CN104447977B - 一种重组人骨形态发生蛋白‑2的纯化生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人骨形态发生蛋白‑2的纯化生产方法。该方法包括如下步骤：1）裂解含有rhBMP‑2蛋白的包涵体，得到包涵体裂解液；2）对所述包涵体裂解液依次进行亲和层析和阳离子交换层析，分离纯化得到变性重组人骨形态发生蛋白‑2溶液；3）对所述变性rhBMP‑2蛋白进行复性，得到复性rhBMP‑2蛋白粗品；4）对所述复性rhBMP‑2蛋白粗品依次进行亲和层析和凝胶过滤层析分离纯化，得到复性rhBMP‑2蛋白纯品。利用本发明所提供的方法纯化rhBMP‑2蛋白，制备的产品纯度达95%以上，蛋白收率为9.4%，内毒素和DNA残留均符合生物药物质量要求，本发明方法适于工业规模化生产；同时也为同类重组蛋白药物的研发生产提供参考。

Description

一种重组人骨形态发生蛋白-2的纯化生产方法

技术领域

本发明属于蛋白纯化领域，涉及一种重组人骨形态发生蛋白-2的纯化生产方法。

背景技术

骨形态发生蛋白（BMP）是由骨基质分泌的一种疏水性蛋白，属于转化生长因子（TGF-β）超家族成员，由等Urist等人于1965年首次提出，1972年定义，并于1982年首次从脱钙骨基质提取物中分离得到的一种活性蛋白质。BMP家族包括BMP-1、2、4、6、7、9、12、14等，其中BMP-2具有明显诱导未分化成纤维细胞定向分化为成骨细胞的作用，并能调节成骨细胞和成软骨细胞的分化，诱导异位骨形成和促进骨折愈合的功能。BMP-2是骨生成的启动因子，可以加速骨的重建，是骨修复基因治疗的理想目的基因，是目前唯一能诱导异位成骨的细胞因子，因而成为骨组织工程学研究中最重要的生长因子。目前，BMP-2已成功地用于治疗骨不连和骨缺损的修复。BMP一般无种属特异性，具有跨种属诱导成骨能力，因而其临床应用前景十分广阔。

BMP-2可以通过天然牛骨提取纯化和基因重组诱导表达后分离纯化两种方法制备。其中天然提取法成本高，产率低，易失活，不适于工业化生产，逐渐被基因重组法代替。大肠杆菌表达系统凭借技术成熟、表达量高、成本低等优点，成为目前基因重组法生产BMP-2的一个热点技术。然而，经大肠杆菌表达的BMP-2以无活性的包涵体形式存在于胞内，如何将包涵体通过复性得到具有生物活性的BMP-2二聚体，是重组蛋白药物研发生产中的关键步骤。

国内研究者孙奋勇等于2004年进行了重组BMP-2复性工艺研究；姚少华等也于2005年研究了用羟基磷灰石纯化及复性工艺；2006年徐放研究了离子交换和疏水层析的纯化工艺；2007年刘国安等研究了两步离子交换层析纯化工艺。以上生产工艺均存在复性率低、蛋白易沉淀收率低下等问题，并不适于工业规模化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组人骨形态发生蛋白-2的纯化生产方法。

本发明所提供的重组人骨形态发生蛋白-2的纯化生产方法，是在经原核表达得到含有重组人骨形态发生蛋白-2的包涵体的基础上完成的，具体而言，可包括如下步骤：

1）裂解含有重组人骨形态发生蛋白-2的包涵体，得到包涵体裂解液；

2）按照如下a1）和a2）的步骤对所述包涵体裂解液进行分离纯化，得到变性重组人骨形态发生蛋白-2溶液：

a1）将步骤1）中得到的包涵体裂解液进行亲和层析，收集洗脱峰；

所述亲和层析中所采用的配基为肝素，所采用的洗脱程序为NaCl一步洗脱；所述收集洗脱峰为收集进行所述NaCl一步洗脱过程中所产生的洗脱峰；

a2）将从步骤a1）中收集的洗脱峰进行阳离子交换层析，收集洗脱峰，即为所述变性重组人骨形态发生蛋白-2溶液；

所述阳离子交换层析中所采用的阳离子交换基团是SP（Sulphopropy，磺丙基），为强阳离子交换基团，所采用的洗脱程序为NaCl一步洗脱；所述收集洗脱峰为收集进行所述NaCl一步洗脱过程中所产生的洗脱峰；

3）对步骤2）中得到的变性重组人骨形态发生蛋白-2溶液进行复性，得到复性重组人骨形态发生蛋白-2粗品溶液；

4）按照如下b1）和b2）的步骤，对步骤3）中得到的复性重组人骨形态发生蛋白-2粗品溶液进行分离纯化，得到复性重组人骨形态发生蛋白-2纯品溶液，从中可得到纯化后的复性重组人骨形态发生蛋白-2纯品：

b1）将步骤3）中得到的复性重组人骨形态发生蛋白-2粗品溶液进行亲和层析，收集洗脱峰；

所述亲和层析中所采用的配基为肝素，所采用的洗脱程序为NaCl线性洗脱；所述洗脱峰为NaCl在洗脱液中的浓度线性增至0.45M时开始起峰的紫外吸收峰；

b2）将从步骤b1）中收集的洗脱峰进行凝胶过滤层析，收集洗脱峰，即为所述复性重组人骨形态发生蛋白-2纯品溶液。

在上述方法中，步骤a1）中，进行所述NaCl一步洗脱所用的洗脱液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl0.35mol/L，Tris-HCl50mmol/L，尿素8mol/L；pH值为8.5；

