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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Rückfalten
von denaturiertem humanem Activin A zu humanem Activin A eines natürlichen
Typs mit biologischer Aktivität.
Humanes Activin vom Naturtyp ist ein nützliches Protein, von dem erwartet
wird, dass es in pharmazeutischen Zubereitungen etc. ein gesetzt werden
kann.
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Hintergrund
der Erfindung
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Humanes
Activin A ist ein Homodimerprotein, welches aus zwei Polypeptidketten
besteht, die aus 116 Aminosäuren
aufgebaut sind, isoliert aus einem Kulturüberstand von dem humanen Leukämiezellstamm THP-1
(IFO 50147). Das Molekulargewicht beträgt etwa 25000 Dalton, das Polypeptid
enthält
9 Cys-Reste (d.h. 18 Cys-Reste in dem Dimer), und es gibt 9 intramolekulare
und intermolekulare Disulfidbindungen (Biochemical and Biophysical
Research Communications, 142, 1095–1103, 1987).
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Humanes
Activin A wird gereinigt und hergestellt durch wiederholtes Unterziehen
eines Kulturüberstands,
erhalten durch Stimulation von humanen myelozytischen Leukämiezellen
THP-1 (IFO 50147) mit Phorbolester, einer Mehrstufenchromatographie,
Ausfällung
und einem Konzentrationsvorgang ("Saibo Kogaku" (Cell Engineering), oder eines Kulturüberstands
von rekombinanten CHO-Zellen, die humanes Activin A stark produzieren,
erhalten durch Einführen
eines Expressionsvektors mit humaner Activin A-cDNA (Biochemical and
Biophysical Research Communications, 151, 230–235, 1988). Es gibt jedoch
viele Probleme, wo das Herstellungsverfahren, welches die Reinigung
von Kulturüberständen als
Ausgangsmaterial, abgeleitet von T-Zellen, beinhaltet, als industrielles
Herstellungsverfahren eingesetzt wird.
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Das
heißt,
(1) da Verunreinigungen, die durch Tierzellen als produzierendem
Wirt ausgeschieden wurden, oder sich von fötalem Rinderserum etc. ableiten,
die zuvor als Mediumbestandteile zugegeben wurden, hochgradig entfernt
werden sollten, ist die Ausbeute an gereinigtem humanem Activin
A extrem niedrig; (2) im Vergleich mit dem Fall, wo rekombinante
Mikroorganismen als produzierender Wirt verwendet werden, ist die Produktivität extrem
niedrig, und es sind hochgradig produktive Tierzellen oder Kulturvorrichtungen
nötig,
um das Ausgangsmaterial ausreichend zur Reinigung zuzuführen; und
(3) um den produzierenden Wirt zu kultivieren, sollte eine hohe
Konzentration an fötalem
Rinderserum zugegeben werden, oder ein Serum-freies Medium, welches
Wachstumsfaktoren etc. enthält,
sollte verwendet werden. Diese sind jedoch sehr teuer, und es gibt
ein Problem bezüglich
der stabilen Erhältlichkeit
einer konstanten Qualität,
die zur Produktion notwendig ist. Wie oben beschrieben ist, gibt
es Probleme bezüglich
der geringen Produktivität
etc., wenn humanes Activin A unter Verwendung von T-Zellen hergestellt
wird, und es ist notwendig, diese Probleme zu lösen, um ein industrielles Herstellungsverfahren
zu etablieren.
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Herkömmlicherweise
sind verschiedene Versuche zur Lösung
dieser Probleme unternommen worden. Wenn ein Mikroorganismus, wie
z.B. rekombinantes E. coli etc., als produzierender Wirt verwendet
wird, ist dessen Proteinproduktivität im allgemeinen 100-fach oder
mehr im Vergleich mit derjenigen von T-Zellen verbessert, so dass
der Austausch von T-Zellen durch Mikroorganismen als produzierendem
Wirt eine effektive Maßnahme
zur Verbesserung der Produktivität
ist. Die Produktion von humanem Activin A durch E. coli führt jedoch
häufig
zu denaturiertem humanem Activin A mit verschiedenen intramolekularen
und/oder intermolekularen Disulfidbindungen im Vergleich zu denjenigen
des natürlichen
Typs (europäische
Patentanmeldungs-Veröffent lichtung
(
EP 0222491 ), japanische
offengelegte Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 119679/88).
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In
der Verwendung hier bezieht sich denaturiertes humanes Activin A
auf Moleküle
mit der Polypeptidkette von humanem Activin A, wobei jedoch dessen
Tertiärstruktur
und biologische Aktivität
verloren gegangen sind, z.B. solche, bei denen intramolekulare und/oder
intermolekulare Disulfidbindungen gespalten wurden, wodurch die
Tertiärstruktur
unter Bildung einer Monomerstruktur gelockert wurde, solche, bei
denen die Disulfidbindungen in eine Struktur überführt wurden, die sich in vom
natürlichen
Typ unterscheidet, oder solche, die über zusätzliche intermolekulare Disulfidbindungen
polymerisiert sind.
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Da
ein derartiges denaturiertes humanes Activin A keine biologische
Aktivität
aufweist, sollte das Molekül
rekonstituiert (zurückgefaltet)
werden, so dass es die gleiche Tertiärstruktur wie das Naturtypprotein
aufweist. Es ist jedoch nicht einfach oder sogar unmöglich, einige
Proteine rückzufalten,
so dass es sehr schwierig ist, deren Rückfaltebedingungen zu bestimmen.
