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1. GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für Reinigung von rekombinanten
Wachstumshormonantagonist-Proteinen unter Verwendung von Zwei-Phasen-flüssig-flüssig-Extraktionsverfahrensweisen.
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2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Proteine
sind Komponenten von lebenden Organismen, die kritische Rollen in
Phänomenen
wie Metabolismus, Genexpression, Signaltransduktion, zellulären und
extrazellulären
Strukturen und dergleichen spielen. Viele Proteine sind für therapeutische
oder diagnostische Anwendungen nützlich;
um sie jedoch therapeutisch oder diagnostisch einzusetzen, ist es
nötig,
dass interessierende Protein in reiner Form herzustellen, d. h.
ohne Kontaminanten, die die therapeutischen oder diagnostischen
Ziele gefährden
und möglicherweise
eine Gefahr für
die Gesundheit eines Patienten darstellen könnten.
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Die
Aufreinigung von Proteinen ist für
lange Zeit eine Herausforderung gewesen, insbesondere wenn nach
einer großmaßstäblichen
Aufreinigung gesucht wird, wie sie typischerweise für die Therapie
oder für
Diagnostika für
eine große
Zahl von Patienten erforderlich ist. Jedoch ist sogar wenn eine
Aufreinigung von Proteinen in kleinem oder mittleren Maßstab gewünscht ist,
eine Verfahrensweise, die schnell und einfach durchzuführen ist,
wobei sie das Protein von Interesse in hinreichend reiner Form und
mit hohen Ausbeuten bereitstellt, sehr wünschenswert.
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Humanes
Wachstumshormon („hGH") und Antagonisten
für hGH,
d. h. Wachstumshormonantagonisten („GHA"), sind Beispiele für Proteine, die für eine Vielfalt
therapeutischer Anwendungen nützlich
sind. hGH ist zur Behandlung von hypophysärem Zwergwuchs und allen Zuständen, die
aus niedrigen Leveln der hGH-Produktion
resultieren verwendet worden, ungeachtet ob ein derartiger Zustand
durch genetischen Defekt, Verletzung oder Hypophysektomie bedingt
ist. Es ist auch gezeigt worden, dass hGH die Genesung von Verbrennungsopfern
und anderen hospitalisierten Patienten verbessert. GHA ist andererseits
verwendet worden, um Akromegalie zu behandeln, eine Form von Riesenwuchs,
die durch Überproduktion
von hGH verursacht wird. Andere mögliche medizinische Indikationen
für GHA
sind die Verhinderung einer Retinopathie bei Diabetespatienten und
die Behandlung von Krebspatienten mit Tumoren, die Rezeptoren, die
Wachstumshormon binden, überexprimieren
(Clark et al., 1996,
WO97/11178 ).
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Obwohl
sogar die Aminosäuresequenz
von hGH hoch konserviert ist, funktionieren GH-Moleküle aus üblichen
Haustieren nicht bei Menschen. Nur das aus den Drüsen von
höheren
Primaten extrahierte Protein funktioniert bei Menschen. Als Folge
ist hGH ursprünglich
aus Hypohpysen von Leichen aufgereinigt worden. Das allgemeine Aufreinigungsverfahren
umfasste eine Extraktion aus Geweben unter mild-alkalischen Bedingungen
(Jones et al., 1979, J. Endocrinology 82: 77–86) oder mit heißem Eisessig,
gefolgt von einer Reihe von Fraktionierungen über pH, Ammoniumsulfat, Ethanolfällung oder
Polyethylenglykolfällung
(Nordisk Insulinlab, 1978,
BE
857327 ) und einige Chromatographiestufen. Es ist auch mittels
Immunaffinitätschromatographie
aus rohem Hypophysenextrakt aufgereinigt worden (Jonsdottir et al.,
1986, Mol. Zell. Endocrinol. 46: 131–135).
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Jedoch
ist aus der Hypophyse stammendes hGH vor kurzem mit einer bestimmten
Anzahl von Creutzfeld-Jakob-Fällen
in Verbindung gebracht und vom Markt genommen worden. Um diese Art
von Problem zu vermeiden, musste hGH in verschiedenen Systemen exprimiert
werden. Am Beginn wurde es aus dem Überstand von transformierten
Affennierenzellkulturen unter Verwendung von hydrophober Interaktionschromatographie
isoliert (Lefort et al., 1986, J. Chromatogr. 361: 209–216). hGH
unterliegt keiner Glykosylierung und kann daher in vorteilhafter Weise
als rekombinantes Produkt in Bakterien exprimiert werden. In der
Tat ist hGH in Bacillus subtilis (Franchi et al., 1991, J. Biotechnol.
18: 41–54)
und Escherichia coli exprimiert worden. Etliche Extraktionsverfahren
sind in Abhängigkeit
vom Zustand des exprimierten Proteins verwendet worden. In Form
von Einschlusskörpern
produziertes hGH wurde mittels Solubilisierung in erhöhten Konzentrationen
an chaotropen Mitteln, wie Guanidinhydrochlorid (Mukhija et al.,
1995, Gene 165: 303–306)
oder Harnstoff, extrahiert. Nach Rückfaltung wurde das Protein
dann entweder mittels selektiver pH-Fällung (Storrs et al., 1990,
EP 445099 ) abgetrennt oder
direkt auf eine Chromatographiesäule
geladen. In löslicher
Form exprimiertes hGH ist aus der periplasmatischen Fraktion von
E. coli mittels Anionenaustausch (Becker et al., 1986, FEBS Lett. 204:
145–150)
oder aus dem rohen Zelllysat mittels Immunaffinitätschromatographie
(Jonsdottir et al., 1986, supra) und Ionenaustauschchromatographie
(Ettori et al., 1992, J. Biotechnol. 25: 307–318) aufgereinigt worden.
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Eine
wässrige
Zwei-Phasen-Verteilung ist eingesetzt worden, um Proteine aus Zelldebris
abzutrennen oder um Proteine voneinander zu trennen. Eine Flüssig-flüssig-Extraktion
beruht auf der Inkompatibilität
zwischen zwei Polymeren in wässriger
Lösung
oder einem Polymer und einem Salz, vorliegend in hoher Konzentration.
Diese Inkompatibilität
wird in der Bildung von zwei getrennten Phasen sehr verschiedener
Zusammensetzungen resultieren. Die Proteinmoleküle werden sich in Abhängigkeit
von ihren Eigenschaften, vorzugsweise in eine Phase oder die andere
verteilen (Diamond et al., 1992, Advances in Biochem. Eng. Biotechn.
47: 89–135).
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Wässrige Zwei-Phasen-Extraktionsverfahrensweisen
sind auf die Aufreinigung von hGH angewendet worden, jedoch umfassten
derartige Verfahrensweisen immer chaotrope Agenzien bzw. Mittel,
die hGH denaturierten (Builder et al.,
U.S. Pat. Nrn. 5,407,810 ;
5,695,958 ;
5,723,310 ). Jedoch hat die Verwendung eines chaotropen
Agens, wie zum Beispiel Harnstoff, Guanidinsalze oder Thiocyanatsalze,
zum Denaturieren des hGH-Proteins kritische Nachteile, insbesondere
bei Verwendung des Reinigungsverfahrens in großem Maßstab. Zum Beispiel erhöhen chaotrope
Mitteln die Kosten der hGH-Aufreinigung, insbesondere da das chaotrope
Agens in einer reinen Form verfügbar
sein muss. Ebenso muss das hGH-Protein, sobald es denaturiert ist,
vor den meisten Verwendungen rückgefaltet
werden, insbesondere vor therapeutischen Verwendungen, wodurch die
notwendigen Bearbeitungsstufen erhöht und die Menge an biologisch
aktiven Proteinen möglicherweise
gesenkt wird.
