DE19748734A1 - Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Dimeren von rekombinanten humanen Wachstumsfaktoren aus der Cystein-Knoten-Familie sowie Verwendung der gewonnenen Dimere - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Dimeren von rekombinanten humanen Wachstumsfaktoren aus der Cystein-Knoten-Familie sowie Verwendung der gewonnenen Dimere

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Uwe Kaerst
Carsten Mueller
Ursula Rinas
Herbert Weich
Helmut Erdmann
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gewinnung von biologisch aktiven Dimeren von rekombianten humanen Wachstumsfaktoren. Bei der aktiven Form der Wachstumsfaktoren der Cystein-Knoten-Fami­ lie handelt es sich um Homo- oder Heterodimere, die durch zwei Disulfidbrücken kovalent verbunden sind.
Die meisten Gene der in Rede stehenden Wachstumsfaktoren beste­ hen aus mehreren Exons. Bekannt ist, daß das Expressionsprodukt eines Gens verschiedene Proteine umfassen kann, was möglicher­ weise auf unterschiedliches Herausschneiden von Intron-RNA-Se­ quenzen beziehungsweise unterschiedliche Spleißformen zurückzu­ führen ist. So wurden beispielsweise für VEGF-A die Formen VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189 und VEGF206 beschrieben, die homogenisch bzw. aus einem Gen abgeleitet sind, vgl. Charnock- Jones et al. 1993. Im folgenden sollen unter Homodimeren nur ho­ mogenische Homodimere aus zwei identischen Peptidketten verstan­ den werden. Alle aus unterschiedlichen Peptiden zusammengesetz­ ten Proteine, und zwar sowohl aus homogenischen als auch aus he­ terogenischen Peptiden, sollen als Heterodimere verstanden wer­ den.
Die Herstellung von biologisch aktiven dimeren Wachstumsfaktoren ist bisher ein sehr aufwendiger Prozeß mit geringer Ausbeute, wozu beispielsweise auf die Gewinnung von PDGF (Platelet-derived growth factor) verwiesen werden kann; Hoppe et al. 1989. So sieht die bekannte PDGF-Gewinnung im wesentlichen folgende Maß­ nahmen vor:
  • (i) Solubilisierung aus den Zelleinschlußkörpern mit 8 M Harn­ stoff oder 6 M Guanidinium-HCI in Gegenwart eines Reduktionsmit­ tels,
  • (ii) Schützen der freien Thiolgrupen durch Sulfonierung,
  • (iii) 4-stufiges Reinigen und Rückfalten der (biologisch inakti­ ven) Monomeren.
  • (iv) Schließlich Dimerisierung der Monomeren in Gegenwart von Glutathion mit Reinigung der Dimeren und Abtrennung von nicht umgesetzten Monomeren.
Die Ausbeute des Dimerisierungsschrittes allein beträgt nur etwa 10%; Hoppe et al. 1989.
Das für PDGF bekannte Verfahren läßt sich bekanntlich auch auf die Wachstumsfaktoren VEGF-A (Vascular endothelial growth factor) und PlGF-1 (Placenta growth factor) als Beispiel für weitere Vertreter aus der Familie der Cystein-Knoten-Proteine übertragen; Birkenhäger et al. 1996. Abgesehen von der wiederum geringen Ausbeute dieses bekannten Verfahrens befriedigt nicht, daß erst im letzten Schritt biologisch aktives Dimer neben inak­ tivem Dimer gebildet wird, so daß eine weitere Reinigung erfor­ derlich ist und die Aktivität während der Reinigung nicht kon­ trolliert werden kann.
Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Gewinnung von biolo­ gisch aktiven Dimeren von rekombinaten humanen Wachstumsfaktoren aus der Cystein-Knoten-Familie vorgeschlagen, bei dem man von Zelleinschlußkörpern ausgeht, wobei das Verfahren dadurch ge­ kennzeichnet ist, daß man
  • (A) entweder
    • (i) die Einschlußkörper in einem wäßrigen alkalischen und harn­ stoff-haltigen Medium in Gegenwart eines an sich bekannten Re­ duktionsmittels solubilisiert,
    • (ii) das Solubilisat auf eine Ionenaustauschersäule aufträgt,
    • (iii) durch Rückfaltung, Dimerisierung und aerobe Re-oxidation renaturiert, indem man mit einem absteigenden Harnstoffgradien­ ten wäscht, und
    • (iv) mit einem Mineralsalzgradienten eluiert
  • (B) oder
    • (i) die Einschlußkörper in einem wäßrigen Medium in Gegenwart eines an sich bekannten Solubilisierungsmittels und eines an sich bekannten Reduktionsmittels solubilisiert,
    • (ii) gegebenenfalls das Solubilisat unter denaturierenden Bedin­ gungen einer Gelfiltration unterwirft,
    • (iii) in fakultativer Gegenwart eines an sich bekannten Solubi­ lisierungsmittels und in Gegenwart eines an sich bekannten Re­ dox-Mittels zu assoziationskompetenten Monomeren rückfaltet, in­ dem man das Solubilisat einer Gelfiltration unterwirft,
    • (iv) die Wachstumsfaktoren im Eluat der Gelfiltration zu biolo­ gisch aktiven Dimeren mit Hilfe eines Redox-Mittels dimerisiert und
  • (C) die gemäß (A) oder (B) dimerisierten Wachstumsfaktoren fein­ reinigt, indem man sie weiteren für die Reinigung von rekom­ binanten Proteinen an sich bekannten Reinigungsschritten unter­ wirft.
Variante A
  • (i) Einschlußkörper werden also alkalisch in Gegenwart von Harn­ stoff und vorzugsweise bei geringer Harnstoffkonzentration solu­ bilisiert.
  • (ii) Die solubilisierten Proteine werden an einen Ionenaustau­ scher gebunden.
  • (iii) bis (iv) Der Harnstoff wird in Analogie zu einer Dialyse allmählich graduell entfernt, die Monomeren werden rückgefaltet und unter Rückbildung von Disulfidbrücken dimerisiert und die Disulfidbrücken der gebildeten Dimeren werden durch Luft oder Sauerstoff, insbesondere durch gelösten Sauerstoff, reoxidiert, so daß man durch Rückfaltung, Dimerisierung und Reoxidation re­ naturiert.
Bei der Gewinnung eines speziellen Dimeren kann man dem spezifi­ schen Verhalten dieses Dimeren dadurch Rechnung tragen, daß man
  • (a) während der Solubilisierung und der Chromatographie die Harnstoff- und Reduktionsmittelkonzentration,
  • (b) während des Waschens die Flußrate sowie
  • (c) beim Auftragen auf die Säule das Verhältnis der aufgetragenen Proteinmenge zur Säulenkapazität optimiert.
Für rhplGF-1 kann man beispielsweise an eine Harnstoffkonzen­ tration von etwa 1 M und einen Tris-Puffer mit einem PH von etwa 8,0 denken und für PDGF-BB beispielsweise an eine Harnstoffkon­ zentration von etwa 1,5 M und einen Puffer mit einem pH von etwa 8,5.
Durch eine Ko-Solubilisierung und Ko-Chromatographie lassen sich vergleichsweise einfach heterodimere Liganden gewinnen, etwa von PlGF-1 und VEGF121. Eine stöchiometrische Koexpression ist bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht notwendig.
Wenn man gemäß Variante A arbeitet, kann man die Feinreinigung mit Hilfe von Heparin-Affinitätschromatographie, Kationenaustau­ scher-Chromatographie, Affinitätschromatographie, Gelfiltration und/oder Elutions-Elektrophorese durchführen.
Jederzeit sind Aktivitätstests möglich. Der Nachweis der biolo­ gischen Aktivität kann beispielsweise durch spezifische ELISAs oder durch Kompetitionsassays für die Rezeptorbindung, bei­ spielsweise mit sFlt-1 und 125I-VEGF165, und 3[H]-Thymidin-Ein­ bau für die Stimulierung der Mitose erfolgen. Für die Mitose- Stimulierung beispielsweise in Balb 3T3-Zellen vergleiche man Klagsbrunn et al. 1985 und Weich et al. 1990.
