CN115873095A - 一种重组人骨形态发生蛋白-2二聚体的提纯方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人骨形态发生蛋白‑2二聚体的提纯方法。所述提纯方法包括如下步骤：S1、将变性后的重组人骨形态发生蛋白‑2包涵体进行亲和捕获，然后采用复性液进行柱上线性梯度复性；S2、采用含有精氨酸的缓冲液洗脱S1处理后的亲和层析柱，洗脱得到的蛋白液滴入至孵育缓冲液中进行孵育，得到蛋白混合液；S3、将蛋白混合液进行阳离子层析，采用含有不同浓度精氨酸的缓冲液分别冲洗阳离子层析柱即得到所述重组人骨形态发生蛋白‑2二聚体。利用本发明方法对重组人骨形态发生蛋白‑2二聚体进行提纯，工艺衔接合理，生产周期短，所得蛋白收率高、成本低廉，工艺稳定，非常适用于大规模商业化生产；同时该纯化工艺也为同类重组蛋白药物的研发生产提供参考。

Description

一种重组人骨形态发生蛋白-2二聚体的提纯方法

技术领域

本发明涉及一种重组人骨形态发生蛋白-2二聚体的提纯方法，属于生物工程领域。

背景技术

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)又称骨形成蛋白，是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白，属于TGF-β家族。BMP能刺激DNA的合成和细胞的复制，从而促进间充质细胞定向分化为成骨细胞。它还是体内诱导骨和软骨形成的主要因子，并在肢体生长、软骨内骨化、骨折早期、软骨修复时表达，对骨骼的胚胎发育和再生修复起重要作用。

BMP家族包括BMP-1、2、4、6、7、9、12、14等，其中BMP-2具有明显诱导未分化成纤维细胞定向分化为成骨细胞的作用，并能调节成骨细胞和成软骨细胞的分化，诱导异位骨形成和促进骨折愈合的功能。BMP-2是骨生成的启动因子，可以加速骨的重建，是骨修复基因治疗的理想目的基因，是目前唯一能诱导异位成骨的细胞因子，因而成为骨组织工程学研究中最重要的生长因子。BMP-2在体内以前体形式合成，经蛋白酶切去除信号肽和前肽，得到由114个氨基酸残基组成成熟肽.成熟肽通过7对二硫键将其保守结构正确折叠。成熟肽同源或异源二聚体才具有生物活性。目前，BMP-2已成功地用于治疗骨不连和骨缺损的修复，BMP-2工业化生产有助于造福社会。

BMP-2可以通过天然骨提取纯化和基因重组诱导表达后分离纯化两种方法制备。其中天然提取法成本高，产率低，易失活，不适于工业化生产，逐渐被基因重组法代替。大肠杆菌表达系统凭借技术成熟、表达量高、成本低等优点，成为目前基因重组法生产BMP-2的一个热点技术。然而，经大肠杆菌表达的重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)以无活性的包涵体形式存在于胞内，从包涵体中提取获得具有生物活性的rhBMP-2二聚体是重组蛋白药物研发生产中的关键。

常见的rhBMP-2提纯方法步骤较多、流程复杂，只适用于实验室小规模生产，无法实现工业化。其中复性工艺研究如：国外科学家Vallejo的稀释复性、国内陈苏民的透析法复性，都需要大规模复性液，操作复杂，复性周期长，无法实现规模化生产。纯化工艺研究如徐放的离子交换和疏水层析纯化工艺，刘国安的两步离子交换工艺，存在回收率低，费用昂贵，纯度差等问题。

综上，目前的rhBMP-2提纯工艺存在着蛋白收率低、工艺路线繁琐、生产周期长、物料消耗大、成本高等问题，并不适于大规模生产。大规模生产rhBMP-2以使其广泛用于临床是目前研究难点。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组人骨形态发生蛋白-2二聚体(rhBMP-2)的提纯方法，所得蛋白收率高、成本低廉，工艺稳定，非常适用于大规模商业化生产。