Selbst nach Untersuchung ist es nicht immer möglich, geeignete Rückfaltebedingungen
zu bestimmen, insbesondere für
bestimmte polymere Proteine oder Proteine, die eine große Zahl
von Disulfidbindungen enthalten, was die Bestimmung der Rückfaltungsbedingungen
erschwert.
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Humanes
Activin A vom natürlichen
Typ besitzt 9 intramolekulare und intermolekulare Disulfidbindungen,
so dass es extrem schwierig ist, die Bedingungen für die Rückfaltung
des denaturierten humanen Activins A zu bestimmen, und es gibt keinen
Stand der Technik bezüglich
des Verfahrens zur Rückfaltung
von humanem Activin A. Derweil haben A. J. Mason et al. die Beziehung
zwischen der Effizienz der sekretorischen Expression von Activin
A durch Verwendung von T-Zellen und der Struktur eines Expressionsvektors
dafür untersucht
und berichtet, dass neben einer Region für die Aminosäuresequenz
von Activin A eine Prosequenzregion zum Rückfalten und zur Sekretion
von Activin A essentiell ist und nur die Region für die Aminosäuresequenz von
Activin A alleine eine Rückfaltung
oder Sekretion nicht bewirkt (Science, 247, 1328–1330, 1990). Dieser Bericht
deutet darauf hin, dass die Rückfaltung
von denaturiertem humanem Activin A, das durch Mikroorganismen als
produzierendem Wirt exprimiert wird, sehr schwierig ist.
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Buchner
et al., in Analytical Biochemistry 205, 263–270 (1992) und
EP 364 926 A2 , offenbaren,
dass Arginin bezüglich
der Rückfaltung
von Immunglobulinen und deren fragmentalen Polypeptiden und Fusionsproteinen
sowie von tPA (Gewebeplasminogenaktivator) und tPA-bezogenen Proteinen
wirksam ist.
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D.
Arora und N. Khanna, in Journal of Biotechnology 52 (1996), 127–133, offenbaren,
dass die Rückfaltung
von humanem gamma-Interferon unter Verwendung von 0,5 M Arginin
effektiv unterstützt
wird.
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Orsini
et al., The Journal of Biological Chemistry Vol. 253, Nr. 10, 25.
Mai 1978, S. 3453–3458,
offenbaren die Rückfaltung
von Chymotrypsinogen A, worin ein denaturiertes Protein, welches
in einem starken Proteindenaturierungsmittel extrahiert wird (Guanidinhydrochlorid,
Harnstoff), mit einem moderaten Denaturierungsmittel bis auf eine
bestimmte Konzentration verdünnt
wird, wozu ein Thioldisulfidreagens zugegeben wird, um intramolekulare
Disulfidbindungen zu bilden.
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Das
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Rückfalten
von denaturiertem humanem Activin A, welches durch Mikroorganismen
produziert wird, zu humanem Activin A vom natürlichen Typ mit biologischer
Aktivität
bereitzustellen, um eine industrielle Produktion von humanem Activin
A zu ermöglichen.
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Offenbarung
der Erfindung
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Als
Ergebnis der Untersuchungen zur Lösung dieser Probleme haben
die vorliegenden Erfinder ein Verfahren zum Rückfalten von denaturiertem
humanem Activin A zu biologisch aktivem humanem Activin A vom Naturtyp
bereitgestellt, welches die folgenden Schritte (a) und (b) beinhaltet:
- (a) den Schritt des Schützens von Thiolgruppen in solubilisiertem,
denaturiertem humanem Activin A, bei dem alle Thiolgruppen frei
sind, mit Glutathion und/oder Natriumsulfit; und
- (b) den Schritt des Durchführens
einer Austauschreaktion von Disulfitbindungen durch Dialysieren
der geschütztes,
denaturiertes humanes Activin A enthaltenden Lösung gegen einen Rückfaltungspuffer
und anschließend
Zugeben einer Thiolverbindung dazu; oder
- (a) den Schritt des Schützens
von Thiolgruppen in solubilisiertem, denaturiertem humanem Activin
A, bei dem alle Thiolgruppen frei sind, mit Glutathion und/oder
Natriumsulfit; und
- (b) den Schritt des Durchführens
einer Austauschreaktion von Disulfitbindungen durch Austausch des
Puffers für
die geschütztes
denaturiertes humanes Activin A enthaltenden Lösung durch einen Rückfaltungspuffer,
enthaltend eine Diolverbindung,
worin der Rückfaltungspuffer
unten definiert ist.