Variante B
Wenn man bei dieser Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens die Bedingungen für die Gewinnung von speziellen Homo- oder Heterodimeren optimieren will, so kann man folgende Faktoren in Betracht ziehen.
  • (a) Konzentration chaotroper Reagenzien,
  • (b) Flußrate.
  • (c) Redoxverhältnis zur Generierung der Disulfidverbrückungen während der Renaturierungen,
  • (d) Beladung.
  • (e) Proteinkonzentration.
Die Dimerisierungsreaktion läuft also in einem Red-Ox-System ab, wobei die Disulfidverbrückungen oxidativ gebildet wären, während falsch gebildete intra- und intermolekulare Brücken durch das Red-Ox-System wieder aufgelöst werden können. Für die Dimerisie­ rungsreaktion kann man andere Umgebungsparameter einstellen als für die Rückfaltung auf der Säule, beispielsweise durch spe­ zielle Einstellung der Temperatur.
Wenn man nach der Variante B arbeitet, kann man die Feinreinigung mit Hilfe von Gelfiltration und/oder Heparin- Affinitätschromatographie durchführen.
Biologische Aktivität kann man beispielsweise durch 3[H]-Thymi­ din-Einbau bei Stimulierung der DNA-Synthese und die daraus ab­ geleiteten Mitose-Stimulierung beispielsweise in Balb 3T3-Zellen nachweisen; vergleiche Klagsbrunn et al. 1985 und Weich et al. 1990.
Varianten A und/oder B
Als Reduktionsmittel kann man Mercaptoethansulfonsäure (MESNA) verwenden.
Für die aerobe Re-Oxidation kann man ein lufthaltiges oder sau­ erstoffhaltiges wäßriges Medium verwenden, insbesondere ein ge­ puffertes Medium.
Als Mineralsalzgradienten kann man einen NaCl-Gradienten verwen­ den.
Als Solubilisierungsmittel kann man Guanidinium-Hydrochlorid verwenden.
Als Redox-Mittel kann man Glutathion verwenden.
Die Feinreinigung kann durch Aktivitätstests überwacht werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren kann man von Zelleinschluß­ körpern reifer Formen der Wachstumsfaktoren ohne Leader-Sequenz ausgehen.
Dabei kann man von Zelleinschlußkörpern eines Wachstumsfaktors ausgehen, dessen Moleküle, die die Zelleinschlußkörper bilden, sich aus einem einzigen Gen ableiten bzw. homogenisch sind und (im vorstehend angegebenen Sinn) Homodimere oder Heterodimere bilden. Natürlich kann man auch Zelleinschlußkörper eines Wachstumsfaktors dem erfindungsgemäßen Verfahren unterwerfen, dessen Moleküle heterogenisch sind.
Man kann auch von Zelleinschlußkörpern zweier verschiedener Wachstumsfaktoren ausgehen, deren Moleküle, die die Zellein­ schlußkörper bilden, sich aus verschiedenen Genen bzw. aus Genen ableiten, die für jeden Wachstumskörper spezifisch sind.
Dabei können sich die Moleküle der Einschlußkörper eines oder beider Wachstumsfaktoren aus einem einzigen Gen ableiten bzw. homogenisch sein, oder die Moleküle der Einschlußkörper eines oder beider Wachstumsfaktoren können heterogenisch sein.
Erfindungsgemäß kann man von Zelleinschlußkörpern eines Wachs­ tumsfaktors einer Aminosäuresequenz aus der durch SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23 und SEQ ID NO. 24 gebildeten Gruppe ausgehen.
Ferner kann man erfindungsgemäß ein Dimer aus zwei gleichen Ket­ ten einer Aminosäuresequenz aus der durch SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23 und SEQ ID NO. 24 gebildeten Gruppe gewinnen.
Ferner kann man erfindungsgemäß ein Dimer aus zwei verschiedenen Ketten mit Aminosäuresequenzen gewinnen, die man aus einer der folgenden Zusammenstellungen von Aminosäuresequenzen ausgewählt hat: SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 und SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 und SEQ ID NO. 6; SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 7 und SEQ ID NO. 8; SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 9 und SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 und SEQ ID NO. 8; SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 9 und SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 11 und SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 11 und SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 13 und SEQ ID NO. 14; SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20 und SEQ ID NO. 21; SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23 und SEQ ID NO. 24.