本发明提供的重组人骨形态发生蛋白-2二聚体的提纯方法，包括如下步骤：

S1、将变性后的重组人骨形态发生蛋白-2包涵体进行亲和捕获，然后采用复性液进行柱上线性梯度复性；

S2、采用含有精氨酸的缓冲液洗脱步骤S1处理后的亲和层析柱，洗脱得到的蛋白液滴入至孵育缓冲液中进行孵育，得到蛋白混合液；

S3、将所述蛋白混合液进行阳离子层析，采用含有不同浓度精氨酸的缓冲液分别冲洗所述阳离子层析柱，得到所述重组人骨形态发生蛋白-2二聚体。

上述的提纯方法中，步骤S1中，采用变性溶解液对所述重组人骨形态发生蛋白-2包涵体进行变性；

所述变性溶解液由终浓度为50mmol/L的Tris-HCl、终浓度为8mol/L的尿素、终浓度为100mmol/L的DTT、终浓度为5mmol/L的EDTA和水组成，pH范围为7.2～9.0；

所述变性的条件为：温度为18～26℃，100转/分钟搅拌10～12小时。

上述的提纯方法中，步骤S1中，所述线性梯度复性的条件如下：

层析平衡液由终浓度为40～60mmol/L的Tris-HCl、终浓度为4～8mol/L的尿素和水组成，pH范围为7.0～8.7；

层析复性液由终浓度为40～60mmol/L的Tris-HCl、终浓度为50mmol/L的尿素、终浓度为100mmol/L的2-环己氨基乙磺酸、终浓度为200mmol/L的精氨酸、终浓度为0.5mmol/L的氧化型谷胱甘肽、终浓度为1mmol/L的还原型谷胱甘肽和水组成，pH范围为7.2～9.0；

复性的时间为10～24h，所述层析复性液的比例由0％线性梯度直到100％，同时所述层析平衡液的比例由100％到0％；

所述层析复性液的流速为1-2mL/min；

采用的亲和层析柱的柱床体积可为60mL，柱内径可为27mm、填充介质可为肝素琼脂糖(Heparin Sepharose)。

上述的提纯方法中，步骤S2中，所述缓冲液由终浓度为50mmol/L的Tris-HCl、终浓度为2mol/L的尿素、终浓度为800mmol/L的精氨酸和水组成，pH范围为7.0～8.7；

所述孵育缓冲液由终浓度为50mmol/L的醋酸钠/醋酸或50mmol/L柠檬酸钠/柠檬酸、终浓度为2mol/L的尿素、终浓度为50mmol/L的精氨酸和水组成，pH范围为3.4～6.6。

上述的提纯方法中，步骤S2中，所述蛋白液的收集范围为从紫外吸收峰UV280下的强度升至50mAu时开始，降至50mAu时结束；

所述洗脱的时间为10～30分钟；

所述缓冲液的流速为10±5mL/min；

所述孵育条件：50～60转/分钟下进行120～720min；

所述孵育缓冲液的加入量为洗脱体积的8～10倍体积。

上述的提纯方法中，步骤S3中，所述阳离子层析的步骤如下：

采用冲洗缓冲液洗涤阳离子层析柱，以去除重组人骨形态发生蛋白-2单体；

采用洗脱缓冲液洗脱所述阳离子层析柱，收集洗脱液，得到所述重组人骨形态发生蛋白-2二聚体；

所述层析柱柱床的体积可为62mL、柱内径可为27mm、层析介质可为SP Sepharose。

上述的提纯方法中，步骤S3中，所述冲洗缓冲液由终浓度为50mmol/L的醋酸钠/醋酸或50mmol/L的柠檬酸钠/柠檬酸、终浓度为2mol/L的尿素、终浓度为300～550mmol/L的精氨酸和水组成，pH范围为3.4～6.6；

所述洗脱缓冲液由终浓度为50mmol/L的醋酸钠/醋酸、终浓度为2mol/L的尿素、终浓度为600～900mmol/L的精氨酸和水组成，pH范围为3.4～6.6。