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Spezifisch
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Rückfalten
von denaturiertem, humanem Activin A zu humanem Activin A vom Naturtyp
mit einer Differenzierungs-induzierenden
Aktivität
für Friend-Leukämiezellen,
umfassend die folgenden Schritte:
- (a) den Schritt
des Schützens
von Thiolgruppen in solubilisiertem denaturiertem humanem Activin
A, bei dem alle Thiolgruppen frei sind, mit Glutathion und/oder
Natriumsulfit;
- (b) den Schritt des Durchführens
einer Austauschreaktion von Disulfidbindungen durch Dialysieren
der geschütztes
denaturiertes humanes Activin-A enthaltenden Lösung gegen den Rückfaltungspuffer
und anschließend
Zugabe einer Thiolverbindung dazu,
oder - (a)
den Schritt des Schützens
von Thiolgruppen in solubilisiertem denaturiertem humanem Activin
A, bei dem alle Thiolgruppen frei sind, mit Glutathion und/oder
Natriumsulfit;
- (b) den Schritt des Durchführens
einer Austauschreaktion von Disulfidbindungen durch Austausch des
Puffers für
die geschütztes
denaturiertes humanes Aktivin A enthaltende Lösung durch den Rückfaltungspuffer, enthaltend
eine Thiolverbindung,
wobei der Rückfaltungspuffer a) ein Puffer
ist, der ein Reagenz enthält,
das aus der Gruppe ausgewählt
ist, bestehend aus 0,53% TDCA/Na; 0,13% TDCA/Na, 9,8%, 2% oder 0,49%
CHAPS, 10% oder 2,1% CHAPSO, 2,5 oder 0,6% CA/Na, 4,2%, 0,9 oder
0,2% DCA/Na, 1,6% oder 0,38% TCA/Na, 0,12% Digitonin, 4,0% NG, sowie
0,5- bis 2-fach höheren
Konzentrationen als die angegebenen Prozentwerte, wobei dieser eine
Pufferwirkung im Bereich von pH 7,5 bis 10,5 aufweist,
oder
b) ein Puffer ist, der 0,13% TDCA/Na enthält und weiterhin ein Reagenz
enthält,
das aus der Gruppe ausgewählt
ist, bestehend aus 1,0 M Argininhydrochlorid; 0,5 M Argininhydrochlorid,
1,0 M oder 0,5 M Magnesiumacetat, 1,0 M oder 0,5 M Lithiumchlorid,
1,0 M Natriumchlorid, 1,0 M Ammoniumchlorid, 1,0 M Lithiumbromid,
und 0,5- bis 2-fach höheren
Konzentrationen als die angegebenen Molwerte, wobei dieser eine
Pufferwirkung im Bereich von pH 7,5 bis 10,5 aufweist,
wobei
der Puffer a) oder b) 20 mT Tris-HCl, pH 8,5, und 0,1 bis 3 M Harnstoff
oder 0,05 bis 2 M Guanidinhydrochlorid enthält.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann die biologische Aktivität von denaturiertem humanem
Activin A wirksam rückgebildet
werden.
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Beste Ausführungsform
der Erfindung
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Nachfolgend
wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
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Das
in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausgangsmaterial ist eine
Kultur, die denaturiertes humanes Activin A enthält, erhalten durch Kultivieren
eines Mikroorganismus mit einem darin integrierten humanen Activin
A-Gen, z.B. rekombinantes E. coli. Wenn E. coli als produzierender
Wirt verwendet wird, ist fast das gesamte humane Activin A als unlösliche Körnchen in
dem Mikroorganismus angehäuft,
und die Körnchen können so
als Ausgangsmaterial verwendet werden.
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Die
unlöslichen
Körnchen
von humanem Activin A, welche auf übliche Weise gewonnen wurden,
werden in einer wässerigen
Lösung
von EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) bei niedriger Konzentration
(1 bis 10 mM) suspendiert und dann mit dem Proteindenaturierungsmittel
Guanidinhydrochlorid und/oder Harnstoff solubilisiert. Die Konzentrationen
an Guanidinhydrochlorid und Harnstoff sind jeweils 4 bis 7 M und
6 bis 10 M, was allgemein zur Denaturierung von Protein erforderlich
ist. Die Konzentration von humanem Activin A ist nicht besonders
eingeschränkt,
eine so hohe Konzentration wie möglich
ist jedoch für
den nachfolgenden Vorgang bevorzugt. Weiterhin wird der pH-Wert
bevorzugt bei 6 oder weniger gehalten, um eine Bildung von unnötigen Bindungen
zu verhindern. Der Solubilisierungsvorgang wird durch Rühren bei
Raumtemperatur für
2 bis 4 Stunden vervollständigt.
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Anschließend wird
ein Reduktionsmittel bei einer Konzentration von 1 bis 100 mM, bevorzugt
5 bis 40 mM, zu der Lösung
von solubilisiertem humanem Activin A gegeben, und das Gemisch wird
mit 20 mM Tris-HCl auf pH 8 bis 9 eingestellt und einer Reduktionsreaktion
bei 20 bis 50°C
für 15
bis 360 Minuten unterzogen, um dessen Thiolgruppen freizusetzen,
welches Cys-Reste
sind. Es ist möglich,
als das Reduktionsmittel Verbindungen wie reduziertes Glutathion,
DTT (Dithiothreitol), 2-Mercaptoethanol
etc. zu verwenden, wovon DTT besonders bevorzugt ist. Die Menge
an zugegebenem DTT beträgt
bevorzugt 5 bis 40 mM. Wenn alle Thiolgruppen in durch Mikroorganismen
erzeugtem humanem Activin A frei sind, ist diese Reduktionsreaktion nicht
erforderlich.
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Oxidiertes
Glutathion wird in einer Menge von 0,05 bis 0,3 M, bevorzugt 0,08
bis 0,16 M, zu der Lösung von
solubilisier tem humanem Activin A, bei dem alle Thiolgruppen frei
sind, gegeben, und das Gemisch wird bei 0 bis 50°C für 2 bis 24 Stunden oder mehr
stehengelassen, wodurch die Thiolgruppen geschützt werden. Alternativ kann
Natriumsulfit anstelle von oxidiertem Glutathion bei der Sulfonierung
zum Schützen
der Thiolgruppen verwendet werden. In diesem Fall werden zu humanem
Activin A, bei dem sämtlichen
Thiolgruppen freigesetzt sind, Natriumsulfit mit einer Endkonzentration
von 0,05 bis 0,5 M, bevorzugt 0,08 bis 0,16 M, und gleichzeitig
Natriumtetrathionat bei einer Endkonzentration von 5 bis 30 mM,
bevorzugt 8 bis 16 mM, gegeben, und das Gemisch wird bei 0 bis 50°C für 2 bis
24 Stunden stehengelassen. Alternativ kann auch ein Gemisch aus
oxidiertem Glutathion und Natriumsulfit verwendet werden.