步骤a2）中，进行所述NaCl一步洗脱所用的洗脱液的溶剂为水，溶质及其浓度为NaCl0.75mol/L，磷酸二氢钠50mmol/L，尿素8mol/L；pH值为5.5；

步骤b1）中，进行所述NaCl线性洗脱所用的洗脱液的pH值为8.5，溶质为NaCl，溶剂由终浓度为50mmol/L的Tris-HCl，以及终浓度为3mol/L的尿素和水组成；所述线性洗脱的体积为10个层析柱柱体积；在进行的所述10个层析柱柱体积洗脱过程中，NaCl在所述洗脱液中的浓度由0.4M线性升至0.7M；

步骤b2）中，所述凝胶过滤层析中所采用的层析介质的分离范围包括所述重组人骨形态发生蛋白-2的分子量大小（复性后蛋白，30KD）。所用的层析柱的柱长度和柱内径比为100:26。

在上述方法中，步骤a1）中所述亲和层析的介质载体为Sepharose；步骤a2）中所述阳离子交换层析的介质载体为Sepharose；步骤b1）中所述亲和层析的介质载体为Sepharose；步骤b2）中所述凝胶过滤层析的介质为Sephacryl S-100（分离范围为1-100KD）。

在上述方法中，步骤3）中，所述对步骤2）中得到的变性重组人骨形态发生蛋白-2溶液进行复性，采用的复性液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：0.05-0.2mol/L Tris-HCl，0.5-2.0mol/L尿素，0.05-0.1mol/L2-环己氨基乙磺酸，0.2-0.5mol/L精氨酸，0.1-1.0mmol/L氧化型谷胱甘肽，1.0-10mmol/L还原型谷胱甘肽，pH8.5-9.0。

在上述方法中，步骤3）中，所述对步骤2）中得到的变性重组人骨形态发生蛋白-2溶液进行复性，采用的是一步直接稀释法，具体为如下：向步骤2）中得到的变性重组人骨形态发生蛋白-2溶液加入9倍体积的所述复性液对其进行十倍稀释，于4-10℃（如4℃）震荡培养4-7天（如4天），完成蛋白复性；

所述震荡培养的转速可为120-180转/分钟，具体为150转/分钟；其旋转半径与上海智城分析仪器制造有限公司生产的ZWY-211B型号摇床的旋转半径相同。

在本发明的一个实施例中，所述复性液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：0.1mol/LTris-HCl，0.5mol/L尿素，0.1mol/L2-环己氨基乙磺酸，0.2mol/L精氨酸，0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽，1mmol/L还原型谷胱甘肽，pH8.5-9.0。

在上述方法中，步骤b2）中，所述收集洗脱峰是用如下溶液洗脱得到的：20mmol/L磷酸二氢钠，0.15mol/L氯化钠，pH5.5。各浓度为相应组分在溶解液中的终浓度。

在上述方法中，步骤a1）中所述亲和层析的介质具体为Heparin Sepharose（如GE公司产品，其产品目录号为17-0998-03）；步骤a2）中所述阳离子交换层析的介质具体为SPSepharose（如GE公司产品，其产品目录号为17-0729-04；步骤b1）中所述亲和层析的介质具体为Heparin Sepharose（如GE公司产品，其产品目录号为17-0998-03）；步骤b2）中所述凝胶过滤层析的介质具体为Sephacryl S-100（如GE公司产品，其产品目录号为17-0612-05）。当然，除了以上列举的GE公司生产的各层析柱外，具有等同或类似功能的其他公司生产的层析柱也均可用于完成本发明。

在上述方法中，步骤a1）中，上样量可为300±30mL，洗脱时的流速可为80±20mL/min，洗脱体积可为3L；步骤a2）中，上样量可为500±50mL，洗脱时的流速可为80±20mL/min，洗脱体积可为6L；步骤b1）中，上样量可为1000±100mL，洗脱时的流速可为10±2mL/min，洗脱体积可为10个柱体积；步骤b2）中，上样量可为15mL，洗脱时的流速可为2.5±0.5mL/min，洗脱体积可为900mL。

在上述方法的步骤a1）中，所述收集洗脱峰具体为收集如下洗脱峰：在步骤a1）的所述亲和层析中，洗柱后用洗脱液进行洗脱所得的第1个峰。

在上述方法的步骤a2）中，所述收集洗脱峰具体为收集如下洗脱峰：在步骤a2）的所述阳离子交换层析中，洗柱后用洗脱液进行洗脱所得的第1个峰。

在上述方法的步骤b1）中，所述收集洗脱峰为收集进行所述NaCl线性洗脱过程中所产生的第二个洗脱峰；进一步，所述收集洗脱峰具体为收集如下洗脱峰：在步骤b1）的所述亲和层析中，洗柱后用洗脱液进行梯度洗脱NaCl在洗脱液中的浓度线性增至0.45M时开始起峰的紫外吸收峰。