上述的提纯方法中，所述冲洗的时间为12～40分钟；

所述洗脱的时间为12～40分钟；

所述洗脱缓冲液和所述冲洗缓冲液的流速为10±5mL/min。

上述的提纯方法中，步骤S3中，所述洗脱液的收集范围为紫外吸收峰UV280下的强度升至50mAu开始，升降至50mAu结束收集。

与现有方法相比，本发明方法具有如下有益效果：

1、采用柱上复性工艺，与通常的稀释和透析复性的方法比较，消除了蛋白聚集和沉淀的产生，省去了过滤环节，便于变性剂回收，具有处理体积小、复性时间短，蛋白质浓度大、复性率高等优越性；

2、柱上复性可以同时实现复性和初步提纯的目的，将两步工艺并做一步，减少设备投资，操作简单，节约成本，有效缩短生产周期；

3、采用柱上线性梯度复性，与其他柱上复性相比，复性液浓度缓慢升高，使蛋白折叠速度缓慢，有利于蛋白形成天然构象，提高蛋白质量。

4、亲和层析采用精氨酸洗脱的方式进行，因为精氨酸具有防止蛋白聚集的作用，其可与负电荷残基和疏水键形成盐桥来抑制蛋白质分子间的聚集，增加折叠中间体的溶解性，精氨酸洗脱大大降低了重组人骨形态发生蛋白-2多聚体的形成。

5、亲和层析后即进入孵育阶段，将洗脱液直接滴入更适宜生成重组人骨形态发生蛋白-2二聚体的缓冲体系中，作用条件温和，适当的孵育条件可以促进折叠自然生成热力学稳定状态的二聚体。孵育后的样品无需再进行其他处理就可以进入下一步层析阶段，省去样品处理环节，节约工作时间，提高生产效率。

6、阳离子层析采用精氨酸洗脱的方式，相比氯化钠洗脱，洗脱蛋白纯度高，蛋白状态稳定，经过此步层析后重组人骨形态发生蛋白-2二聚体纯度可以达到95％以上，收率达到30％以上。

7、仅用两步纯化就可以获得纯度较高的重组人骨形态发生蛋白-2二聚体，与其他工艺相比工艺比较稳健，生产周期短，纯化效率高，适用于大规模工业化生产。

总之，利用本发明方法对重组人骨形态发生蛋白-2二聚体进行提纯，工艺衔接合理，生产周期短，所得蛋白收率高、成本低廉，工艺稳定，非常适用于大规模商业化生产；同时该纯化工艺也为同类重组蛋白药物的研发生产提供参考。

附图说明

图1为亲和层析图谱，P1为复性后的重组人骨形态发生蛋白-2单体蛋白峰。

图2为阳离子层析上样蛋白纯度检测图谱，从左至右依次为P1重组人骨形态发生蛋白-2多聚体、P2为重组人骨形态发生蛋白-2二聚体、P3为目的蛋白重组人骨形态发生蛋白-2单体。

图3为阳离子层析图谱，从左至右依次为P1重组人骨形态发生蛋白-2单体、P2为重组人骨形态发生蛋白-2二聚体、P3为目的蛋白重组人骨形态发生蛋白-2多聚体。

图4为阳离子层析洗脱蛋白二聚体纯度检测图谱，纯度检测结果显示为95％。

图5为本发明实施例1得到的样品与对照品对比均具有显著的碱性磷酸酶活性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中采用的重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)包涵体按照中国专利申请(200510132792.9)公开的方法得到：将重组菌BL21/pET-28a-BMP2-h在LB培养基中37℃培养至OD600值达到0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，相同条件下诱导培养4h。培养结束后，离心收集菌体，即为BL21/pET-28a-BMP2-h包涵体，15％SDS-PAGE电泳检测，大小为13.4KD。

实施例1、重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的精氨酸提纯(柱上梯度浓度复性)

一、rhBMP-2包涵体变性

包涵体溶解液：50mmol/L Tris-HCl，8mol/L尿素，100mmol/L DTT，5mmol/LEDTA，pH7.8。各浓度为相应组分在溶解液中的终浓度，溶剂为水。

变性：以1克重组人骨形态发生蛋白-2包涵体：10mL包涵体溶解液的比例将包涵体溶解，于25℃、100转/分钟搅拌12小时变性后，用0.45nm膜过滤，收集上清液即为变性rhBMP-2蛋白溶液。