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Der
Schutzzustand von Thiolgruppen kann durch Umkehrphasen-HPLC auf
einer Silicagelsäule
mit chemisch gebundenen Butylgruppen bestimmt werden, wie z.B. Vydac
214TP54 (4,6ϕ × 250
mm, Separations Group) (Biochemical and Biophysical Research Communications,
142, 1095–1103,
1987). Es ist bevorzugt, dass die in dem vorangegangenen Vorgang
verwendeten Reagenzien in einem Lösungsmittel gelöst sind,
welches zuvor vollständig
entgast wurde, wobei ein Inertgas, wie Stickstoff, Helium etc. als
Gasphase über
die Reaktionslösung
gefüllt
wird, um eine Oxidation des Sauerstoffs in der Luft zu hemmen. Um
die nachfolgenden Schritte durchzuführen, wird das nicht umgesetzte
Schutzreagens für
Thiolgruppen bevorzugt durch Dialyse etc. aus der resultierenden
Lösung
von humanem Activin A mit geschützten
Diolgruppen entfernt.
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Die
Pufferlösung
für humanes
Activin A mit geschützten
Thiolgruppen, erhalten durch das oben beschriebene Verfahren, wird
dann durch einen Rückfaltepuffer,
pH 7.5 bis 10,5, ausgetauscht. Der Rückfaltepuffer, welcher in der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein Puffer, welcher es
erlaubt, dass die Struktur von natürlichem humanem Activin A,
welches bei 0,1 mg/ml in dem Rückfaltepuffer
gelöst
ist, wenn es durch Reduktion mit 0,2 mM Dithiothreitol (DTT) denaturiert
worden war, stabil bei 20% oder mehr als bei einem Tris-Puffer (1,5
M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) gehalten wird. Der Vorgang
wird unten ausführlich
beschrieben. Zum Austauschen der Pufferlösung für geschütztes humanes Activin A durch
den Rückfaltepuffer gibt
es ein Verfahren, bei dem humanes Activin A mit geschützten Thiolgruppen
auf eine Gelfiltrationssäule aufgebracht
wird, z.B. Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech), die zuvor mit dem
ausreichend entgasten Rückfaltepuffer äquilibriert
worden war, und die Proteinfraktion rückgewonnen wird. Alternativ
ist es auch möglich, ein
Verfahren einzusetzen, bei dem humanes Activin A mit geschützten Thiolgruppen
in eine Dialysemembran eingeführt
wird, z.B. Spectra/Por-Membran Nr. 1 (Spectrum Medical Industries,
Inc.) und dann gegen ein 500-faches Überschussvolumen
von ausreichend entgastem Rückfaltepuffer
bei 0 bis 20°C
für 3 bis
24 Stunden oder mehr dialysiert wird.
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Anschließend wird
die Bildung von Disulfidbindungen in humanem Activin A mit geschützten Thiolgruppen
durch Zugabe einer Thiolverbindung erreicht. Die Thiolverbindung
wird in einer Konzentration von 1 bis 10 mM, vorzugsweise 2 bis
5 mM, zu der humanes Activin A-enthaltenden Lösung in dem Puffer gegeben, der
durch den Rückfaltepuffer
wie oben beschrieben ausgetauscht worden war, und das Gemisch wird
bei 0 bis 50°C
für 0,5
bis 14 Tage stehengelassen. Die Beendigung der Rückfaltung und die Rückbildung
der biologischen Aktivität
kann durch die oben beschriebene Umkehrphasen-HPLC und Messung der
biologischen Aktivität
(z.B. Messung der Differenzierungs-induzierenden Aktivität für Friend-Leukämiezellen,
Biochemical and Biophysical Research Communications, 142, 1095–1103, 1987)
bestätigt
werden. Die Thiolverbindung kann eine Thiolverbindung sein, wie
z.B. Cystein, reduziertes Glutathion, DTT, 2-Mercaptoethanol etc., worunter Cystein
oder reduziertes Glutathion besonders bevorzugt ist. Cystein oder
reduziertes Glutathion wird bevorzugt bei einer Konzentration von
2 bis 5 mM zugegeben.
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Die
Bildung von Disulfidbindungen kann auch gleichzeitig mit dem Austausch
durch den Rückfaltepuffer
initiiert werden.
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Chlorwasserstoffsäure wird
zu dem humanen Activin A mit geschützten Thiolgruppen gegeben,
bis der pH-Wert auf 2–4
vermindert wird, womit die Austauschreaktion von Disulfidbindungen
beendet wird. Es wird bei 0 bis 20°C für 3 bis 24 Stunden gegen ein
500-faches Überschussvolumen
von 1 bis 100 mM Chlorwasserstoffsäure, die ein Denaturierungsmittel,
wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid enthält, dialysiert, wodurch das
nicht umgesetzte Schutzreagens für
Thiolgruppen entfernt wird. Es wird mit dem Rückfaltepuffer verdünnt, so
dass die unten beschriebenen Bedingungen erfüllt werden und dann bei 0 bis
50°C für 0,5 bis
14 Tage stehengelassen. Die obige Thiolverbindung soll zuvor bei
der gleichen Konzentration wie oben zu dem Rückfaltepuffer gegeben werden,
um die Bildung von Disulfidbindungen zu unterstützen.