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Der
Verteilungskoeffizient von hGH in einem Zwei-Phasen-System wurde zum
Analysieren der Reinheit von hGH-Zubereitungen
nach dessen Aufreinigung und vor dessen therapeutischer Verwendung
verwendet. Jedoch sind keine Zwei-Phasen-Extraktionsverfahrensweisen,
die kein chaotropes Agens verwenden, zum Reinigen von hGH oder GHA
eingesetzt worden (Neinsohn et al.,
U.S.
Pat. Nrn. 5,139,943 ;
5,151,358 ; Lorch
et al.,
U.S. Pat. Nr. 5,328,841 ).
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Somit
ist ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Verfahren zum Isolieren
von GHA unter Verwendung einer Zwei-Phasen-Extraktion ohne Bedarf an einem
chaotropen Agens in hohem Maße
wünschenswert.
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Journal
of Biotechnology, 3 (1986) 207–219
offenbart Studien über
die Entfernung von Escherichia coli-Zelldebris mittels wässriger
Zwei-Phasen-Polymerextraktion. Die verwendeten biologischen Rohmaterialien waren
gefrorene Homogenate von E. coli-Zellen, die genetisch zur Erzeugung
von humanem Wachstumshormon (hGH) verändert worden waren. Lösungen von
PEG 4000 und Kaliumphosphat wurden in den Studien über den
Stoffübergang
verwendet.
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3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft wässrige
Zwei-Phasen-Extraktionsverfahren,
worin kein chaotropes Mittel verwendet wird, zur Reinigung von rekombinanten
GHA-Proteinen (rGHA) aus einer beliebigen Quelle.
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In
einem Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen die Verfahren eine
Mehrphasenextraktion zur Isolierung von rGHA-Proteinen bereit. In einer bevorzugten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellen die Mehrphasenextraktionsverfahren
eine Zwei-Phasen-Extraktion zur Isolierung von rGHA-Proteinen bereit. In
einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen die Extraktionsverfahren
eine zweistufige Extraktion zur Isolierung von rGHA-Proteinen bereit.
Derartige Extraktionsverfahren verwenden PEG 4600 und Ammoniumsulfat
als ein phasenbildendes Mittel. In einem Aspekt der vorliegenden
Erfindung verwenden die bereitgestellten Extraktionsverfahren Trispuffer,
Phosphatpuffer, MES-Puffer, HEPES-Puffer, Citratpuffer zur Isolierung
von rGHA-Proteinen. In einer Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung verwenden die Extraktionsverfahren als Quelle des zu reinigenden
Proteins eine beliebige Zelle, ein beliebiges Gewebe oder ein beliebiges
Tier, zum Beispiel Tierzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, gramnegative
Bakterien, grampositive Bakterien, filamentöse Pilze, Hefe oder transgene
Tiere oder einen Extrakt oder einen Überstand, der aus einer beliebigen
der obigen stammt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Escherichia
coli-Zellen verwendet. Die hierin offenbarten Extraktionsverfahren
verwenden kein Protein-denaturierendes Mittel, wie ein chaotropes
Mittel.
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In
einer spezifischen Ausführungsform
verwenden die erfindungsgemäßen Extraktionsverfahren
beispielsweise PEG in Konzentrationen von etwa 6% (G/V) bis etwa
15% (G/V) im Extraktionsgemisch zur Isolierung von rGHA-Proteinen.
Zusätzlich
verwenden die Extraktionsverfahren Ammoniumsulfat in Konzentrationen
von etwa 6% (G/V) bis etwa 15% (G/V) im Ex traktionsgemisch zur Isolierung
von rGHA-Proteinen. Die Extraktionsverfahren werden bei einem pH
von etwas 6 bis etwa 8 zur Isolierung von rGHA-Proteinen durchgeführt.
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Die
hierin offenbarten Extraktionsverfahren können in kleinem Maßstab durchgeführt werden,
wobei mit einem Volumen von weniger als etwa 10 Litern Extraktionsgemisch
zur Isolierung von HGH, rGHA oder einem Homologen von einem dieser
begonnen wird. Die Extraktionsverfahren können auch in einem mittleren Maßstab mit
einem Volumen von mehr als etwa 10 Litern und weniger als etwa 100
Litern Extraktionsgemisch zur Isolierung von rGHA-Proteinen durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform
werden die erfindungsgemäßen Extraktionsverfahren
in großem
Maßstab
mit einem Volumen von mehr als etwa 100 Litern Extraktionsgemisch
zur Isolierung von rGHA-Proteinen durchgeführt.
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4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 zeigt
eine Übersicht über die
Extraktionsverfahren der vorliegenden Erfindung. Die gezeigte Extraktionsverfahrensweise
beginnt mit der Zugabe von PEG und eines Salzes zum Zelllysat (obere
linke Ecke), was im Extraktionsgemisch resultiert. Dann wird das
Gemisch gründlich
gemischt und zentrifugiert, sodass zwei Flüssigkeitsphasen gebildet werden,
von denen die obere leichte Phase mit dem interessierenden Protein angereichert
ist. Die obere Phase wird entfernt (obere rechte Ecke). Dann kann
optional eine Reextraktionsstufe durchgeführt werden, indem zuerst eine
40%ige PEG-Lösung zur
verbleibenden unteren schweren Phase gegeben wird (untere rechte
Ecke). Die zugegebene Menge der PEG-Lösung ist derart, dass nach
Mischen und Zentrifugieren des zweiten Extraktionsgemisches eine
obere leichte Phase gebildet wird, die im Volumen der in der ersten
Extraktion gebildeten oberen leichten Phase etwa gleich ist. Das
zweite Extraktionsgemisch wird dann gemischt und zentrifugiert,
was in einer zweiten oberen leichten Phase resultiert, die im Vergleich zur
unte ren schweren Phase mit dem interessierenden Protein angereichert
ist.
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2A zeigt
ein Phasendiagramm für
ein Gemisch aus einem Polymer und einem Salz. Die gebogenen Linien,
durchgezogen und unterbrochen, sind binodale Kurven. Die binodalen
Kurven geben die Zusammenstellung der Konzentrationen an phasenbildendem
Mittel an, bei denen eine Phasentrennung auftritt. Ein beliebiger
Punkt im Bereich bzw. Wertegebiet links der binodalen Kurve gibt
ein Einphasensystem wieder. Ein beliebiger Punkt rechts der binodalen
Kurve gibt ein Zweiphasensystem wieder. Die gerade Linie, die durch die
Punkte a, b und c geht, ist eine Verbindungslinie, d. h. der Verteilungskoeffizient
des Proteins bleibt unverändert,
wenn die Zusammensetzung des Gemischs entlang der Verbindungslinie
verändert
wird. Alle Systeme auf der Verbindungslinie ergeben die gleichen
zwei Phasen, deren Zusammensetzungen durch die Schnittpunkte der
Verbindungslinie mit der binodalen Kurve beschrieben werden. Die
Reaktionsgemische, die unter a, b und c über dem Phasendiagramm dargestellt
sind, sind Beispiele der Phasenvolumina falls die Zusammensetzung
des Systems entlag der Verbindungslinie verändert wird und die dargestellten
Gemische entsprechen den Punkten a, b und c entlang der Verbindungslinie
im Phasendiagramm. Die Ausbeute der Extraktionsverfahrensweise wird
vom Verteilungskoeffizienten und vom gewonnenen Volumen der Zielphase
abhängen, d.
h. die Ausbeute wird von der Verbindungslinie und der Position des
Systems auf dieser Linie abhängen. 2B zeigt,
wie sich die Position der binodalen Kurve verschieben kann. Mehrere
Faktoren beeinflussen die Position der binodalen Kurve. Im Falle
von PEG-Salz-Systemen wird eine Erhöhung des Molekulargewichts der
PEG-Ketten die binodale Kurve zu niedrigeren Salzkonzentrationen
verschieben.