二、变性后rhBMP-2亲和层析

亲和层析采用Cytiva公司纯化仪。

亲和层析柱装填规格：柱床体积60mL，柱内径27mm。

层析介质：Heparin Sepharose(Cytiva公司)。

平衡缓冲液M-A：50mmol/L Tris-HCl、8mol/L尿素，pH7.8。

复性缓冲液F-A：50mmol/L Tris-HCl、2mol/L尿素、100mmol/L 2-环己氨基乙磺酸、200mmol/L精氨酸、1mmol/L还原型谷胱甘肽，pH7.8。

洗脱缓冲液M-B：50mmol/L Tris-HCl、2mol/L尿素、1mol/L精氨酸，pH7.8。

孵育缓冲液M-C：50mmol/L柠檬酸钠/柠檬酸、2mol/L尿素、50mmol/L精氨酸，pH4.0。

具体操作如下：

(1)平衡：平衡缓冲液连接A泵，用M-A以10mL/min的流速平衡层析柱，平衡至流出液的基线平稳。

(2)上样：将步骤一得到的变性rhBMP-2上样到(1)处理后的柱上，用A泵以10mL/min的流速上样100mL。

(3)平衡：平衡缓冲液连接A泵，用M-A以10mL/min的流速平衡(2)处理后的层析柱，平衡至流出液的基线平稳。

(4)柱上复性：平衡缓冲液连接A泵，复性缓冲液连接B泵，控制B泵比例由0％到100％，以1mL/min的流速冲洗20个小时。

(5)洗脱：

洗脱缓冲液连接B泵，用M-B以10mL/min的流速冲洗复性后的层析柱，紫外吸收峰UV280升至50mAu时开始收集，待检测峰回落至50mAu时结束收集，洗脱时间为20分钟，洗脱体积约为48mL，洗脱液样品经HPLC检测，此步洗脱样品多以rhBMP-2单体的形式存在，含量约为60％。

图1为亲和层析图谱，图中P1为复性后的重组人骨形态发生蛋白-2单体蛋白峰。

(6)孵育：

洗脱时，洗脱样品直接滴入440mL孵育液M-C中，在温度条件18-26℃下，50转/分，孵育720min，温和的孵育条件使rhBMP-2单体结合成为rhBMP-2二聚体。

三、rhBMP-2阳离子层析

阳离子层析采用Cytiva公司纯化仪。

阳离子层析柱装填规格：柱床体积62mL，柱内径27mm。

层析介质：SP Sepharose(Cytiva公司)。

平衡缓冲液M-C：50mmol/L柠檬酸钠/柠檬酸、2mol/L尿素、50mmol/L精氨酸，pH4.0。

冲洗缓冲液Y-B：50mmol/L柠檬酸钠/柠檬酸、2mol/L尿素、400mmol/L精氨酸，pH4.0。

洗脱缓冲液Y-C：50mmol/L柠檬酸钠/柠檬酸、2mol/L尿素、800mmol/L精氨酸，pH4.0。

具体操作如下：

(1)平衡：用平衡缓冲液M-C以10mL/min的流速平衡层析柱，平衡至流出液的基线平稳。

(2)上样：将孵育后得到的样品以10mL/min的流速上样到(1)处理后的层析柱上，上样量为488mL。

图2为阳离子层析上样蛋白纯度检测图谱，从左至右依次为P1重组人骨形态发生蛋白-2多聚体、P2为重组人骨形态发生蛋白-2二聚体、P3为目的蛋白重组人骨形态发生蛋白-2单体。

(3)平衡：用平衡缓冲液M-C以10mL/min的流速平衡经过(2)处理后的层析柱，平衡至流出液的基线平稳。

(4)rhBMP-2单体蛋白的去除

用阳离子冲洗缓冲液Y-B以10mL/min的流速冲洗层析柱3个柱体积，以去除rhBMP-2单体蛋白。

(5)rhBMP-2二聚体的洗脱

用阳离子洗脱缓冲液Y-C以10mL/min的流速洗脱层析柱，紫外吸收峰UV280升至50mAu时开始收集，待检测峰回落至50mAu时结束收集，洗脱时间为30分钟，洗脱体积为75mL，此步洗脱蛋白即为rhBMP-2二聚体(图3中的P2)。

