に単離することを特徴とする、2量体型及び多量体型の組換え胎盤成長因子(PLGF)を抽出及び精製する方法。 - 前記胎盤成長因子(PLGF)が、ヒトPLGF−1又は動物起源であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記原核細胞が、細菌細胞であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- ステップIが、前記培養ステップで高い細菌密度を得ることを可能にし、且つ動物又はヒト起源の物質を含まない培地中で行われることを特徴とする、請求項1から3までのいずれかに記載の方法。
- 前記誘導的発現系が、発現系T7であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記細菌細胞が、大腸菌(E.Coli)由来の菌株であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記菌株が、大腸菌(E.Coli){Bl21(DE3)pLysS}であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記発現が、ラクトース、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)又は機能的に同等の類似体によって誘導されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 誘導時における培養物の前記吸光度が、600nmにおいて14〜30 OD(14〜30 OD600)、好ましくは16〜20(16〜20 OD600)であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ステップIが、予備的なステップである前接種を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ステップIIにおいて、前記細胞溶解が凍結/解凍、フレンチプレス又は他の同等の技術によって行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ステップIIにおいて、前記DNA破壊が、抽出若しくは組換え起源のDNAse、好ましくはベンゾナーゼを用いて、又は化学的、機械的作用によって行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ステップIIにおいて、前記DNA破壊がミキサーを用いて行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ステップIIにおいて、遠心分離及び適当な緩衝液への洗浄を少なくとも2サイクル行うことによって前記封入体が単離されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ステップIIIにおいて、前記封入体が、尿素、イソチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン又は任意の他の変性剤を含む変性緩衝液に可溶化され、任意選択でホモジナイズ又は音波破砕されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ステップIIIにおいて、前記封入体の可溶化後、溶液を希釈し、前記溶液に酸化/還元剤を加え、撹拌下で、10℃〜30℃、好ましくは20℃の温度で、10〜30時間、好ましくは18〜20時間インキュベートすることによって前記タンパク質物質を再生させることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記溶液を、280nmにおける吸光度(OD280)0.01〜2、好ましくは0.5が得られるまで希釈し、且つ前記酸化/還元剤が、二量体型の形成を最大にするような割合及び濃度の還元及び酸化グルタチオンであることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- ステップIVにおいて、前のステップから得られた前記溶液を、1:1〜10:1の導入容積/カラム容積の比で陰イオン交換カラムに導入することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記導入容積/カラム容積の比が10:1であることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 前記タンパク質を、エタノールアミン−HCl、NaCl緩衝液で溶出し、前記単量体型のタンパク質が樹脂と結合しない物質を含む画分に主に含まれ、その一方前記二量体型のタンパク質が150〜250mMのNaCl濃度で溶出した後続の画分中に本質的に含まれることを特徴とする、請求項18又は19に記載の方法。
- ステップVにおいて、前のステップで150〜250mMのNaCl濃度で抽出された溶液を希釈し、樹脂1ml当り280nmにおける吸光度4.5〜5.5 ODに相当する量で逆相クロマトグラフィーカラムに導入することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記第1の溶出段階を、前記単量体型の溶出ピークが現れるまで、有機溶媒の勾配が増大する条件下で行い、前記単量体型の溶出ピークが無くなるまで、定組成条件下で行い、
前記第2の段階を、有機溶媒の勾配が増大する条件下で、主に二量体型の前記タンパク質の完全な溶出が達成されるまで行うことを特徴とする、請求項1又は21に記載の方法。 - 前記溶出緩衝液が、エタノール、メタノール又はアセトニトリルを含むことを特徴とする、請求項21及び22のいずれかに記載の方法。
- 前記溶出緩衝液が、割合を徐々に増加させたエタノールを含む水性アルコール溶液であることを特徴とする、請求項21から23までのいずれかに記載の方法。
- 前記逆相クロマトグラフィーが、基材直径が30ミクロンの粒子を有する樹脂で行われることを特徴とする、請求項21から24までのいずれかに記載の方法。
- 追加の限外ろ過ステップと、それに続く適切な添加剤の存在下又は不在下での凍結乾燥を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から25までのいずれかに記載の方法によって、原核宿主細胞中の発現で得られ得る活性型の胎盤成長因子であって、
前記宿主菌株の混合物を含まず、前記単量体型が1.5%以下であり、本質的に二量体型及び多量体型であることを特徴とする、活性型の胎盤成長因子。
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