在上述方法的步骤b2）中，所述收集洗脱峰为：当紫外检测起峰时继续冲洗排废20mL（以去除与分子量较大的多聚体杂质），然后开始收集洗脱峰，待检测峰回落至基线附近时停止收集。在本发明的一个实施例中，所述收集洗脱峰具体为收集如下洗脱峰：在步骤b2）的所述凝胶过滤层析中，洗柱后用洗脱液进行洗脱所得的第1个峰。

在上述方法的步骤a1）、步骤a2）和步骤b1）的所述层析中，在洗脱前还包括洗柱的步骤，具体如下：

步骤a1）中，进行所述NaCl一步洗脱前还包括如下步骤：用缓冲液H-AB对上样后的所述步骤1）中得到的包涵体裂解液进行洗涤（流速可为80±20mL/min），洗3个亲和层析柱柱体积；所述缓冲液H-AB的溶剂为水，溶质及浓度如下：Tris-HCl50mmol/L，尿素8mol/L，NaCl0.1mol/L；pH8.5；

步骤a2）中，进行所述NaCl一步洗脱前还包括如下步骤：用缓冲液SP-AB对上样后的所述从步骤a1）中收集的洗脱峰样品进行洗涤（流速可为80±20mL/min），洗3个阳离子交换层析柱柱体积；所述缓冲液SP-AB的溶剂为水，溶质及浓度如下：磷酸二氢钠50mmol/L，尿素8mol/L，NaCl0.1mol/L；pH5.5；

步骤b1）中，进行所述NaCl线性洗脱前还包括如下步骤：用平衡缓冲液为HF-A对上样后的所述步骤3）中得到的复性的所述重组人骨形态发生蛋白-2进行洗涤（流速可为10±2mL/min），洗2个亲和层析柱柱体积；所述平衡缓冲液HF-A的溶剂为水，溶质及浓度如下：Tris-HCl50mmol/L，尿素3mol/L；pH8.5。

在上述方法中，所述重组人骨形态发生蛋白-2的氨基酸序列具体如序列表中序列1所示。

在上述方法的步骤1）中，所述裂解含有重组人骨形态发生蛋白-2的包涵体，所用的裂解液的溶剂为水，溶质及浓度如下：Tris-HCl0.1mol/L，盐酸胍8mol/L，DDT10mmol/L，pH9.0。裂解所述包涵体时，所述包涵体与所述裂解液的配比为1克所述包涵体：30mL所述裂解液。

本发明的再一个目的是提供一种蛋白复性液。

本发明所提供的蛋白复性液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：0.05-0.2mol/LTris-HCl，0.5-2.0mol/L尿素，0.05-0.1mol/L2-环己氨基乙磺酸，0.2-0.5mol/L精氨酸，0.1-1.0mmol/L氧化型谷胱甘肽，1.0-10mmol/L还原型谷胱甘肽，pH8.5-9.0。

在本发明的一个实施例中，所述复性液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：0.1mol/LTris-HCl，0.5mol/L尿素，0.1mol/L2-环己氨基乙磺酸，0.2mol/L精氨酸，0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽，1mmol/L还原型谷胱甘肽，pH8.5-9.0。

所述蛋白复性液在对原核表达得到的重组人骨形态发生蛋白-2进行复性中的应用也属于本发明的保护范围。

在上述应用中，所述重组人骨形态发生蛋白-2的氨基酸序列如序列表中序列1所示。更加具体的，所述原核表达得到的重组人骨形态发生蛋白-2为利用大肠杆菌表达系统表达得到的氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白质。

本发明提供的重组人骨形态发生蛋白-2的纯化方法，与现有方法相比，其优势在于：1、在包涵体复性前增加了亲和层析与离子交换层析，进行初步纯化，去除大部分的多聚体、杂蛋白与核酸等杂质，可以减少复性时的蛋白沉淀，从而大大提高复性率；2、特殊的复性工艺，所用蛋白复性液中谷胱甘肽的用量减少，使工艺成本降低，同时复性操作工序更加简单，但复性率仍能达50%以上；3、整个纯化工艺衔接合理，制备的产品纯度达95%以上，蛋白收率较高，内毒素和DNA残留均符合生物药物质量要求。总之，利用本发明所提供的方法对重组人骨形态发生蛋白-2进行纯化，所得蛋白收率高、成本低廉，适于工业规模化生产；同时该纯化生产方法也为同类重组蛋白药物的研发生产提供参考。

附图说明

图1为rhBMP-2蛋白复性前亲和层析图谱。其中，A峰为上样及洗柱时的紫外吸收峰，主要组分为菌体核酸和杂蛋白；B峰为rhBMP-2变性蛋白洗脱峰。

图2为rhBMP-2蛋白复性前阳离子交换层析图谱。其中，D峰为上样及洗柱时的紫外吸收峰,主要组分为菌体核酸；E峰为rhBMP-2变性蛋白洗脱峰。

图3为rhBMP-2蛋白复性前亲和层析所得洗脱峰的SDS-PAGE图谱和rhBMP-2蛋白复性前阳离子交换层析所得洗脱峰SDS-PAGE图谱。其中，泳道M为分子量Marker，其中两个Marker条带的分子量分别为30kd和15kd；泳道1和2为rhBMP-2蛋白复性前亲和层析所得洗脱峰的SDS-PAGE图谱，泳道3为rhBMP-2蛋白复性前阳离子交换层析所得洗脱峰的SDS-PAGE图谱，目的蛋白条带位于分子量15kd处。