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Die
Bedingungen für
den Rückfaltepuffer
werden auf die folgende Weise bestimmt. Es wird angenommen, dass
die Rückfaltung
von humanem Activin A durch Gewährleisten
der Umgebung des Lösungsmittels zur
Stabilisierung der Tertiärstruktur
von humanem Activin A erreicht wird anstatt der Bildung einer Mutante, die
zum Rückfalten
geeignet ist. Die Stabilität
der Struktur höherer
Ordnung kann durch Messung der chemischen Stabilität abgeschätzt werden,
von der angenommen wird, dass sie damit korreliert. In der Verwendung hier
bedeutet die chemische Stabilität,
dass keine typische Änderung
auftritt, wie z.B. eine molekulare Assoziierung, eine Aggregation
oder Ausfällung,
bewirkt durch Transfer von ursprünglich
gebildeten Disulfidbindungen in dem Molekül.
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Zunächst wird
in 1 mM HCl gelöstes
humanes Activin A vom Naturtyp in einem Puffer, pH 7,5 bis 10,5, bestehend
aus einer Kombination eines Denaturierungsmittels, eines oberflächenaktiven
Mittels, Salz, einer organischen Säure, Zucker, organischen Lösungsmittel
etc., gelöst.
Die Konzentration von natürlichem
humanem Activin A wird auf etwa 0,1 mg/mg eingestellt. Ein Reduktionsmittel
(z.B. DTT, 3-Mercaptoethanol oder reduziertes Glutathion), welches
etwa 50 Äquivalente,
bezogen auf das natürliche
humane Activin A, beträgt, wird
dazu gegeben, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur für etwa 12
Stunden stehen gelassen, und die Menge an verbleibendem natürlichem
humanem Activin A wird durch Umkehrphasen-HPLC bestimmt. Als Kontrolle
wurde Tris-Puffer (1,5 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) verwendet,
die gleiche Reaktion wie oben wurde durchgeführt, und die Menge des verbleibenden
Naturtyps wurde verglichen. Die Zunahme (%) in der verbleibenden
Menge durch den Rückfaltepuffer
im Vergleich mit der verbleibenden Menge, wenn der Tris-HCl-Puffer
(1,5 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl,
pH 8,5)) verwendet wurde, wird als Verbesserung der verbleibenden
Menge ausgedrückt.
Die Pufferbedingungen, die eine größere Verbesserung der Menge
an verbleibendem humanem Activin A mit sich bringen, sind für eine hohe
chemische Stabilität
bevorzugt, d.h. zur Stabilisierung der Tertiärstruktur von humanem Activin
A sowie zur Unterstützung
des Rückfaltens
hiervon. Verschiedene Verbindungen wurden kombiniert, um Puffer
herzustellen und experimentell gescreent, und als Ergebnis wurde
gefunden, dass wenn ein Puffer erlaubt, dass die Struktur von natürlichem
humanem Activin A, denaturiert durch Reduktion, stabil bei 20% oder
mehr als durch Tris-Puffer (1,5 n-Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH
8,5) gehalten wird, dieser Puffer dann als Rückfaltepuffer geeignet ist.
D.h., ein diese Bedingung erfüllender
Puffer (der erlaubt, dass die Struktur stabil bei 20% oder mehr
als durch den Tris-Puffer (1,5 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5)
gehalten wird) kann als der Rückfaltepuffer
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Spezifisch ist ein
diese Bedingung erfüllender
Rückfaltepuffer
wie folgt:
der Rückfaltepuffer
ist a) ein Puffer, enthaltend ein Reagens, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus 0,53% TDCA/Na; 0,13% TDCA/Na, 9,8%, 2%
oder 0,49% CHAPS, 10% oder 2.1% CHAPSO, 2,5% oder 0,6% CA/Na, 4,2%,
0,9% oder 0,2% DCA/Na, 1,6% oder 0,38% TCA/Na, 0,12% Digitonin,
4,0% NG und 0,5- bis 2-fach höhere
Konzentrationen als die genannten Prozentwerte, der eine Pufferwirkung
im Bereich von pH 7,5 bis 10,5 aufweist,
oder b) ein Puffer,
enthaltend 0,13% TDCA/Na und weiterhin enthaltend ein Reagens, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus 1,0 M Argininhydrochlorid; 0,5 M Argininhydrochlorid,
1,0 M oder 0,5 M Magnesiumacetat, 1,0 M oder 0,5 M Lithiumchlorid,
1,0 M Natriumchlorid, 1,0 M Ammoniumchlorid, 1,0 M Lithiumbromid und
0,5- bis 2-fach höhere
Konzentrationen als die genannten Molwerte, und mit einer Pufferwirkung
im Bereich von pH 7,5 bis 10,5,
worin der Puffer a) oder b)
20 mM Tris-HCl, pH 8,5, und 0,1 bis 3 M Harnstoff oder 0,05 bis
2 M Guanidinhydrochlorid enthält.
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Beispiele
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Nachfolgend
wird die vorliegende Erfindung ausführlicher unter Bezugnahme auf
die Beispiele beschrieben. In den Beispielen sind Puffer gemäß den Klassen
A und B erfindungsgemäß.
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Beispiel 1
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Natürliches
humanes Activin A, erhalten durch wiederholtes Unterziehen eines
Kulturüberstands,
abgeleitet von rekombinanten CHO-Zellen, einer Chromatographie (Biochemical
and Biophysical Research Communications, 151, 230–235, 1988)
wurde bei einer Konzentration von 2 mg/ml in 1 mM HCl hergestellt
und dann bei einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml mit 12 Arten von
20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), enthaltend eine Kombination von
Harnstoff (1,5 M und 3,0 M), NaCl (1,0 M und 0 M) und CHAPS (2%,
0,5% und 0 M), verdünnt.
DTT wurde bei einer Endkonzentration von 0,2 mM dazugegeben, und
jedes Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 12 Stunden stehen gelassen,
so dass die Reduktionsreaktion ablief, und die Menge an verbleibendem
humanem Activin A wurde durch Umkehrphasen-HPLC (Vydac214TP54, 4,6ϕ × 250 mm,
hergestellt von Separations Group) bestimmt.