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Die 3A–3C zeigen
C-4-RP-HPLC-Chromatrogramme eines Zellkulturhomogenatüberstandes
(3A) und nach Zwei- Phasen-Extraktion unter Verwendung von
8% PEG und 10% Ammoniumsulfat bei pH 8,0 (3B und 3C).
In den in den 3A–3C dargestellten
Chromatogrammen wurde der Peak beim Totvolumen („void Peak") bei etwa 2 Minuten nicht integriert.
Der Peak beim Totvolumen ist das Material, das die Säule nicht
bindet, wobei dies wahrscheinlich sehr kleine Proteine und Fermentationsprodukte, wie
Farbstoff („color"), sind. 3A zeigt
ein C-4-Umkehrphasenchromatogramm, das das Ausgangsmaterial für die zwei-Phasen-Extraktion
darstellt. Dies stellt homogenisierte Zellen in Fermentationsbrühe dar,
nachdem die Feststoffe abzentrifugiert wurden (Überstand aus Homogenat). GHA
kann bei etwa 15 Minuten festgestellt werden. Die verbleibenden
Peaks sind kontaminierende Proteine. 3B zeigt
ein Chromatogramm, das die 5× verdünnte obere
Phase, die nach der Zwei-Phasen-Extraktion erhalten wurde, darstellt.
Die Ausbeute von 313 μg/ml
beträgt
tatsächlich
5× 313 μg/ml oder
1,565 mg GHA/ml. GHA eluiert bei etwa 15 Minuten. Die Reinheit wird
durch das Chromatogramm wiedergegeben. 3C zeigt
ein Chromatogramm, das die unverdünnte untere Phase darstellt.
Die Konzentration beträgt
58,8 μg/ml.
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5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung von rGHA-Proteinen.
Die Details zur Ausführung
der Erfindung sind in den nachfolgenden Unterabschnitten beschrieben.
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5.1 GHA-Proteine
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung sind verwendbar zur Isolierung
von rGHA-Proteinen (hiernach kollektiv als „das Protein" bezeichnet, sofern
der Kontext nichts anderes angibt).
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rGHA-Proteinsequenzen
und Varianten davon sind in den
US-Patenten Nrn. 5,681,809 ,
5,350,836 , offenbart worden,
wobei alle von diesen hierin durch Bezugnahme in ihrer Gänze aufgenommen
sind.
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5.1.1. Quellen für GHA-Proteine
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Obgleich
GHA relativ kleine Proteine sind, die chemisch synthetisiert werden
können
(siehe z. B. Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular
Principles, W. H. Freeman & Co.,
N. Y.), können
sie in vorteilhafter Weise mittels DNA-Rekombinationstechnik produziert werden,
wobei Techniken verwendet werden, die auf dem Fachgebiet der Expression
von Genen gut bekannt sind. Diese Verfahren umfassen z. B. in vitro-DNA-Rekombinationstechniken,
Synthesetechniken und in vivo-Genrekombinationen.
Siehe z. B. die Techniken, die in Sambrook et al., Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,
Bd. 1–3:
(1989) und regelmäßigen Aktualisierungen
davon, und in Ausubel et al., Hrsg. 1989, Current Protocols in Molecular
Biology, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., New York
beschrieben sind. DNA und RNA, die eine beliebige der oben beschriebenen
Nukleotidsequenzen codieren, können
chemisch synthetisiert werden, wobei z. B. Synthesegeräte verwendet
werden. Siehe z. B. die Techniken, die in „Olignucleotide Synthesis", 1984, Gait. M.
J. Hrsg., IRL Press, Oxford beschrieben sind.
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Eine
Vielfalt von Wirt-Expressionsvektor-Systemen kann eingesetzt werden,
um GHA zu exprimieren. Die Expressionssysteme, die zu Zwecken der
Erfindung verwendet werden können,
umfassen, ohne Beschränkung
darauf, Mikroorganismen, wie Bakterien (z. B. E. coli, B. subtilis),
transformiert mit rekombinanter/rekombinanten Bakteriophagen DNA-,
Plasmid DNA- oder Cosmid DNA-Expressionsvektoren, enthaltend eine
Nukleotidsequenz, die für
GHA codiert; Hefe (z. B. Saccharomyces, Pichia), die mit rekombinanten
Hefe-Expressionsvektoren, enthaltend eine Nukleotidsequenz, die
für GHA
codiert, transfi ziert ist; Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten
Virusexpressionsvektoren (z. B. Baculovirus), enthaltend eine Nukleotidsequenz,
die für
GHA codiert, infiziert sind; Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten
Virusexpressionsvektoren (z. B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus,
TMV) infiziert oder mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren
(z. B. Ti-Plasmid) transfiziert sind, wobei eine Nukleotidsequenz,
die GHA codiert, enthalten ist; oder Säugerzellsysteme (z. B. COS,
CHO, BHK, 293, 3T3, U937), die rekombinante Expressionskonstrukte,
enthaltend Promotoren, die aus dem Genom von Säugerzellen (z. B. Metallothionein-Promotor) oder
aus Sängerviren
(z. B. der späte
Adenovirus-Promotor, der Vaccinia-Virus-7.5K-Promotor) abgeleitet sind,
beherbergen.
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Bei
eukaryotischen Systemen kann eine Anzahl von Selektionssystemen
verwendet werden, einschließlich,
aber ohne Beschränkung
darauf, der Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase (Wigler et al.,
1977, Cell 11: 223), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und der Adenin-Phosphoribosyltransferase
(Lowy et al., 1980, Cell 22: 817). Diese Gene können in tk–-,
hprt–-
bzw. aprt–-Zellen
eingesetzt werden. Ebenso kann eine Antimetabolitresistenz als die
Basis zur Selektion auf die folgenden Gene verwendet werden: dhfr,
das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler et al., 1980, Natl.
Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare
et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, das Resistenz
gegen Mycophenolsäure
verleiht (Mulligan & Berg,
1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, das Resistenz gegen
das Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., 1981,
J. Mol. Biol. 150: 1); und hygro, das Resistenz gegen Hygromycin
verleiht (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).
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In
bakteriellen Systemen kann eine Anzahl von Expressionsvektoren in
Abhängigkeit
von der Verwendung, die bezüglich
des GHA-Proteins beabsichtigt ist, ausgewählt werden. Die für die Ausführung der
Erfindung geeigneten Bakterien sind gram positive und gramnegative
Bakterien. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Protein
in Escherichia coli(„E.
coli")-Bakterien
exprimiert und nachfolgend aus den Zellen unter Verwendung eines
erfindungsgemäßen Verfahrens
isoliert. Das Protein kann in einer prokaryotischen Zelle exprimiert
werden, wobei Expressionssysteme verwendet werden, die Fachleuten
auf dem Gebiet der Biotechnologie bekannt sind. Expressionssysteme,
die zur Ausführung
der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind in den
US-Patenten Nrn. 5,795,745 ;
5,714,346 ;
5,637,495 ;
5,496,713 ;
5,334,531 ;
4,634,677 ;
4,604,359 ;
4,601,980 beschrieben.
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Prokaryotische
Zellen können
unter einer Vielfalt von Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, gezüchtet werden.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Zellen in
einem Medium, das für das
Wachstum derartiger Zellen geeignet ist, gezüchtet, z. B. Minimalmedien
oder komplette (d. h. reiche) bzw. Vollmedien. Das zum Züchten der
Zellen verwendete Medium sollte keine Konzentrationen von Salzen
oder anderen Chemikalien, z. B. Harnstoff, enthalten, die so hoch
sind, dass sie die Verteilung des Proteins oder Polypeptids oder
die Bildung von Phasen während
der Extraktionsverfahren der vorliegenden Erfindung stören.