图4为rhBMP-2蛋白复性后亲和层析图谱。其中，e1峰为上样及洗柱时的紫外吸收峰,主要组分为小分子盐分；e2峰为用线性洗脱的第一个紫外吸收峰，主要组分为rhBMP-2单体分子；e3峰为rhBMP-2二聚体洗脱峰。

图5为rhBMP-2蛋白复性后SDS-PAGE图谱和rhBMP-2蛋白复性后亲和层析所得第二个洗脱峰（目标峰）SDS-PAGE图谱。其中，泳道M为分子量Marker，其中两个Marker条带的分子量分别为30kd和15kd；泳道1为rhBMP-2蛋白复性后SDS-PAGE图谱；泳道2为rhBMP-2变性蛋白不经预纯化直接稀释复性后SDS-PAGE图谱；泳道3为rhBMP-2蛋白复性后亲和层析所得第二个洗脱峰（目标峰）SDS-PAGE图谱，复性后的二聚体蛋白条带位于分子量30kd处；

图6为rhBMP-2蛋白复性后凝胶过滤层析图谱。其中，E1峰为目标洗脱蛋白峰；E2峰为盐峰（电导峰）。

图7为rhBMP-2蛋白复性后凝胶过滤层析所得洗脱峰的SDS-PAGE图谱。其中，泳道M为分子量Marker，其中两个Marker条带的分子量分别为30kd和15kd；泳道E为rhBMP-2蛋白复性后凝胶过滤层析所得洗脱峰的SDS-PAGE图谱，目的蛋白条带位于分子量30kd处。

图8为rhBMP-2蛋白复性后疏水作用层析图谱。其中，B1、B2、B3阶段没有明显紫外吸收峰，B4阶段为0.1M氢氧化钠洗脱峰，表明蛋白样品可能沉淀在层析填料中。

图9为rhBMP-2蛋白复性后疏水作用层析所得洗脱峰的SDS-PAGE图谱。其中，泳道1为30%异丙醇水溶液洗脱所得组分的SDS-PAGE图谱，未检测到蛋白条带；泳道2为0.5M氢氧化钠洗脱所得组分的SDS-PAGE图谱，主要蛋白条带位于分子量15kd处，另有大量杂条带，推测蛋白样品可能在疏水填料上发生聚集沉淀；泳道3为NaCl线性线性洗脱所得组分的SDS-PAGE图谱，未检测到蛋白条带；泳道4为rhBMP-2蛋白复性后SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所述的重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）的基因工程菌构建方法已在专利CN200510132792.9中公开，本发明的纯化方法即是在专利CN200510132792.9中公开的经大肠杆菌原核表达得到含有所述重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）的包涵体的基础上进行的。具体的，所述重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

实施例1、重组人骨形态发生蛋白-2的纯化

一、包涵体的溶解

包涵体：在专利CN200510132792.9中公开的经大肠杆菌原核表达得到含有所述重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2，序列1）的包涵体。

包涵体溶解液：0.1mol/L Tris-HCl，8mol/L盐酸胍，10mmol/L DDT，pH9.0。各浓度为相应组分在溶解液中的终浓度。

以1克包涵体：30mL包涵体溶解液的比例将包涵体溶解，于4℃、150r/min振荡18小时后，10000g高速离心10min，收集上清液即为包涵体裂解液。

二、复性前纯化

在进行蛋白复性前依次进行亲和层析和阳离子交换层析。

1、变性蛋白的肝素亲和层析纯化

层析介质：Heparin Sepharose（GE公司，17-0998-03）。

平衡缓冲液H-A：50mmol/L Tris-HCl，8mol/L尿素；pH8.5。各浓度为相应组分在溶解液中的终浓度。

洗脱缓冲液H-B：50mmol/L Tris-HCl，8mol/L尿素，1mol/L NaCl；pH8.5。各浓度为相应组分在溶解液中的终浓度。

对步骤一得到的包涵体裂解液进行肝素亲和层析进行纯化，亲和层析柱装填规格：柱床体积1L，柱内径100mm，具体操作如下：

（1）柱平衡：用平衡缓冲液H-A以80±20mL/min的流速平衡层析柱，平衡至流出液的基线平稳。

（2）上样及洗柱：将步骤一得到的包涵体裂解液直接上样，上样量为300±30mL，然后用90%（体积分数）平衡缓冲液H-A+10%（体积分数）洗脱缓冲液H-B的混合液（其中NaCl的含量为0.1M）以80±20mL/min的流速对层析柱冲洗3个柱体积，以去除与填料吸附不紧密的大部分核酸和菌体杂蛋白。

（3）洗脱：用65%（体积分数）平衡缓冲液H-A+35%（体积分数）洗脱缓冲液H-B的混合液（其中NaCl的含量为0.35M）进行一步洗脱，流速80±20mL/min，洗脱体积是3L，紫外检测起峰时开始收集，待检测峰回落至基线附近时停止收集（图1所示洗脱峰B）。