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Der
Puffer, der die höchste
verbleibende Menge anzeigte, war 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,5,
enthaltend 1,5 M Harnstoff und 2% CHAPS.
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Beispiel 2
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Der
in Beispiel 1 gescreente Rückfaltepuffer
wurde zum Rückfalten
von humanem Activin A verwendet.
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E.
coli, in welches für
humanes Activin A kodierende DNA eingeführt worden war, wurde in einem
synthetischen Medium (1 L) kultiviert, und der Tryptophan-Promoter
wurde mit einer Säure
induziert, wodurch humanes Activin A als unlösliche Körnchen/Granulate in dem Mikroorganismus
angehäuft
wurden (europäische Patentanmeldungsveröffentlichung
(
EP0222491 ) und japanische
offengelegte Patentanmeldungsveröffentlichung
Nr. 119,679/88). Eine Suspension der Körnchen (1 mM EDTA, pH 6 oder
weniger) wurde auf übliche Weise
hergestellt, und Harnstoff wurde bei einer Endkonzentration von
8 M zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden
gerührt,
wodurch es durch Denaturierung (20 ml) gelöst wurde. Es wurde in 20 mM
Tris-HCl, pH 8,5 zubereitet und DTT wurde bei einer Endkonzentration
von 20 mM zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten
erhitzt.
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Nachdem
durch Umkehrphasen-HPLC bestätigt
worden war, dass die intramolekularen und intermolekularen Disulfidbindungen
in humanem Activin A vollständig
reduziert waren, wurde oxidiertes Glutathion bei einer Endkonzentration
von 0,1 M zugegeben, und das Gemisch wurde bei 5°C für 15 Stunden stehengelassen.
Die Bildung von gemischten Bindungen zwischen humanem Activin A
und Glutathion wurde durch Umkehrphasen-HPLC bestätigt, und
die Konzentration an humanem Activin A wurde in einem Verdünnungspuffer (8
M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) auf 0,1 mg/ml eingestellt.
Es wurde in eine Dialysemembran überführt (Spectra/Por
Membran, Nr. 1, hergestellt von Spectrum Medical Industries, Inc.)
und bei 5°C
für 15
Stunden gegen ein 500-faches Überschussvolumen
des Rückfaltepuffers
(1,5 M Harnstoff; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5; 2% CHAPS), das in Beispiel
1 gewählt
worden war, dialysiert.
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Cystein
wurde bei einer Endkonzentration von 3 mM zu dem Dialysat gegeben,
welches dann bei 5°C für 3 Tage
stehen gelassen wurde. Eine Rekonstitution der Tertiärstruktur
von humanem Activin A wurde durch Messung der biologischen Aktivität (Differenzierungs-induzierende
Aktivität
für Friend-Leukämiezellen)
bestätigt.
Als ein Ergebnis konnte bestätigt
werden, dass 24% der eingeführten
Masse an denaturiertem humanem Activin A die biologische Aktivität (Differenzierungs-induzierende Aktivität für Friend-Leukämiezellen)
aufwies.
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Es
wurde mit 10% TFA (Trifluoressigsäure) auf pH 3 eingestellt und
mittels Umkehrphasen-HPLC (Vydac214TP54, 4,6ϕ × 250 mm,
hergestellt von Separations Group; Elution mit einem Acetonitrilgradienten) gereinigt,
bis eine elektrophoretisch einzelne Komponente vorlag.
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Beispiel 3
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Die
in Tabelle 1 gezeigten Reagenzien wurden mit den angegebenen Konzentrationen
zu dem Tris-HCl-Puffer (1,5 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5)
gegeben, und diese wurden in einer Reduktionsreaktion bei Raumtemperatur
für 12
Stunden anstelle des Tris-HCl-Puffer in Beispiel 1 verwendet, und
die Menge des verbleibenden natürlichen,
humanen Activin A wurde unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC untersucht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Zunahme (%) der verbleibenden
Menge bei jedem Rückfaltepuffer
im Vergleich mit der verbleibenden Menge bei dem Tris-HCl-Puffer
alleine (1,5 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) bei Verwendung
in der Reduktionsreaktion wird als die Verbesserung der verbleibenden
Menge ausgedrückt.
Als ein Ergebnis wurde ermittelt, dass in Abhängigkeit der Typen von verwendeten
Reagenzien ein grosser Unterschied bezüglich der Verbesserung (%)
der verbleibenden Menge besteht. D.h., es wurde ermittelt, dass
die Zugabe der Reagenzien in Klasse A oder B zu einer Verbesserung
der Menge des verbleibenden natürlichen
humanen Activin A führte,
und insbesondere die Zugabe von 0,53% TDCA/Na-Salz zu einer signifikanten
Verbesserung der verbleibenden Menge führte. Die Puffer gemäß den Klassen
A und B sind gemäß der Erfindung,
während
die anderen Puffer Referenzbeispiele sind.