四、纯化收率的计算

将通过上述一-三的步骤进行纯化的包涵体进行如下检测：

阳离子层析后二聚体纯度通过HPLC检测分析，结果如图4所示，纯度为95％。

亲和层析复性后和阳离子层析后蛋白浓度可通过紫外分光光度法测得，两者分别为2.45mg/L和0.77mg/mL；两者的蛋白样品体积为48mL和75mL，复性前包涵体蛋白浓度通过紫外分光光度法测得为1.9mg/mL，待复性包涵体样品体积100mL。

总复性率＝阳离子层析洗脱蛋白量/复性前包涵体蛋白量；

阳离子层析洗脱蛋白量＝阳离子洗脱蛋白浓度×阳离子洗脱样品体积；

复性前包涵体蛋白量＝复性前包涵体蛋白浓度×待复性包涵体样品体积；

通过上述公式计算得到本工艺总收率达30.4％。

五、蛋白活性检测

用C2C12细胞法检测蛋白活性，rhBMP-2及对照品BMP-2作用于C2C12细胞72小时后，检测碱性磷酸酶活性，两者显色明显，都具有显著的碱性磷酸酶活性。其中，rhBMP-2半效稀释倍数为8.577，对照品BMP-2半效稀释倍数7.398，即rhBMP-2活性是对照品活性的115％(图5)。

对比例1、重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的氯化钠提纯(柱上梯度浓度复性)

在进行重组人骨形态发生蛋白-2的提纯过程中，除了将亲和层析和阳离子层析步骤中的精氨酸换成氯化钠外，其他均采用与实施例1相同步骤和条件进行rhBMP-2的提纯，其中，亲和层析过程中，洗脱缓冲液的组成为50mmol/L Tris-HCl、2mol/L尿素、1mol/L氯化钠，pH7.8；阳离子层析过程中，冲洗缓冲液的组成为：50mmol/L柠檬酸钠/柠檬酸、2mol/L尿素、200mmol/L氯化钠，pH4.0；洗脱缓冲液的组成为：50mmol/L柠檬酸钠/柠檬酸、2mol/L尿素、400mmol/L氯化钠，pH4.0。

本对比例得到rhBMP-2二聚体的收率为13％，远远低于精氨酸洗脱的收率，纯度为89％，纯度较低，且操作复杂，不适合大规模工业生产。

对比例2、重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的精氨酸提纯(柱上固定浓度复性)

一、rhBMP-2包涵体变性

同实施例1。

二、变性后rhBMP-2亲和层析

基本同实施例1，不同之处为：

(5)洗脱：

洗脱缓冲液连接B泵，控制B泵比例为100％，用M-B以10mL/min的流速冲洗复性后的层析柱，紫外吸收峰UV280升至50mAu时开始收集，待检测峰回落至50mAu时结束收集，洗脱时间为20分钟，洗脱体积约为41mL，洗脱液样品经HPLC检测，此步洗脱样品多以rhBMP-2单体的形式存在，含量约为46％。

(6)孵育：

洗脱时，洗脱样品直接滴入369mL孵育液M-C中，在温度条件18-26℃下，50转/分，孵育720min，温和的孵育条件使rhBMP-2单体结合成为rhBMP-2二聚体。

三、rhBMP-2阳离子层析

基本同实施例1，不同之处为：步骤(2)中上样量为410mL；步骤(5)中洗脱体积为62mL。

本对比例得到rhBMP-2二聚体的收率为19％，低于本发明方法的收率。

Claims (10)