Schließlich betrifft eine Ausführungsform der Erfindung die Ver­ wendung eines erfindungsgemäß gewonnenen biologisch aktiven Di­ meren von rekombinanten humanen Wachstumsfaktoren zur Herstel­ lung von pharmazeutischen Präparaten.
Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1 Aufarbeitung von VEGF165 und Gewinnung der aktiven Homodimere aus Zelleinschlußkörpern aus Zellen des E. coli-Stam­ mes JM 109 (Vektorbasis: pCYTEXP3)
Man solubilisiert die Zelleinschlußkörper bei pH 12,5 gemäß Suttnar et al. 1994 in 50 mM Glycinpuffer unter Zusatz von 10 mM Mercaptoethansulfonsäure (MESNA) und 1 M Harnstoff. Hierfür wer­ den pro Gramm Zelleinschlußkörper 5 ml des vorstehend angeführ­ ten Solubilisierungspuffers zugegeben. Man rührt bei Raumtempe­ ratur unter Stickstoff 16 h lang.
Die Lösung wird danach 60 min lang bei 35266* g und 4°C zentri­ fugiert. Der klare Überstand, das Solubilisat, wird auf eine mit 50 mM Glycinpuffer (pH 9, 0) und 1 M Harnstoff equilibrierte Anionenaustauschersäule aufgetragen (pharmacia XK 26/40, 60 ml Bettvolumen, Q-Sepharose, 2 ml/min bei 4°C; 24 ml mit 687 mg Protein aus 4 g Zelleinschlußkörpern).
Die Säule wird zuerst mit Startpuffer und dann mit einem linear absteigenden Harnstoffgradienten (1 M auf 0 M) bei einer Fluß­ rate von 0,25 ml/min (entspricht 0,047 cm/min) gewaschen. Bei diesem Schritt bleiben entstehende Dimere gebunden, eventuell noch vorhandene Monomere werden eluiert, so daß sie nach Opti­ mierung der Bedingungen überhaupt nicht mehr nachweisbar sind. Nach einem Waschschritt mit 50 mM Glycinpuffer (pH 9,0) werden dann die aktiven Dimeren mit einem NaCl-Gradienten eluiert.
Die VEGF-haltigen Fraktionen werden gesammelt, verdünnt (1 : 3) und auf eine 10 ml-Heparin-Säule (Toyopearl AF-Heparin-650-M) aufgetragen, die mit 20 mM Kaliumphosphat (pH 7,2) equilibriert ist. Die Säule wird mit Puffer gewaschen und das VEGF mit einem linearen NaCl-Gradienten eluiert. Die VEGF-haltigen Fraktionen werden gesammelt, wiederum verdünnt (1 : 3) und auf eine mit 50 mM Tris-HCl equilibrierte Kationenaustauschersäule (S-Sepharose) aufgetragen und mit einem Stufengradienten (0,2 M; 0,4 M und 1,0 M NaCl) eluiert. Für weitere Einzelheiten vergleiche man die folgende Tabelle 1.
Für VEGF165, das außer an Flt-A auch an den mitogenen Rezeptor KDR bindet, kann man durch Messung der Stimulierung der DNA-Syn­ theserate zeigen, daß die Aktivität von rekombinantem unglykosi­ lierten Protein aus E. coli mit der von im Baculovirus-System hergestellen VEGF nahezu identisch ist.
Beispiel 2 Aufarbeitung von PDGF-AB und Gewinnung der aktiven Heterodimere aus Einschlußkörpern von E. coli TG1 (Vektorbasis: pCYTEXP3)
Die aus einer Hochzelldichtekultivierung gewonnenen Zeilen werden durch Hochdruckhomogenisation aufgeschlossen und die Einschlußkörper durch Zentrifugieren von der löslichen Fraktion abgetrennt. Dieses Konzentrat wird dreimal mit 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 0,5 mN EDTA und 2% Brij 35 gewaschen, anschließend mit 6 M Gnd-HCl, 100 mM DTT, 0,5 mM EDTA mit Ultraschallunterstützung solubilisiert und über Nacht stehengelassen. Nach Zentrifugieren (40 min bei 26 000 g und 4°C) wird eine Gelfiltration unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt (2 M Gnd-HCl und Glycin-Phosphat (pH 3,0)), die das Protein zu über 90% rein liefert.