以上所述变性蛋白的肝素亲和层析纯化所得图谱（图1）中的两个峰，A峰为上样及洗柱时的紫外吸收峰，主要组分为菌体核酸和杂蛋白；B峰为rhBMP-2变性蛋白洗脱峰。

将收集的检测峰（图1所示洗脱峰B）样品进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图3所示，经该步骤的纯化后，rhBMP-2单体的纯度达81%。

2、变性蛋白的阳离子交换层析纯化

层析介质：SP Sepharose（GE公司，17-0729-04）。

平衡缓冲液为SP-A：50mmol/L磷酸二氢钠，8mol/L尿素；pH5.5。各浓度为相应组分在溶解液中的终浓度。

洗脱缓冲液为SP-B：50mmol/L磷酸二氢钠，8mol/L尿素，1mol/L NaCl；pH5.5。各浓度为相应组分在溶解液中的终浓度。

为了进一步提高蛋白的纯度、降低核酸等杂质的含量，将步骤1得到的洗脱峰样品使用阳离子交换层析进一步纯化，层析柱规格：柱床体积1.8L，柱内径100mm。具体操作如下：

（1）柱平衡：用平衡缓冲液SP-A以80±20mL/min的流速平衡层析柱，平衡至流出液的基线平稳。

（2）上样及洗柱：将步骤1得到的得到的洗脱峰样品用平衡缓冲液SP-A稀释15倍后上样，上样量为500±50mL，然后用90%（体积分数）平衡缓冲液SP-A+10%（体积分数）洗脱缓冲液SP-B的混合液（其中NaCl的含量为0.1M）以80±20mL/min的流速对层析柱冲洗3个柱体积，以去除与填料吸附不紧密的大部分核酸和菌体杂蛋白。

（3）洗脱：用25%（体积分数）平衡缓冲液SP-A+75%（体积分数）洗脱缓冲液SP-B的混合液（其中NaCl的含量为0.75M）进行一步洗脱，流速80±20mL/min，洗脱体积是6L，紫外检测起峰时开始收集，待检测峰回落至基线附近时停止收集（图2所示洗脱峰E）。

以上所述变性蛋白的阳离子交换层析纯化所得图谱（图2）中的两个峰，D峰为上样及洗柱时的紫外吸收峰,主要组分为菌体核酸；E峰为rhBMP-2变性蛋白洗脱峰。

进一步将经上述洗脱获得的检测峰（图2所示洗脱峰E）样品进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图3所示，经该步骤的纯化后，rhBMP-2单体的纯度达94%。另外，采用实施例2步骤五所述方法检测外源DNA残为10ng/250μg以下。

三、蛋白复性

包涵体复性液：0.1mol/L Tris-HCl，0.5mol/L尿素，0.1mol/L2-环己氨基乙磺酸（CHES），0.2mol/L精氨酸，0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽，1mmol/L还原型谷胱甘肽，pH8.5-9.0。

采用一步直接稀释法复性，首先向待复性蛋白（步骤二2中收集得到的洗脱峰样品）加入9倍体积的包涵体复性液对其进行十倍稀释，然后置于恒温摇床上振荡，设定温度4℃、转速150转/分钟（所用摇床为上海智城分析仪器制造有限公司生产的ZWY-211B型号摇床），进行复性4天。

复性结束后，按下述公式进行蛋白复性率的计算：

复性率=复性后rhBMP-2二聚体纯度×复性后蛋白浓度/复性前蛋白浓度，其中复性后rhBMP-2二聚体纯度通过SDS-PAGE电泳分析，SDS电泳结果如图5所示，rhBMP-2二聚体的纯度为55%，复性后蛋白浓度通过lowrry法测得为0.19mg/mL，复性前蛋白浓度通过lowrry法测得为0.20mg/mL。计算得到rhBMP-2蛋白复性率达52.2%。

四、复性后纯化

1、复性蛋白的肝素亲和层析纯化

层析介质：Heparin Sepharose Fast Flow（GE公司，17-0998-03）。

平衡缓冲液HF-A：50mmol/L Tris-HCl，3mol/L尿素；pH8.5。各浓度为相应组分在溶解液中的终浓度。

洗脱缓冲液为HF-B：50mmol/L Tris-HCl，3mol/L尿素，1mol/L NaCl；pH8.5。各浓度为相应组分在溶解液中的终浓度。

对步骤三得到的蛋白复性液进行肝素亲和层析，亲和层析柱装填规格：柱床体积50mL，柱内径26mm。具体操作如下：

（1）柱平衡：用平衡缓冲液HF-A以10±2mL/min的流速平衡层析柱，平衡至流出液的基线平稳。

（2）上样及洗柱：将步骤三得到的蛋白复性液直接上样，上样量为1000±100mL，然后用平衡缓冲液HF-A以10±2mL/min的流速对层析柱冲洗2个柱体积，以去除与上样时残留层析柱中的尿素及复性液中的小分子试剂。