1.一种重组人骨形态发生蛋白-2二聚体的提纯方法，包括如下步骤：

S1、将变性后的重组人骨形态发生蛋白-2包涵体进行亲和捕获，然后采用复性液进行柱上线性梯度复性；

S2、采用含有精氨酸的缓冲液洗脱步骤S1处理后的亲和层析柱，洗脱得到的蛋白液滴入至孵育缓冲液中进行孵育，得到蛋白混合液；

S3、将所述蛋白混合液进行阳离子层析，采用含有不同浓度精氨酸的缓冲液分别冲洗所述阳离子层析柱，得到所述重组人骨形态发生蛋白-2二聚体。

2.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于：步骤S1中，采用变性溶解液对所述重组人骨形态发生蛋白-2包涵体进行变性；

所述变性溶解液由终浓度为50mmol/L的Tris-HCl、终浓度为8mol/L的尿素、终浓度为100mmol/L的DTT、终浓度为5mmol/L的EDTA和水组成，pH范围为7.2～9.0；

所述变性的条件为：温度为18～26℃，100转/分钟搅拌10～12小时。

3.根据权利要求1或2所述的提纯方法，其特征在于：步骤S1中，所述线性梯度复性的条件如下：

层析平衡液由终浓度为40～60mmol/L的Tris-HCl、终浓度为4～8mol/L的尿素和水组成，pH范围为7.0～8.7；

层析复性液由终浓度为40～60mmol/L的Tris-HCl、终浓度为50mmol/L的尿素、终浓度为100mmol/L的2-环己氨基乙磺酸、终浓度为200mmol/L的精氨酸、终浓度为0.5mmol/L的氧化型谷胱甘肽、终浓度为1mmol/L的还原型谷胱甘肽和水组成，pH范围为7.2～9.0；

复性的时间为10～24h，所述层析复性液的比例由0％线性梯度直到100％，同时所述层析平衡液的比例由100％到0％；

所述层析复性液的流速为0.8-1.2mL/min。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的提纯方法，其特征在于：步骤S2中，所述缓冲液由终浓度为50mmol/L的Tris-HCl、终浓度为2mol/L的尿素、终浓度为800mmol/L的精氨酸和水组成，pH范围为7.0～8.7；

所述孵育缓冲液由终浓度为50mmol/L的醋酸钠/醋酸或50mmol/L柠檬酸钠/柠檬酸、终浓度为2mol/L的尿素、终浓度为50mmol/L的精氨酸和水组成，pH范围为3.4～6.6。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的提纯方法，其特征在于：步骤S2中，所述蛋白液的收集范围为从紫外吸收峰UV280下的强度升至50mAu时开始，降至50mAu时结束；

所述洗脱的时间为10～30分钟；

所述缓冲液的流速为10±5mL/min；

所述孵育条件：40～60转/分钟下进行120～720min；

所述孵育缓冲液的加入量为洗脱体积的8～10倍体积。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的提纯方法，其特征在于：步骤S3中，所述阳离子层析的步骤如下：

采用冲洗缓冲液洗涤阳离子层析柱，以去除重组人骨形态发生蛋白-2单体；

采用洗脱缓冲液洗脱所述阳离子层析柱，收集洗脱液，得到所述重组人骨形态发生蛋白-2二聚体。

7.根据权利要求6所述的提纯方法，其特征在于：步骤S3中，所述冲洗缓冲液由终浓度为50mmol/L的醋酸钠/醋酸或50mmol/L的柠檬酸钠/柠檬酸、终浓度为2mol/L的尿素、终浓度为300～550mmol/L的精氨酸和水组成，pH范围为3.4～6.6；

所述洗脱缓冲液由终浓度为50mmol/L的醋酸钠/醋酸、终浓度为2mol/L的尿素、终浓度为600～900mmol/L的精氨酸和水组成，pH范围为3.4～6.6。

8.根据权利要求7所述的提纯方法，其特征在于：所述冲洗的时间为12～40分钟；

所述洗脱的时间为12～40分钟；

所述洗脱缓冲液和所述冲洗缓冲液的流速为10±5mL/min。

9.根据权利要求8所述的提纯方法，其特征在于：步骤S3中，所述洗脱液的收集范围为紫外吸收峰UV280下的强度升至50mAu开始，升降至50mAu结束收集。

10.权利要求1-9中任一项所述方法得到的重组人骨形态发生蛋白-2二聚体。

Images