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GHA
kann auch in transgenen Tieren exprimiert werden. Tiere einer beliebigen
Art, einschließlich,
aber ohne Beschränkung
darauf, Mäuse,
Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, Schweine, Zwergschweine, Ziegen
und nicht-humane Primaten, z. B. Paviane, Affen und Schimpansen,
können
verwendet werden, um transgene Tiere, die ein für GHA codierendes Transgen
exprimieren, zu erzeugen.
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5.2 Reinigung mittels wässriger
Zwei-Phasen-Extraktion
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung sind verwendbar zur Reinigung
von GHA aus einem rohen Gemisch, das reich an Kontaminanten sein
kann, wie z. B. Zellextrakte. Zellen, die das Protein exprimieren, können vor
der Reinigungsverfahrensweise auf eine Vielfalt von Wegen hergestellt
werden. Z. B. kann man eine Paste aus gefrorenen toten Zellen herstellen
oder man kann lebende Zellen verwenden, die gefroren sind. Oder
lebende Zellen können
direkt in der Extraktionsverfahrensweise verwendet werden.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung betreffen eine wässrige Mehrphasenextraktion
zur Reinigung von GHA. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird eine wässrige Zwei-Phasen-Extraktion
durchgeführt.
Falls GHA aus Zellen gereinigt wird, werden die Zellen vor der Extraktion
des Proteins aufgebrochen oder homogenisiert. Der Zweck des Aufbrechens
bzw. Aufschließens
oder Homogenisierens der Zellen ist es, GHA aus den Zellen freizusetzen.
Eine Vielfalt von Wegen zum Aufbrechen oder Homogenisieren von Zellen
diversen Ursprungs ist auf dem Fachgebiet bekannt, z. B. Kugelmühlen, osmotischer
Schock, Gefrierbruch. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung
wird die Quelle durch Verwendung eines „Microfluidizers" aufgebrochen oder
homogenisiert. In einem bevorzugten Aspekt wird ein Hochdruckhomogenisator
(z. B. ein Niro) verwendet. Falls das Protein oder Polypeptid aus
den Zellen, in denen es synthetisiert wird, sekretiert bzw. sezerniert
wird, müssen
die Zellen nicht lysiert werden, sondern das Protein oder Polypeptid
kann aus der extrazellulären
Flüssigkeit
oder aus dem Kulturmedium extrahiert werden, z. B. wird das phasenbildende
Mittel direkt in den Fermenter gegeben.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann das Protein aus Zellen, einem Zellhomogenat, aufgebrochenen
Zellen, einem rohen Gemisch, erhalten nach chemischer Synthese des
Proteins, oder einem einer beliebigen Art von Gemisch, das das interessierende
Protein und Kontaminanten enthält,
sodass eine Reinigung des Proteins wünschenswert ist, gereinigt
werden. In einem Aspekt der Erfindung wird das Protein aus einem rohen Gemisch
gereinigt, indem Reagenzien, die zur Bildung eines wässrigen
Mehrphasensystems, wie z. B. ein Zwei-Phasen-System, fähig sind,
zugegeben werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Extraktionsgemisch
gerührt,
um die phasenbildenden Mittel zu lösen und um das System gründlich zu
mischen. Das resultierende Extraktionsgemisch wird bearbeitet, um
verschiedene bzw. getrennte Phasen zu bilden, wovon eine eine Anreicherung
des Proteins enthält.
Eine derartige Bearbeitung kann bewerkstelligt werden, indem beispielsweise
das Extraktionsgemisch zentrifugiert wird oder indem das Gemisch
für mehrere
Stunden ungestört
abstehen gelassen wird (Sedimentieren oder Koaleszieren bei 1× Erdbeschleunigung)
oder beispielsweise durch temperaturinduzierte Phasentrennung (Persson
et al., 1998, J. of Chromatography 711: 97–109). In einem weiteren Aspekt
kann, sobald sich verschiedene Phasen gebildet haben, die Phase,
die eine Anreicherung des Proteins enthält, d. h. typischerweise die
obere leichte Phase, entfernt werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird, nach Entfernung der Phase, die das
Protein enthält,
die Phase, die das Protein nicht in angereicherter Form enthält, reextrahiert
(„zweistufige Extraktion"). Reextraktion kann
durchgeführt
werden, indem eine Lösung,
enthaltend ein phasenbildendes Mittel, das zur Bildung einer zweiten
leichten Phase fähig
ist, zugegeben wird, sodass es eine Phase in der Reextraktion, die
mit dem Protein angereichert ist, bilden wird. In einem weiteren
Aspekt wird das Extraktionsgemisch während der zweistufigen Extraktion
gerührt,
um die phasenbildenden Mittel zu lösen und um das System gründlich zu
mischen. Das resultierende Reextraktionsgemisch wird bearbeitet,
um verschiedene Phasen, von denen eine das angereicherte Protein
enthält,
zu bilden. Eine derartige Bearbeitung kann z. B. bewerkstelligt
werden durch Zentrifugieren des Reextraktionsgemischs oder beispielsweise
durch temperaturinduzierte Phasentrennung (Persson et al. supra)
oder indem ei ne Koaleszenz der Phasen unter 1× Erdbeschleunigung ermöglicht wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die phasenbildenen Reagenzien direkt zu dem rohen Gemisch,
das das Protein enthält,
zugegeben. Die phasenbildenden Reagenzien sind zur Bildung eines
Mehrphasensystems fähig,
gekennzeichnet durch ein Ergebnis, dergestalt, dass das Protein
in einer Phase des Mehrphasensystems angereichert ist, wohingegen
die Mehrheit der verbleibenden Komponenten des rohen Gemischs nicht
in der genannten einen Phase akkumuliert. Bevorzugter ist das Mehrphasensystem
durch ein Ergebnis gekennzeichnet, dergestalt, dass das Protein
in einer Phase des Mehrphasensystems angereichert ist, wohingegen
im Wesentlichen alle der verbleibenden Komponenten des rohen Gemischs
in den anderen Phasen sind.
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5.2.1. Phasenbildende Mittel die für eine Reinigung
durch wässrige
Zwei-Phasen-Extraktion verwendbar sind
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Eine
Vielfalt von Reagenzien, die zur Bildung eines Mehrphasensystems
und vorzugsweise eines Zweiphasensystems fähig sind, kann verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung werden PEG 4600 und Ammoniumsulfat
als phasenbildende Mittel zum Erzeugen von zwei Phasen verwendet.
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Für die Ausführung der
vorliegenden Erfindung kann die Konzentration der phasenbildenden
Mittel variiert werden. Die Konzentration der Mittel wird, sofern
nicht anders angegeben, durchwegs in Gewicht des Mittels pro Volumen
der gesamten Mehrphasen-(oder Zweiphasen-)Lösung angegeben. In einem Aspekt
beträgt die
Konzentration des phasenbildenden Polymers von etwa 4% bis etwa
18%, bevorzugt davon etwa 6% bis etwa 15%, stärker bevorzugt von etwa 8%
bis etwa 13% und am stärksten
bevorzugt von etwa 10% bis etwa 12%. In einem weiteren Aspekt beträgt die Konzentration
des phasenbildenen Salzes von etwa 4% bis etwa 18%, bevorzugt davon
etwa 6% bis etwa 15%, stärker
bevorzugt von etwa 8% bis etwa 13% und am stärksten bevorzugt von etwa 10%
bis etwa 12%.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Puffer zu dem Extraktionsgemisch,
das z. B. ein Zelllysat und die phasenbildenden Mittel enthält, gegeben,
z. B. ein Trispuffer, ein Phosphatpuffer, ein MES-Puffer, ein HEPES-Puffer
oder ein Citratpuffer. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Trispuffer
verwendet. Der pH der Pufferlösung
beträgt
allgemein von etwa 5 bis etwa 9, bevorzugter von etwa 6 bis etwa
8, stärker
bevorzugt von etwa 6,5 bis etwa 7,5 und am stärksten bevorzugt etwa 7.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann ein Salz zu dem Extraktionsgemisch gegeben werden, z. B. ein
Salz eines einwertigen Kations, z. B. Natrium, Kalium, Lithium oder
Caesium, oder eines zweiwertigen Kations, z. B. Magnesium, Calcium.