（3）洗脱：用平衡缓冲液HF-A和洗脱缓冲液HF-B的混合液进行NaCl线性洗脱，共洗脱10个柱体积，在10个柱体积内，洗脱缓冲液HF-B在混合液中的体积含量由40%线性变化至70%，即NaCl在洗脱液中的浓度由0.4M线性升至0.7M，洗脱时的流速为10±2mL/min。当NaCl在洗脱液中的浓度线性增至0.45M时，紫外检测的第二个洗脱峰开始起峰，此时收集洗脱峰，至检测峰回落至基线附近时停止收集（图4所示洗脱峰e3）。

以上所述复性蛋白的肝素亲和层析纯化所得图谱（图4）中的3个峰，e1峰为上样及洗柱时的紫外吸收峰,主要组分为小分子盐分；e2峰为用线性洗脱的第一个紫外吸收峰，主要组分为rhBMP-2单体分子；e3峰为rhBMP-2二聚体洗脱峰。

进一步将经上述洗脱获得的第二个洗脱峰（图4所示洗脱峰e3）样品进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图5所示，经该步骤的纯化后，rhBMP-2二聚体（复性前是没有活性的单体，复性后单体聚合为具有生物活性的二聚体）的纯度达95%。

2、复性蛋白的凝胶过滤层析纯化

层析介质：Sephacryl S-100（GE公司，17-0612-05）。

洗脱缓冲液：20mmol/L磷酸二氢钠，0.15mol/L氯化钠，pH5.5。各浓度为相应组分在溶解液中的终浓度。

对步骤1收集的洗脱峰样品进行凝胶过滤层析纯化，层析柱装填规格：柱床体积450mL，柱内径26mm。具体操作如下：

（1）柱平衡：用洗脱缓冲液以2.5±0.5mL/min的流速平衡层析柱，平衡至流出液的基线平稳。

（2）上样：将步骤1收集的洗脱峰样品直接上样，上样量为15mL。

（3）洗脱：用洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱体积900mL，洗脱时的流速为2.5±0.5mL/min。紫外检测起峰时继续冲洗排废20mL，以去除与分子量较大的多聚体杂质，然后开始收集洗脱峰，待检测峰回落至基线附近时停止收集（图6所示洗脱峰E1），得到纯化后且具有重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）活性的rhBMP-2原液。

以上所述复性蛋白的凝胶过滤层析图谱（图6）中，共有2个峰。其中，E1峰为目标洗脱蛋白峰，E2峰为盐峰（电导峰）。

实施例2、实施例1所得蛋白产品的质量检测

一、蛋白纯度的检测

参考2010年《中国药典》第三部附录ⅣC，采用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对实施例1所得蛋白原液进行纯度检测，分离胶浓度为15%，加样量不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）。

结果显示：经扫描仪扫描，实施例1最终收集的洗脱峰中rhBMP-2二聚体的纯度为98.3%。如图7所示。

二、蛋白收率的测算

参考2010年《中国药典》第三部附录ⅥB，采用lowrry法测得实施例1所得蛋白原液的蛋白浓度为0.75mg/mL，且每克包涵体通过实施例1纯化方法可得到rhBMP-2原液126mL，根据公式蛋白收率=rhBMP-2原液蛋白浓度*蛋白原液体积/包涵体质量，可计算得到采用实施例1的方法的蛋白收率为9.4%，整个生产工艺的蛋白收率较高，适于工业化放大生产。

三、蛋白生物学活性测定

采用小鼠成肌细胞C2C12（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，GNM26）碱性磷酸酶法测定实施例1最终收集的洗脱峰中rhBMP-2的生物学活性，原理如下：经rhBMP-2刺激，小鼠成肌细胞C2C12内的碱性磷酸酶活性会增强，且rhBMP-2浓度越高，小鼠成肌细胞C2C12内的碱性磷酸酶活性越强。具体方法如下：将小鼠成肌细胞C2C12接种到含10%（体积分数）胎牛血清的DMEM培养基中培养24小时，当细胞密度达1×10⁵个/mL时，移走培养基，加入含有不同浓度的rhBMP-2标准品（美国sigma-aldrich公司，B3555）的DMEM培养基培养，并将未添加标准品的空白DMEM培养基作为阴性对照。

细胞培养6天后采用反复冻融法裂解细胞，然后采用碱性磷酸酶检测试剂盒测定碱性磷酸酶活性，所用试剂盒购自美国sigma-aldrich公司，产品目录号AP0100-1KT。rhBMP-2生物活性（U/mg）计算公式为：生物活性=样品碱性磷酸酶活性/蛋白含量，其中样品蛋白含量由lowrry法测得，活性单位（U）的定义参照试剂盒说明书。严格按照试剂盒说明书操作，测得rhBMP-2标准品的生物活性为502U/mg，实施例1制备的rhBMP-2原液生物活性为514U/mg，两者数值相当，表明本发明所生产的rhBMP-2生物活性良好。

四、内毒素残留测定

参考2010年《中国药典》第三部附录ⅦE凝胶限量试验所述方法，对实施例1制备的rhBMP-2产品的内毒素残留量进行测定。

结果显示，实施例1制备得到的rhBMP-2原液的内毒素残留量<10EU/250μg，符合常见生物药物的质量要求。

五、菌体DNA残留测定

采用DNA探针杂交法测定菌体DNA残留量，供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA的含量。用于探针标记和阳性对照的DNA，由本发明所用工程菌提取纯化获得，提取方法参考《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002）；探针的标记及显色反应按DNA标记和检测试剂盒使用说明书进行，试剂盒购自研域（上海）化学试剂有限公司公司，其产品目录号为90603-5。