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Tabelle
1 Verbesserung
der Menge an verbleibendem natürlichem
humanem Activin A in der Reduktionsreaktion
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Abkürzungen
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- CA/Na:
- Cholsäure-Natriumsalz
- CHAPS:
- 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylamino]-1-propansulfonat
- CHAPSO:
- 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylamino]-2-hydroxy-1-propansulfonat
- CTAC:
- Cethyltrimethylammoniumchlorid
(Hexadecyltrimethylammoniumchlorid)
- DCA/Na:
- Deoxycholsäure-Natriumsalz
- NG:
- n-Nonyl-β-D-glucopyranosid
- OG:
- n-Octyl-β-D-glucopyranosid
- SB-12:
- N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonium-1-propansulfonat
- SDS:
- Natriumdodecylsulfat
(Natriumlaurylsulfat)
- Span 80:
- Sorbitanmonooleat
- TCA/Na:
- Taurocholsäure-Natriumsalz
- TDCA/Na:
- Taurodeoxycholsäure-Natriumsalz
- Triton X-100:
- Polyethylenglycol-mono-p-isooctylphenylether
- Tween 20:
- Polyoxyethylensorbitan-monolaurat
- Tween 80:
- Polyoxyethylensorbitan-monooleat
- Sarcosyl:
- N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz
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Dann
wurde Tris-HCl-Puffer (1,5 Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5), dem
jedes in Tabelle 1 gezeigte Reagens zugegeben wurde, als der Rückfaltepuffer
verwendet, und die Rückfaltung
von in E. coli produziertem denaturiertem humanen Activin A wurde
gemäß Beispiel
2 erreicht. Als Ergebnis wurde für
den Fall, wo die Reagenzien (D, E), welche die Menge an verbleibendem
natürlichem
humanen Activin A nicht änderten
oder verminderten, verwendet wurden, die Rückbildung der biologischen
Aktivität
(Differenzierungs-induzierende Aktivität für Friend-Leukämiezellen) überhaupt
nicht beobachtet, wohingegen in dem Fall, wo die Reagenzien (A,
B, C) verwendet wurden, welche die verbleibende Menge erhöhten, die
Rückbildung
der biologischen Aktivität
mit der Verbesserung der verbleibenden Menge korrelierte, d.h. ein
Fortschreiten der Rückfaltung
wurde beobachtet (Tabelle 2). Insbesondere war der Puffer, dem Reagenzien
in den Klassen A und B zugegeben worden waren, als Rückfaltepuffer
wirksam. Es versteht sich also, dass wenn das natürliche humane
Activin A durch Reduktion denaturiert wurde, dieses mit dem Puffer
als Rückfaltepuffer
wirksam rückgefaltet
werden kann, der in der Lage ist, stabil 20% oder mehr dieser Struktur
beizubehalten.
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Diese
Ergebnisse zeigten, dass ein zum Rückfalten geeigneter Puffer
durch Untersuchung der verbleibenden Menge in der Reaktion der Reduktion
und Denaturierung gescreent werden kann.
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Tabelle
2 Biologische
Aktivität
nach Rückfalten
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Beispiel 4
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Die
in Tabelle 3 gezeigten Reagenzien wurden zu dem Tris-HCl-Puffer (1,5 M
Harnstoff, 0,13% TDCA/Na, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5), enthaltend 0,13%
TDCA/Na, von dem in Beispiel 3 bestätigt wurde, dass er effektiv
war, gegeben, und die resultierenden Puffer wurden in der Reduktionsreaktion
bei Raumtemperatur für 12
Stunden anstelle des Tris-Puffers in Beispiel 3 verwendet, und die
Menge des verbleibenden natürlichen, humanen
Activin A wurde unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Zunahme (%) der verbleibenden
Menge bei jedem Rückfaltepuffer
im Vergleich mit der verbleibenden Menge, wenn der Tris-HCl-Puffer
(1,5 M Harnstoff, 0,13% TDCA/Na, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) in der
Reduktionsreaktion verwendet wurde, wird als die Verbesserung der
verbleibenden Menge ausgedrückt. Als
ein Ergebnis wurde ermittelt, dass in Abhängigkeit der Typen von verwendeten
Reagenzien ein grosser Unterschied bezüglich der Verbesserung (%)
der verbleibenden Menge vorliegt. D.h., es wurde ermittelt, dass die
Zugabe der Reagenzien in den Klassen A, B oder C zu einer Verbesserung
der Menge an verbleibendem natürlichem
humanem Activin A führte,
im Vergleich mit der Zughabe von nur TDCA/Na, und insbesondere führte die
Zugabe von 1 M Argininhydrochlorid zu einer signifikanten Verbesserung
der verbleibenden Menge.
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Demgemäß werden
die Puffer, denen die Reagenzien in Klasse A oder B in Tabelle 1
zugegeben worden waren, diejenigen in den Klassen A, B oder C in
Tabelle 3 weiter zugegeben wurde, wirksamer als Rückfaltepuffer
angesehen.
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Tabelle
3 Verbesserung
der Menge an verbleibendem natürlichem
humanem Activin A in der Reduktionsreaktion
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Abkürzungen
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- PEG:
- Polyethylenglycol
- TFE:
- Trifluorethanol
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Beispiel 5
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Natriumsulfit
wurde bei einer Konzentration von 0,1 M zu reduziertem humanen Activin
A gegeben, wie es in Beispiel 2 hergestellt worden war, und Natriumtetrathionat
wurde bei einer Endkonzentration von 0,01 M dazugegeben, und das
Gemisch wurde bei 5°C
für 15
Stunden stehen gelassen. Die Bildung von gemischten Disulfidbindungen
zwischen humanem Actinin A und Sulfitionen wurde durch Umkehrphasen-HPLC
bestätigt,
und die Konzentration von humanem Activin A wurde auf 0,1 mg/ml
in einem Verdünnungspuffer
(8 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) eingestellt. Dieses wurde
in eine Dialysemembran eingeführt
(Spectra/Por-Membran, Nr. 1 (Spectrum Medical Industries, Inc.)),
und dann bei 5°C
für drei
Tage gegen ein 500-faches Überschussvolumen
des Rückfaltepuffers
(1 M Harnstoff; 0,53% TDCA/Na, 1 M Argininhydrochlorid, 20 mM Tris-HCl,
pH 8,5) dialysiert. Cystein wurde bei einer Endkonzentration von
3 mM zu dem Dialysat gegeben, welches dann bei 5°C für 3 Tage stehen gelassen wurde.