Das Anion des Salzes kann einwertig sein, z. B. Chlorid, Nitrat,
Iodid, Thiocyanat. In einem bevorzugten Aspekt ist das Salz Natriumchlorid.
Die Konzentration des Salzes im Extraktionsgemisch beträgt von etwa
10 mM bis etwa 1000 mM, bevorzugt von etwa 30 mM bis etwa 700 mM,
bevorzugt von etwa 50 mM bis etwa 400 mM, bevorzugt etwa 70 mM bis
etwa 200 mM und am stärksten
bevorzugt etwa 100 mM. Das Salz kann zu einem beliebigen Zeitpunkt
während
der Verfahrensweise zu dem Extraktionsgemisch gegeben werden, z.
B. vor Zugabe der phasenbildenden Mittel, nach Zugeben von einem
oder mehr als einem phasenbildenden Mittel oder als Teil der Pufferlösung. Zum
Hintergrund der Verwendung eines Salzzusatzes in der Zwei-Phasen-Extraktionsreinigung,
siehe z. B. Boris Y. Zaslavsky, Aqueous Two-Phase Partitioning:
Physical Chemistry and Bioanalytical Applications (Marcel Dekker,
Inc., New York 1995).
-
Eine
Zentrifugation zur Bildung der Phasen wird allgemein bei Temperaturen
von etwa 10 Grad Celsius („°C") bis etwa 40°C, bevorzugter
bei von etwa 15°C
bis etwa 35°C,
stärker
bevorzugt bei von etwa 20°C
bis etwa 30°C
und am bevorzugtesten bei etwa 25°C
durchgeführt.
-
Die
Extraktionsverfahren der vorliegenden Erfindung werden allgemein
mit einem Ausgangsvolumen an Extraktionsgemisch von weniger als
etwa 10 Litern durchgeführt.
In einer weiteren Ausführungsform
beträgt das
Extraktionsgemischvolumen mehr als etwa 10 Liter und weniger als
etwa 100 Liter. In noch einer weiteren Ausführungsform beträgt das Extraktionsgemischvolumen
mehr als etwa 100 Liter.
-
Die
nach Zwei-Phasen-Extraktion erhaltenen Ausbeuten können, wenn
ein Protein oder Polypeptid unter Verwendung des Verfahrens der
vorliegenden Erfindung gereinigt wird, in Gramm pro 1000 Liter Zellkultur
ausgedrückt
werden. Zum Beispiel beträgt,
wenn ein Protein aus einer Kultur von E. coli unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Verfahren
gereinigt wird, die Ausbeute pro 1000 Liter Zellkultur wenigstens
etwa 100 g, bevorzugt wenigstens etwa 200 g, bevorzugter wenigstens
etwa 300 g, stärker
bevorzugt wenigstens etwa 400 g, stärker bevorzugt wenigstens etwa
500 g, stärker
bevorzugt wenigstens etwa 600 g und am stärksten bevorzugt wenigstens
etwa 700 g.
-
5.3. Detektion und Reinheit des Proteins
nach Reinigung mit wässriger
Zwei-Phasen-Extraktion
-
Nach
der Extraktionsreinigung kann das Protein in der aus dem Extraktionssystem
entfernten Phase detektiert werden. Zum Beispiel kann das Protein
mittels einer Vielfalt von Verfahren einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf,
Bioassays, HPLC, Aminosäurebestimmung
oder immunologische Assays, z. B. Radioimmunassay, ELISA, Westernblot
unter Verwendung von Antikörperbindung,
SDS-PAGE, detektiert werden. Derartige Antikörper umfassen, ohne Beschränkung darauf,
polyclonale Antikörper,
monoclonale Antikörper (mAbs),
humanisierte oder chimere Antikörper,
Einzel kettenantikörper,
Fab-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, Fragmente, die durch eine Fab- Expressionsbank produziert
werden, und Epitop-bindende Fragmente eines beliebigen der oben
stehenden.
-
Die
Menge des gereinigten Proteins und deren Grad der Reinheit können mittels
Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, festgestellt werden.
Zum Beispiel, und nicht zum Zwecke der Einschränkung, kann man eine Proteinformulierung,
die unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zubereitet
bzw. hergestellt wurde, mit Polyacrylamidgelelektrophorese, gefolgt
von Färbung
des Gels zum Visualisieren des Gesamtproteins im Gel, untersuchen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Ausbeute und Reinheit des Proteins nach Zwei-Phasen-Extraktion
unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC festgestellt.
-
Die
Reinheit einer Formulierung eines Proteins oder Polypeptids, zubereitet
bzw. hergestellt unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden
Erfindung, kann in Abhängigkeit
vom Ausgangsmaterial variieren. Wenn z. B. ein Protein, das in E.
coli exprimiert wird, gereinigt wird, enthält die resultierende Zubereitung
wenigstens etwa 40 Gew.-% des interessierenden Proteins oder Polypeptids,
bevorzugter wenigstens etwa 50%, stärker bevorzugt wenigstens etwa
60%, stärker
bevorzugt wenigstens etwa 70% und am stärksten bevorzugt wenigstens
etwa 80%.
-
5.4. Bearbeitung des Proteins nach Reinigung
mit wässriger
Zwei-Phasen-Extraktion
-
Die
unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erhaltene
Protein- oder Polypeptidzubereitung kann weiter bearbeitet werden,
z. B. um das Protein oder Polypeptid mit einem höheren Reinheitsgrad bereitzustellen.
Eine derartige höhere
Reinheit kann in Abhängigkeit
von der Verwendung, für
die das Protein oder Polypeptid gedacht ist, erforderlich sein.
Z. B. werden therapeutische Verwendungen des Proteins typischerweise
eine weitere Reinigung nach den Extraktionsverfahren der Erfindung
erfordern.
-
Alle
Proteinreinigungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können zur
weiteren Reinigung verwendet werden. Derartige Techniken sind umfangreich
in Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods
in Enzymology, Band 152, Academic Press, San Diego, CA (1987); Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Sambrook. J., Fritsch,
E. F. and Maniatis, T. (1989); Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons,
alle Bde., 1989 und regelmäßigen Aktualisierungen
davon; New Protein Techniques: Methods in Molecular Biology, Walker,
J. M., Hrsg., Humana Press, Clifton, N. J., 1988; und Protein Purification:
Principles and Practice, 3. Ausgabe, Scopes, R. K. Springer-Verlag,
New York, N. Y., 1987, beschrieben worden. Im Allgemeinen können Techniken
einschließlich,
aber ohne Beschränkung
darauf, Ammoniumsulfatfällung,
Zentrifugation, Innenaustausch-, Gelfiltrations-, Umkehrphasenchromatographie
(und die HPLC- oder FPLC-Formen davon) und hydrophobe Interaktionschromatographie
zum weiteren Reinigen des Proteins verwendet werden.