Dazu wird eine Säule (XK 26/60-Säule, Superdex 75 pg, Pharmacia) mit einem Bettvolumen von 348 ml und folgender Spezifizierung verwendet; Beladung 10 ml (2,9%); Flußrate: 4 ml × min1; PDGF-Konzentration: 5 mg × ml1.
Zur Rückfaltung wird die PDGF-Stammlösung (4,5 mg × ml-1) auf dieselbe Gelfiltrationssäule gegeben, die mit 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) und 0,5 M Gnd-HCl und Glutathion (reduziert/oxidiert; 40 : 1) equilibriert ist, wobei man bei einer Flußrate von 2 ml ×min-1 eluiert. Der Verlauf der UV-Absorption zeigt dabei im wesentlichen einen Peak bei dem Elutionsvolumen VE = 161 ml, der lediglich PDGF-A/B-Monomere enthält.
Die Dimerisierung dieser Monomere mit Hilfe des Red-Ox-Systems findet im Eluat statt und ist eine im Stundenbereich verlaufende Reaktion.
Erzielter Reinheitsgrad und Ausbeute sind der folgenden Tabelle 2 zu entnehmen.
Tabelle 2
Reinigung von PDGF-AB
Die biologische Aktivität kann durch 3[H]-Thymidin-Einbau für die Stimulierung der DNA-Synthese bzw. für die Mitose-Stimulie­ rung in Balb 3T3-Zellen gemäß Klagsbrunn et al. 1985 und Weich et al. 1990 erfolgen. Mit einer PDGF-AB-Konzentration von 3 bis 5 ng × ml-1 läßt sich eine halbmaximale Stimulierung erreichen, die der von anderen Autoren berichteten Stimulierung entspricht; vgl. Scheppe et al. 1994.
Mit kommerziellen pDGF-AB aus E. coli [SIGMA] läßt sich dasselbe Ergebnis erreichen
Literatur
R. Birkenhäger, B. Schneppe, W. Röckl, J. Wilting, H. A. Weich, J. E. G. McCarthy. Biochem. J. 316 (1996) 703-707.
D. S. Chamock-Jones, A. M. Sharkey J. Rajput-Williams, D. Burch, J. P. Schofield, S. A. Fountain, C. A. Boocock, S. K. Smith. Biology of Reproduction 48 (1993)) S. 1120-1128.
J. Hoppe, H. A. Weich, W. Eichner. Biochemistry 28 (1989), 2956-2960.
J. Hoppe, H. A. Weich, W. Eichner, D. Tatje. Eur. J. Biochem. 187 (1990), 207-214.
M. Klagsbrun, Y. Shing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 805-809.
B. Schneppe, W. Eichner, J.E.G. McCarthy. Gene 143 (1994), 201-209.
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H.A, Weich, N. Iberg, M. Klagsbrun, J. Folkman. Growth Factors 2 (1990), 313-320.