结果显示，实施例1制备得到的rhBMP-2原液的菌体DNA残留量为0.2ng/250μg，符合常见生物药物的质量要求。

对比例1、复性后蛋白的疏水作用层析

本发明的发明人在进行重组人骨形态发生蛋白-2的纯化过程中，按照实施例1的方法进行操作，在进行完实施例1的步骤三（完成蛋白复性）后，还采用了疏水作用层析替代了步骤四的亲和层析和凝胶过滤层析，结果显示，疏水作用层析不适于重组人骨形态发生蛋白-2的纯化。具体如下：

一、包涵体的溶解

同实施例1。

二、复性前纯化

同实施例1。

三、蛋白复性

同实施例1。

四、复性后纯化—疏水作用层析

层析介质：Phenyl Sepharose Fast Flow（GE公司，17-0965-03）。

平衡缓冲液PF-A：15mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L尿素；25mM环己氨乙烷磺酸（CHES），1mol/L NaCl，5％（v/v）N，N-二甲基甲酰胺，pH8.5。各浓度为相应组分在溶解液中的终浓度。

洗脱缓冲液为PF-B：15mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L尿素；25mM环己氨乙烷磺酸（CHES），5％（v/v）N，N-二甲基甲酰胺，pH8.5。各浓度为相应组分在溶解液中的终浓度。

对步骤三得到的蛋白复性液进行疏水作用层析，亲和层析柱装填规格：柱床体积50mL，柱内径26mm。具体操作如下：

（1）柱平衡：用平衡缓冲液PF-A以10±2mL/min的流速对层析柱平衡，平衡至流出液的基线平稳。

（2）上样及洗柱：将实施例1步骤三得到的蛋白复性液直接上样，上样量为100±10mL，然后用平衡缓冲液PF-A以10±2mL/min的流速对层析柱冲洗2个柱体积，以去除与上样时残留层析柱中的尿素及复性液中的小分子试剂。

（3）洗脱：用平衡缓冲液PF-A和洗脱缓冲液PF-B的混合液进行NaCl线性洗脱，在10个柱体积内，洗脱缓冲液PF-B在混合液中的体积含量由0%线性变化至100%，即NaCl在洗脱液中的浓度由1M线性升至0M，洗脱时的流速为10±2mL/min。

结果显示，层析图谱没有洗脱出蛋白峰（图8所示亲和层析图谱），推测蛋白与填料结合过于紧密，故采用30%（v/v）异丙醇水溶液以10mL/min的流速洗脱100mL，但仍未有洗脱峰，故进一步推测蛋白沉淀在柱子上，采用0.5M NaOH以3mL/min的流速洗柱100mL，从而得到一个洗脱峰，收集该洗脱峰采用SDS-PAGE电泳分析，电泳结果如图9所示，显示样品中含有大量多聚体，表明样品上样时产生了蛋白聚集，并沉淀在填料上，故疏水作用层析柱不适于本技术所述rhBMP-2的纯化。

对比例2、不经预纯化直接稀释复性

本发明的发明人在进行重组人骨形态发生蛋白-2的纯化过程中，按照实施例1的方法进行操作，在进行完实施例1的步骤一（包涵体的溶解）后，还进行了不经层析纯化直接稀释复性的对照试验，结果显示，直接稀释复性会产生大量蛋白沉淀，复性率极低，不适于本发明中重组人骨形态发生蛋白-2的复性。具体如下：

一、包涵体的溶解

同实施例1。

二、蛋白复性

包涵体溶解液与包涵体复性液同实施例1。

采用一步直接稀释法复性，首先向待复性蛋白（步骤一中收集得到的包涵体裂解液）加入9倍体积的包涵体复性液对其进行十倍稀释，然后置于恒温摇床上振荡，设定温度4℃、转速150转/分钟（所用摇床为上海智城分析仪器制造有限公司生产的ZWY-211B型号摇床），进行复性4天。复性后液体出现大量蛋白沉淀，将其离心后取上清进行SDS-PAGE电泳分析，SDS电泳结果如图5中的泳道2所示，rhBMP-2二聚体的纯度为28%。

然后按下述公式进行蛋白复性率的计算：

复性率=复性后rhBMP-2二聚体纯度×复性后蛋白浓度/复性前蛋白浓度，其中复性后rhBMP-2二聚体纯度为28%，复性后蛋白浓度通过lowrry法测得为0.03mg/mL，复性前蛋白浓度通过lowrry法测得为0.20mg/mL。计算得到rhBMP-2蛋白复性率为4.2%，远远低于本发明所述复性工艺的复性率52.2%。

Claims (6)