-
Die
folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung
weiter zu erläutern,
werden jedoch nicht bereitgestellt, um den Rahmen der vorliegenden
Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
-
6. BEISPIEL: REINIGUNG VON REKOMBINANTEM
WACHSTUMSHORMONANTAGONISTEN MITTELS WÄSSRIGER ZWEI-PHASEN-EXTRAKTION
-
6.1. Materialien und Methoden
-
Die
phasenbildenden Mittel umfassten Polyethylenglykol („PEG"), ein Salz und einen
Puffer. Die Konzentration der Mittel wird durchwegs in Gewicht des
Mittels pro Gewicht der gesamten Mehrphasen-(oder Zweiphasen-)Lösung angegeben,
so fern nicht anders angegeben. PEG wurde von Aldrich (PEG 2000 und PEG
8000) oder Union Carbide (PEG 4600, Sentri-Qualität) erhalten.
Tris-Puffer und Ammoniumsulfat wurden von J. T. Baker (Phillipsburg,
N. J.) erhalten. HPLC wurde auf einem Hewlett Packard 1090-Chromatographiesystem
durchgeführt.
Eine Homogenisierung von Zellkulturen wurde mit einem Microfluidizer
vom Typ Microfluidics M110Y oder M-210EH oder einem Homogenisator
vom Typ Alfa-Laval Niro durchgeführt.
-
6.1.1. Allgemeine Extraktionsverfahrensweise
-
Sofern
in den untenstehenden Ergebnissen nicht anders angegeben, wurden
Escherichia coli-Zellen unter Verwendung von Hochdruckhomogenisierung
der Zellen direkt von der Kulturbrühe weg (die EDTA enthielt)
oder nach Zentrifugation lysiert. Nach der Zentrifugation wurden
die Zellen gefroren und bei minus 20°C oder minus 70°C gelagert.
Das gefrorene Zellpellet wurde resuspendiert und homogenisiert.
Das Zelllysat wurde in einen gerührten
Tank eingegeben und phasenbildende Mittel wurden zugegeben, um das
gewünschte Endsystem
zu erhalten (1).
-
Als
ein Beispiel für
die obige Verfahrensweise würde
ein System von 10% Ammoniumsulfat und 10% PEG 4600 erhalten werden
durch Zugeben von 1 Liter 1 M Trispuffer, pH 7,4, 1 kg Ammoniumsulfat
und 1 kg PEG in beliebiger Reihenfolge zu 7 Litern Lysat. Das Gemisch
wurde gerührt
bis alle Mittel gelöst
waren, gefolgt von Zentrifugation zum Trennen der Phasen. GHA und
das Kontaminantenprofil der resultierenden Phasen werden mittels
SDS-PAGE-Analyse und Umkehrphasen-HPLC bestimmt. Die schwere, salzreiche
Phase kann reextrahiert werden, indem eine PEG-Lösung zugegeben wird und indem
die Stufen des Rührens
und der Zentrifugation wiederholt werden. Die zur Reextraktion zugegebene
PEG-Lösung
kann eine Konzentration von 30% bis 40% PEG haben, siehe 1.
-
Es
wurde festgestellt, dass verschiedene Parameter die Handhabbarkeit
(„operability") und die Ausbeute
der Extrakti onsverfahrensweise beeinflussen. Zu diesen Parametern
zählen
der Typ und die Konzentration von PEG, der Typ und die Konzentration
von Salz, der pH des Systems, das Vorhandensein von Komponenten
der Kulturmedien und bakterieller Debris.
-
Die
Ausbeute der Verfahrensweise kann maximiert werden, indem eine Anzahl
der vorstehend genannten Parameter angepasst wird. Erstens kann
das Volumenverhältnis
der Phasen, d. h. das Volumen der Phasen relativ zueinander, variiert
werden, ohne den Verteilungskoeffizienten des Proteins zu verändern. Wie in 2 gezeigt, können die PEG- und Salzkonzentrationen
entlang der Verbindungslinie angepasst werden, ohne den Verteilungskoeffizienten
des Proteins in entweder der salzreichen Phase oder der PEG-reichen
Phase zu ändern.
Somit kann man die Ausbeute des Proteins erhöhen, indem das System näher zu Punkt
a, siehe 2, gebracht wird. Zweitens
kann man die Konzentrationen von PEG und Salz zu einer anderen Verbindungslinie
verschieben, auf der das Protein einen anderen bzw. verschiedenen
Verteilungskoeffizient für
die Phasen haben wird. Drittens kann man, nach der anfänglichen
Extraktion und nach Entfernung der PEG-reichen Phase, die Phase,
die reich an Zelldebris ist, reextrahieren, indem eine PEG-Lösung in
Wasser oder Puffer mit einer Konzentration von 30–40% zugegeben
wird, gefolgt von Rühren,
Zentrifugation und Entfernung der PEG-reichen Phase, wie in der
ersten Extraktion durchgeführt.
-
Es
wurde festgestellt, dass die Phasentrennung in einem Zwei-Phasen-System,
das PEG und Ammoniumsulfat umfasst, empfindlich gegenüber der
Temperatur während
der Zentrifugationsstufe, in der die Bildung der Phasen erwartet
wurde, war. Während
die Phasen durch Zentrifugation um 4°C selten gebildet wurden, trat
eine Phasentrennung bei Temperaturen im Bereich von etwa 20°C bis etwa
30°C leicht
auf.
-
Beim
Isolieren von rGHA unter Verwendung der beschriebenen Extraktionsverfahrensweisen
wurde festgestellt, dass rGHA ausfiel bzw. präzipitierte, wenn es in der
PEG-reichen Phase gehalten wurde. Dieses Problem wurde durch Verdünnen der
Phase mit Wasser nach ihrer Entfernung vom Rest des Extraktionssystems
vermieden. Verdünnungsfaktoren
von bis zu 5-fach wurden als nützlich
und wirksam beim Verhindern der rGHA-Präzipitation
gefunden.
-
Beim
Isolieren von rGHA war es wichtig, Schaumbildung bzw. Schäumen zu
vermeiden, da beide Proteine gegenüber Flüssigkeit-Luft-Grenzflächen empfindlich
erschienen.
-
6.2. Extraktion von rGHA unter Verwendung
verschiedener Bedingungen
-
Gereinigter
humaner rekombinanter GHA wurde isoliert, wobei das Zwei-Phasen-Extraktionsverfahren mit
verschiedenen Mitteln bei verschiedenen pH-Werten verwendet wurde.
Die verwendeten phasenbildenden Mittel waren PEG, Ammoniumsulfat
und Trispuffer. PEG wurde in drei verschiedenen Molekulargewichten,
d. h. 2000, 4600 und 8000 Dalton, verwendet. Für jeder dieser Molekulargewichtsversionen
betrug die Konzentration an PEG im Extraktionsgemisch 15%. Ammoniumsulfat
wurde in einer Konzentration von 15% im Extraktionsgemisch verwendet.
Trispuffer wurde als eine 1 M-Lösung
verwendet und in einer Konzentration von 100 mM im Extraktionsgemisch
verwendet. Der pH-Wert für
den verwendeten Trispuffer war 6,0 oder 8,0.