Aminosäuresequenzen

Claims (17)

1. Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Dimeren von rekombinanten humanen Wachstumsfaktoren aus der Cystein-Knoten- Familie, bei dem man von Zelleinschlußkörpern ausgeht, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • (A) entweder
    • (i) die Einschlußkörper in einem wäßrigen alkalischen und harn­ stoff-haltigen Medium in Gegenwart eines an sich bekannten Re­ duktionsmittels solubilisiert,
    • (ii) das Solubilisat auf eine Ionenaustauschersäule aufträgt,
    • (iii) durch Rückfaltung, Dimerisierung und aerobe Reoxidation renaturiert, indem man mit einem absteigenden Harnstoffgradien­ ten wäscht, und
    • (iv) mit einem Mineralsalzgradienten eluiert
  • (B) oder
    • (i) die Einschlußkörper in einem wäßrigen Medium in Gegenwart eines an sich bekannten Solubilisierungsmittels und eines an sich bekannten Reduktionsmittels solubilisiert,
    • (ii) gegebenenfalls das Solubilisat unter denaturierenden Bedin­ gungen einer Gelfiltration unterwirft,
    • (iii) in fakultativer Gegenwart eines an sich bekannten Solubi­ lisierungsmittels und in Gegenwart eines an sich bekannten Re­ dox-Mittels zu assoziationskompetenten Monomeren rückfaltet, in­ dem man das Solubilisat einer Gelfiltration unterwirft, (iv) die Wachstumsfaktoren im Eluat der Gelfiltration zu biolo­ gisch aktiven Dimeren mit Hilfe eines Redox-Mittels dimerisiert und
  • (C) die gemäß (A) oder (B) diinerisierten Wachstumsfaktoren fein­ reinigt, indem man sie weiteren für die Reinigung von rekom­ binanten Proteinen an sich bekannten Reinigungsschritten unter­ wirft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reduktionsmittel Mercaptoethansulfonsäure (MESNA) verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man für die aerobe Re-oxidation ein lufthaltiges oder sauer­ stoffhaltiges wäßriges Medium verwendet, insbesondere ein ge­ puffertes Medium.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mineralsalzgradienten einen NaCl-Gradienten verwendet.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Solubilisierungsmittel Guanidinium- Hydrochlorid verwendet.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Redox-Mittel Glutathion verwendet.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß Anspruch 1(A) arbeitet und die Feinreinigung mit Hilfe von Heparin-Affinitätschromatographie, Kationenaustauscher-Chromatographie, Affinitätschromatographie, Gelfiltration und/oder Elutions-Elektrophorese durchführt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man gemäß Anspruch 1(B) arbeitet und die Feinrei­ nigung mit Hilfe von Gelfiltration und/oder Heparin-Affinitäts­ chromatographie durchführt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Feinreinigung durch Aktivitätstests überwacht.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man von Zelleinschlußkörpern reifer Formen der Wachstumsfaktoren ohne Leader-Sequenz ausgeht.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man von Zelleinschlußkörpern eines Wachs­ tumsfaktors ausgeht, dessen Moleküle, die die Zelleinschlußkör­ per bilden, sich aus einem einzigen Gen ableiten bzw. homoge­ nisch sind.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man von Zelleinschlußkörpern zweier verschiedener Wachstumsfaktoren ausgeht, deren Moleküle, die die Zellein­ schlußkörper bilden, sich aus verschiedenen Genen bzw. aus Genen ableiten, die für jeden Wachstumskörper spezifisch sind.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Moleküle der Einschlußkörper eines oder beider Wachstumsfak­ toren aus einem einzigen Gen ableiten bzw. homogenisch sind oder daß die Moleküle der Einschlußkörper eines oder beider Wachs­ tumsfaktoren heterogenisch sind.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man von Zelleinschlußkörpern eines Wachs­ tumsfaktors einer Aminosäuresequenz aus der durch SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23 und SEQ ID NO. 24 gebildeten Gruppe ausgeht.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, daß man ein Dimer aus zwei gleichen Ketten einer Aminosäuresequenz aus der durch SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23 und SEQ ID NO. 24 gebildeten Gruppe gewinnt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man ein Dimer aus zwei verschiedenen Ketten mit Aminosäuresequenzen gewinnt, die man aus einer der folgenden Zu­ sammenstellungen von Aminosäuresequenzen ausgewählt hat: SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 und SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 und SEQ ID NO. 6; SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 7 und SEQ ID NO. 8; SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 9 und SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 und SEQ ID NO. 8; SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 9 und SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 11 und SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 11 und SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 13 und SEQ ID NO. 14; SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20 und SEQ ID NO. 21; SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23 und SEQ ID NO. 24.
17. Verwendung eines gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 gewon­ nenen biologisch aktiven Dimeren von rekombinanten humanen Wachstumsfaktoren zur Herstellung von pharmazeutischen Präpara­ ten.
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