Die Rekonstitution der Tertiärstruktur
von humanem Activin A wurde durch Messung der biologischen Aktivität (Differenzierungs-induzierende Aktivität für Friend-Leukämiezellen)
bestätigt.
Es wurde mit 10% TFA auf pH 3 eingestellt und mittels Umkehrphasen-HPLC (Vydac214TP54,
22ϕ250 mm, hergestellt von Separations Group; Elution mit
einem Acetonitril-Gradienten) gereinigt, bis elektrophoretisch eine
einzige Komponente vorlag.
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Beispiel 6
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Die
Bildung von gemischten Disulfidbindungen zwischen humanem Activin
A und Glutathion wurde durch Umkehrphasen-HPLC wie in Beispiel 2
bestätigt,
und Chlorwasserstoffsäure
wurde zugegeben, um den pH auf 3,0 zu vermindern. Dieses wurde in
eine Dialysemembran eingefügt
(Spectra/Por-Membran, Nr. 1 (Spectrum Medical Industrien, Inc.)
und gegen ein 500-faches Überschussvolumen
von 8 M Harnstoff, enthaltend 40 mM Chlorwasserstoffsäure, bei
5°C für 15 Stunden
dialysiert. Das Dialysat wurde mit einem Puffer verdünnt, welcher
derart berechnet wurde, dass die Endkonzentration mit der Zusammensetzung
des Rückfaltepuffers übereinstimmte
(1,5 M Harnstoff, 0,13% TDCA/Na, 0,1 M Argininhydrochlorid, 0,1
M Tris-HCl, pH 8,5) und gleichzeitig die Konzentration an humanem
Activin A 0,1 mg/ml annahm, und das Gemisch wurde dann bei 5°C für 3 Tage
stehen gelassen. Die Rekonstitution der Tertiärstruktur von humanem Activin
A wurde durch Messung der biologischen Aktivität (Differenzierungs-induzierende
Aktivität
für Friend-Leukämiezellen)
bestätigt.
Es wurde mit 10% TFA auf pH 3 eingestellt und mittels Umkehrphasen-HPLC
(Vydac214TP54, 4,6ϕ × 250 mm,
hergestellt von Separations Group; Elution mit einem Acetonitrilgradienten)
gereinigt, bis elektrophoretisch eine einzelne Komponente vorlag.
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Beispiel 7
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Die
nachfolgenden Rückfaltepuffer
wurden jeweils anstelle des in Beispiel 6 verwendeten Rückfaltepuffers
eingesetzt, und es wurde das gleiche Verfahren durchgeführt, wobei
die Tertiärstruktur
von humanem Activin A rekonstituiert wurde, und es wurde dann gereinigt,
bis elektrophoretisch eine einzige Komponente vorlag.
Puffer
1: 1 M Harnstoff; 0,53% TDCA/Na; 0,5 M Argininhydrochlorid; 20 mM
Tris-HCl, pH 8,5
Puffer 2: 1 M Harnstoff; 0,53% TDCA/Na; 1
M Natriumchlorid; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5
Puffer 3: 1 M Harnstoff;
0,13% TDCA/Na; 1 M Argininhydrochlorid; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5
Puffer
4: 1 M Harnstoff; 0,13% TDCA/Na; 0,5 M Argininhydrochlorid; 20 mM
Tris-HCl, pH 8,5
Puffer 5: 1 M Harnstoff; 0,13% TDCA/Na; 0,5
M Calciumacetat; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5
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Beispiel 8
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Die
nachfolgenden Rückfaltepuffer
wurden jeweils anstelle des in Beispiel 6 verwendeten Rückfaltepuffers
eingesetzt, und es wurde das gleiche Verfahren durchgeführt, wobei
die Tertiärstruktur
von humanem Activin A rekonstituiert wurde, und es wurde dann gereinigt,
bis elektrophoretisch eine einzige Komponente vorlag.
Puffer
6: 0,5 M Guanidinhydrochlorid; 0,53% TDCA/Na; 0,5 M Argininhydrochlorid;
20 mM Tris-HCl, pH 8,5
Puffer 7: 0,5 M Guanidinhydrochlorid;
0,53% TDCA/Na; 1 M Natriumchlorid; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5
Puffer
8: 0,5 M Guanidinhydrochlorid; 0,13% TDCA/Na; 1 M Argininhydrochlorid;
20 mM Tris-HCl, pH 8,5
Puffer 9: 0,5 M Guanidinhydrochlorid;
0,13% TDCA/Na; 0,5 M Argininhydrochlorid; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5
Puffer
10: 0,5 M Guanidinhydrochlorid; 0,13% TDCA/Na; 0,5 M Calciumacetat;
20 mM Tris-HCl, pH 8,5
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Gewerbliche
Anwendbarkeit
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Wie
oben beschrieben, kann denaturiertes humanes Activin A zum ersten
Mal durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu humanem Activin
A vom Naturtyp rückgefaltet
werden, und es wurde möglich,
die biologische Aktivität
von denaturiertem humanem Activin A in diesem einfachen Verfahren
wiederherzustellen. D.h., natürliches
humanes Activin A, welches herkömmlicherweise
in eukaryotischen Zellen als produzierendem Wirt hergestellt werden
sollte, konnte einfach und preiswert durch rekombinante Mikroorganismen
als produzierendem Wirt hergestellt werden.