-
Nachdem
die phasenbindenden Mittel zu der gereinigten GHA-Lösung gegeben
waren, wurde das resultierende Gemisch gerührt und in einer Kleinzentrifuge
(„microfuge") bei einer Geschwindigkeit
von 14000 UpM 5 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach
der Zentrifugationsstufe wurde die PEG-reiche obere Phase entfernt
und die Phasen wurden mittels Umkehrphasen-HPLC analysiert. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Verteilung von rekombinantem
GHA in Zweiphasensystemen mit 15% PEG und 15% Ammoniumsulfat
| PEG | pH | Phasenvol. oben
(ml) | Phasenvol.
unten (ml) | rGHA-Konz. oben (mg/ml) | rGHA-Konz. unten (mg/ml) |
| 2000 | 8,0 | 0,35 | 0,5 | 0,643 | LOD1 |
| 2000 | 6,0 | 0,35 | 0,5 | 0,634 | LOD1 |
| 4600 | 8,0 | 0,25 | 0,6 | 0,675 | LOD1 |
| 4600 | 6,0 | 0,25 | 0,6 | 0,673 | LOD1 |
| 8000 | 8,0 | 0,25 | 0,6 | 0,570 | LOD1 |
| 8000 | 6,0 | 0,30 | 0,5 | 0,557 | LOD1 |
- 1 LOD: Detektionsgrenze,
d. h. unter Verwendung der beschriebenen Mittel wurde kein rGHA
detektiert.
-
Die
in Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse zeigen, dass die Extraktion
bei pH 6 und 8 gleichermaßen effizient
war. Unter den untersuchten verschiedenen PEG-Formen wurden die
besten Ergebnisse mit PEG des Molekulargewichts 4600 Dalton gemäß der Erfindung
erhalten.
-
6.3. Verteilungseigenschaften von hGH
(Referenzbeispiel)
-
Der
Verteilungskoeffizient von hGH in einem Zweiphasensystem, worin
PEG und Ammoniumsulfat verwendet wurden, wurde festgestellt. Die
Zusammensetzung des Gemisches war 10% PEG 4600, 10% Ammoniumsulfat
und 100 mM Trispuffer mit pH 7,2. In einigen Assays umfasste das
System auch 100 mM NaCl. Lyophilisiertes hGH wurde in Wasser zu
einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst.
-
Ein
Extraktionsexperiment wurde durchgeführt, indem in einem Eppendorf-Röhrchen 20 μl der hGH-Stammlösung, 380 μl Wasser,
100 μl 1
M Trispuffer mit pH 7,2, 250 μl
einer 40%igen PEG 4600-Lösung und
250 μl einer
40%igen Ammoniumsul fatlösung
gemischt wurden. Nach gründlichem
Mischen wurde die Lösung
in einer Kleinzentrifuge bei 14000 UpM oder 13000 × g zentrifugiert.
Die Konzentration an hGH in der oberen und unteren Phase wurde anschließend mittels
Umkehrphasen-HPLC festgestellt. Tabelle 2: Verteilung von humanem GH in
einem Zwei-Phasen-System
mit 10% PEG und 10% Ammoniumsulfat
| verwendeter
Puffer*: | Durchgang #: | obere
Phase: hGH (mg/l) | obere
Phase: Volumen (μl) | untere
Phase: hGH (mg/l) | untere
Phase: Volumen (μl) | Verteilungskoeffizient |
| Tris.
HCl | 1 | 233,1 | 350 | 13,11 | 600 | 10,37 |
| Tris.
HCl | 2 | 235,8 | 400 | 8,06 | 600 | 19,5 |
| Tris | 1 | 231,1 | 400 | 8,57 | 600 | 17,9 |
| Tris | 2 | 243,7 | 400 | 6,59 | 600 | 24,6 |
| Tris.
NaCl | 1 | 243,9 | 400 | 5,81 | 600 | 28,0 |
| Tris.
NaCl | 2 | 258,6 | 400 | 5,61 | 600 | 30,7 |
- *: Tris. HCl: 1 M TRIS-HCl, pH 7,2
Tris:
1 M TRIS-Base, pH 7,2
Tris. NaCl: 1 M TRIS-Base, 100 mM NaCl,
pH 7,2
-
Die
in Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse zeigen, dass sich hGH bevorzugt
in die PEG-reiche Phase des Extraktionssystems verteilte.
-
6.4. Extraktion von rGEA aus Hitze-abgetöteter gefrorener
Zellpaste
-
Eine
Hitze-abgetötete
gefrorene E. coli-Zellpaste wurde in 10 Volumina 0,02 M Trispuffer
bei pH 7,65, enthaltend 5 mM EDTA, suspendiert, z. B. wurden 10
mL Puffer zum Suspendieren von 1 g gefrorener Zellpaste verwendet.
Die Zellen wurden mittels eines Durchgangs der Homogenisierung bei
13000 bis 15000 psi lysiert, was zum Aufbrechen von über 95%
der Zellen führte,
wie mittels Überprüfung des
Lysats mit einem Mikro skop festgestellt. PEG des Molekulargewichts
4600 und Ammoniumsulfat wurden zu einer Endkonzentration von jeweils
15% zugesetzt, gefolgt von gründlichem
Mischen und schließlich
Zentrifugation bei 5000 UpM oder 7280 × g für 30 Minuten bei 25°C. Obgleich
die obige Verfahrensweise eine bessere Leistung als bei Verwendung
von PEG der Molekulargewichte 2000 oder 8000 aufwies, wurde festgestellt,
dass Zelldebris nicht wirksam sedimentierte und sich die Phasen
schlecht trennten.
-
Um
die Reinigung des Proteins zu verbessern, wurde eine geringere Konzentration
an PEG oder Ammoniumsulfat oder beidem als Ersatz im obigen Protokoll
verwendet. Die Konzentrationen, die zur Extraktion von rGHA am nützlichsten
waren, waren 6–10%
PEG und 10–12%
Ammoniumsulfat.
-
Nach
der Zentrifugation in der obigen Extraktionsverfahrensweise traten
zwei flüssige
und zwei feste Phasen auf, von denen die obere klare Phase eine
Anreicherung an rGHA enthielt. SDS-PAGE Analyse zeigte eine signifikante
Menge von mit dem Zelldebris in die untere Phase sedimentierten
rGHA.
-
6.5. Extraktion von rGHA aus lebend gefrorenen
Zellen
-
Lebend
gefrorene E. coli-Zellen („live
frozen E. coli cells")
wurden hergestellt, indem kultivierte Zellen bei 5000 UpM, 7280 × g, für 30 Minuten
bei 4°C
zentrifugiert und das Zellpellet in einen verschließbaren Beutel zum
Gefrieren bei minus 70°C überführt wurden.