1.一种重组人骨形态发生蛋白-2的纯化生产方法，包括如下步骤：

1)裂解含有重组人骨形态发生蛋白-2的包涵体，得到包涵体裂解液；

2)按照如下a1)和a2)的步骤对所述包涵体裂解液进行分离纯化，得到变性重组人骨形态发生蛋白-2溶液：

a1)将所述包涵体裂解液进行亲和层析，收集洗脱峰；所述亲和层析中所采用的配基为肝素，所采用的洗脱程序为NaCl一步洗脱；所述收集洗脱峰为收集进行所述NaCl一步洗脱过程中所产生的洗脱峰；

a2)将从步骤a1)中收集的洗脱峰进行阳离子交换层析，收集洗脱峰，即为所述变性重组人骨形态发生蛋白-2溶液；所述阳离子交换层析中所采用的阳离子交换基团是SP，所采用的洗脱程序为NaCl一步洗脱；所述收集洗脱峰为收集进行所述NaCl一步洗脱过程中所产生的洗脱峰；

3)对步骤2)中得到的变性重组人骨形态发生蛋白-2溶液进行复性，得到复性重组人骨形态发生蛋白-2粗品溶液；

4)按照如下b1)和b2)的步骤，对步骤3)中得到的复性重组人骨形态发生蛋白-2粗品溶液进行分离纯化，得到复性重组人骨形态发生蛋白-2纯品溶液：

b1)将步骤3)中得到的复性重组人骨形态发生蛋白-2粗品进行亲和层析，收集洗脱峰；所述亲和层析中所采用的配基为肝素，所采用的洗脱程序为NaCl线性洗脱；所述洗脱峰为NaCl在洗脱液中的浓度线性增至0.45M时开始起峰的紫外吸收峰；

b2)将从步骤b1)中收集的洗脱峰进行凝胶过滤层析，收集洗脱峰，即为所述复性重组人骨形态发生蛋白-2纯品溶液；

步骤a1)中，进行所述NaCl一步洗脱所用的洗脱液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl 0.35mol/L，Tris-HCl 50mmol/L，尿素8mol/L；pH值为8.5；

步骤a2)中，进行所述NaCl一步洗脱所用的洗脱液的溶剂为水，溶质及其浓度为NaCl0.75mol/L，磷酸二氢钠50mmol/L，尿素8mol/L；pH值为5.5；

步骤b1)中，进行所述NaCl线性洗脱所用的洗脱液的pH值为8.5，溶质为NaCl，溶剂由终浓度为50mmol/L的Tris-HCl，以及终浓度为3mol/L的尿素和水组成；所述线性洗脱的体积为10个层析柱柱体积；在进行的所述10个层析柱柱体积洗脱过程中，NaCl在所述洗脱液中的浓度由0.4M线性升至0.7M；

步骤b2)中，所述凝胶过滤层析中所采用的层析介质的分离范围包括所述重组人骨形态发生蛋白-2的分子量大小；

步骤3)中，所述对步骤2)中得到的变性重组人骨形态发生蛋白-2溶液进行复性，采用的复性液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：0.1mol/L Tris-HCl，0.5mol/L尿素，0.1mol/L2-环己氨基乙磺酸，0.2mol/L精氨酸，0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽，1.0mmol/L还原型谷胱甘肽，pH8.5-9.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a1)中所述亲和层析的介质载体为Sepharose；步骤a2)中所述阳离子交换层析的介质载体为Sepharose；步骤b1)中所述亲和层析的介质载体为Sepharose；步骤b2)中所述凝胶过滤层析的介质为Sephacryl S-100。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述对步骤2)中得到的变性重组人骨形态发生蛋白-2溶液进行复性，具体为如下：向步骤2)中得到的变性重组人骨形态发生蛋白-2溶液加入9倍体积的所述复性液对其进行十倍稀释，于4-10℃震荡培养4-7天，完成蛋白复性；

所述震荡培养的转速具体为120-180转/分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b2)中，所述收集洗脱峰是用如下溶液洗脱得到的：溶剂为水；溶质及浓度为20mmol/L磷酸二氢钠，0.15mol/L氯化钠；pH5.5。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a1)中，进行所述NaCl一步洗脱前还包括如下步骤：用缓冲液H-AB对上样后的所述步骤1)中得到的包涵体裂解液进行洗涤，洗3个亲和层析柱柱体积；所述缓冲液H-AB的溶剂为水，溶质及浓度如下：Tris-HCl 50mmol/L，尿素8mol/L，NaCl 0.1mol/L；pH8.5；

步骤a2)中，进行所述NaCl一步洗脱前还包括如下步骤：用缓冲液SP-AB对上样后的所述从步骤a1)中收集的洗脱峰样品进行洗涤，洗3个阳离子交换层析柱柱体积；所述缓冲液SP-AB的溶剂为水，溶质及浓度如下：磷酸二氢钠50mmol/L，尿素8mol/L，NaCl 0.1mol/L；pH5.5；

步骤b1)中，进行所述NaCl线性洗脱前还包括如下步骤：用平衡缓冲液为HF-A对上样后的所述步骤3)中得到的复性的所述重组人骨形态发生蛋白-2进行洗涤，洗2个亲和层析柱柱体积；所述平衡缓冲液HF-A的溶剂为水，溶质及浓度如下：Tris-HCl 50mmol/L，尿素3mol/L；pH8.5。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组人骨形态发生蛋白-2的氨基酸序列如序列表中序列1所示。