Die Extraktionsverfahrensweise wurde durchgeführt, wie in Abschnitt 6.4.,
supra, beschrieben. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4
zusammengefasst. Alle in den Tabellen 3 und 4 gezeigten Daten wurden
mit einer einzelnen Extraktion, d. h. ohne eine zweite oder weitere Extraktion
der schweren Zelldebris-reichen Phase, erhalten. Tabelle 3: Gewinnung von rekombinantem
GHA aus lebend gefrorenen Zellen unter Verwendung einer Zwei-Phasen-Extraktion
| Maßstab (Gesamtgewicht
des Systems) | PEG
4600 (%) | Ammoniumsulfat
(%) | rGHA,
leichte Phase (μg/ml) | Gesamt-rGHA, leichte Phase
(mg) | rGHA, schwere Phase (μg/ml) | Gesamt-rGHA, schwere Phase
(mg) |
| 30
g | 6 | 12 | 2291 | 11,4–13,7 | 227 | 4,5–5,7 |
| 30
g | 10 | 10 | 1608 | 16,1 | 196 | 3,5 |
| 30
g | 8 | 10 | 1697 | 15,2 | 275 | 5,5 |
| 15
g | 10 | 10 | 1736 | 7,81 | 171 | 1,54 |
| 15
g | 8 | 10 | 1726 | 6,9 | 254 | 2,41 |
Tabelle 4: Verteilungskoeffizient von
rekombinantem GHA in der Zwei-Phasen-Extraktion aus lebend gefrorenen
Zellen
| Maßstab (Gesamtgewicht des
Systems) | PEG
4600 (%) | Ammoniumsulfat
(%) | %
lösliches rGHA
in der leichten Phase | %
lösliches rGHA
in der schweren Phase | Verteilungskoeffizient |
| 30
g | 6 | 12 | 67–75,3 | 24,7–33 | 10,1 |
| 30
g | 10 | 10 | 82 | 18 | 8,2 |
| 30
g | 8 | 10 | 73 | 27 | 6,1 |
| 15
g | 10 | 10 | 83 | 17 | 10,1 |
| 15
g | 8 | 10 | 74 | 26 | 6,8 |
-
Die
Ausbeute der obigen Verfahrensweise wurde durch eine zweite Extraktion
der schweren Phase, die reich an Zelldebris ist, erhöht. Eine
zweistufige Extraktion wurde durchgeführt, indem eine erste Extraktion mit
8% PEG 4600 und 10% Ammoniumsulfat durchgeführt wurde. Der Maßstab, in
dem die Versuche durchgeführt
wurden, d. h. das Gesamtgewicht des Systems, waren 30 g für die erste
Extraktion und 15 g für
die zweite Extraktion. Eine Reextraktion wurde durchgeführt, indem
eine 40%ige PEG-Lösung
in Wasser zu der schweren Phase gegeben wurde, nachdem die leichte
Phase der ersten Extraktion entfernt worden war. Anschließend wurde
das Gemisch gerührt
und bei 5000 UpM, 7280 × g,
für 30
Minuten bei 25°C
zentrifugiert. Tabelle 5 gibt die Ergebnisse der zweistufigen Extraktionsverfahrensweise,
die oben beschrieben ist, an. Die Verfahrensweise wurde mit rohem
Homogenat direkt nach Homogenisierung und mit dem Überstand
des Homogenats nach Zentrifugation durchgeführt. Tabelle 5: Zweistufige Extraktion von
rekombinantem GHA aus lebend gefrorenen Zellen unter Verwendung von
Zwei-Phasen-Extraktion
| Versuch | obere
Phase 1: rGHA (μg/ml) | obere
Phase 1: Gesamt-rGHA (mg) | obere
Phase 2: rGHA (μg/ml) | obere
Phase 2: Gesamt-rGHA (mg) | untere
Phase: rGHA (μg/ml) | untere
Phase: Gesamt-rGHA (mg) |
| rohes
Lysat | 1717 | 15,4 | 680 | 7,14 | 155 | 2,79 |
| Lysat-Überstand | 1306,5 | 5,88 | 687 | 3,43 | 171 | 1,2 |
| | % Gesamt-rGHA | % Gesamt-rGHA | % Gesamt-rGHA |
| rohes
Lysat | 61 | 28 | 11 |
| Lysat-Überstand | 56 | 33 | 11 |
-
Die
Ausbeuten an rekombinantem GHA unter Verwendung der zweistufigen
Zwei-Phasen-Extraktionsverfahrensweise waren bis zu etwa 4,6 mg
rGHA pro Gramm lebend gefrorener Zellpaste. Zubereitungen von rekombinantem
GHA, erhalten mit der zweistufigen Zwei-Phasen-Extraktionsverfahrensweise,
wurden durch Umkehrphasen-HPLC-Analyse der rGHA-reichen leichten
Phase und der Zelldebris-reichen schweren Phase auf Reinheit untersucht.
Die für
derartige Extraktionen typischen Ergebnisse sind in den 3A–3C dargestellt.
-
6.6. Extraktion von rGEA aus lebenden
Zellen
-
Kultivierte
E. coli-Zellen wurden geerntet, vereinigt und mittels eines Durchgangs
der Microfluidisierung bei 14000 psi lysiert. Das resultierende
Zelllysat wurde in der Extraktionsverfahrensweise verwendet, indem
3 Liter 1 M Trispuffer mit pH 7,2, 3 kg Ammoniumsulfat und 3 kg
PEG 4600 zu 21 Litern Lysat gegeben wurden. Das resultierende Gemisch
wurde gründlich
gemischt und dann bei 5000 UpM für
30 Minuten bei 25°C zentrifugiert.
Die obere Phase wurde abgenommen und die untere Phase wurde mit
6 Litern einer 40%igen Lösung
von PEG 4600 in Wasser reextrahiert. Nach dem Mischen und Zentrifugieren
wie für
die erste Stufe wurde die zweite obere Phase entfernt und mit der
ersten oberen Phase vereinigt. Die Ausbeute an rGHA-Proteinen betrug
22,3 g oder 1,06 g rGHA pro Liter Ausgangszellkultur.
-
6.7. Extraktionsreinigung unter Verwendung
einer kontinuierlichen Zentrifugation in mittlerem Maßstab
-
Eine
kontinuierliche Tellerstapelzentrifuge vom Typ Alfa Laval LAPX 202
wurde verwendet, um die Zwei-Phasen-Extraktion in einem mittleren
Maßstab
anzuwenden. Die Zentrifuge wurde als Reinigungsgerät („purifier") mit einer Zuführung, zwei
Flüssigkeitsaustritten
und axialem Feststoffausstoß modifiziert.
Die Zentrifuge wurde mit einer geschwindigkeitsvariablen Peristaltikpumpe
gespeist. Die optimale Zufuhrrate betrug etwa 450 ml/Minute wenn
ein 52 mm-„gravity
ring” verwendet
wurde. Es wurde festgestellt, dass ein Entleerungsintervall von
15 bis 20 Minuten hinreichend ist. Nach Zentrifugation bei 10000
UpM oder 8200 × g
enthielt die mit dem LAPX 202 gewonnene obere Phase weniger als
5% an Kontaminanten der unteren Phase. Eine zweistufige Extraktion
wurde durchgeführt,
indem die untere Phase mit einem halben Volumen der unteren Phase
unter Verwendung einer 33%igen Lösung
von PEG 4600 reextrahiert wurde.
-
Die
Ausbeute aus 20 Litern Kultur betrug 25,2 g rGHA oder 1,26 g/L Kultur.
21,7 g oder 86,3% des Proteins wurden während der ersten Extraktion
gewonnen und die verbleibenden 3,4 g oder 13,7% wurden während der
zweiten Extraktion erhalten.
-
6.8. Extraktionsreinigung unter Verwendung
von kontinuierlicher Zentrifugation in großem Maßstab
-
Eine
Tellerstapelzentrifuge vom Typ Alfa Laval BPTX 205, ausgestattet
mit einem Umwandlungskit zum Reinigungsgerät („purifier conversion kit") wurde verwendet,
um eine Zwei-Phasen-Extraktion
in großem Maßstab, d.
h. einem etwa 10-fachen
Scale-up, verglichen mit der Verfahrensweise in mittlerem Maßstab, durchzuführen. Es
wurde festgestellt, dass die zweckdienliche Zufuhrrate etwa 3–5 L/Minute
beträgt.
Eine Extraktion in großem
Maßstab
wurde durchgeführt
mittels Homogenisierung der Fermentationsbrühe oder der suspendierten Zellen
unter Verwendung des Niro-Homogenisators bei 13000 bis 15000 psi,
gefolgt von Zugabe, in der aufgeführten Reihenfolge, von 100
Litern 1 M Trispuffer mit pH 7,2, 100 kg Ammoniumsulfat und 100 kg
PEG 4600 zu 700 Litern Lysat. Die Lösung wurde gründlich gemischt
und bei 9600 UpM oder 12700 × g zentrifugiert.
Das Protein wurde aus der PEG-reichen Phase gewonnen.
-
Die
Ausbeute in einer einstufigen Extraktion, d. h. ohne Durchführung einer
Reextraktion, betrug etwa 700 g bis etwa 1000 g rGHA pro 1500 L
Fermentationsbrühe.