CN114957494A - 一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺，包括以下步骤：S1、精选优质黄精；S2、通过电子天平称取10g黄精粉末，然后将称取的10 g黄精粉末加入到500 mL具塞锥形瓶中，然后向500 mL具塞锥形瓶中加入200 mL的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，并搅拌均匀；S6、黄精水提液中蛋白质的萃取：通过UV‑1800PC‑DS2型紫外可见分光光度计测定3次取样的吸光度，得吸光度平均值，然后通过考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量；本发明采用聚乙二醇（PEG）‑硫酸铵双水相体系将黄精多糖与蛋白质进行分离，通过响应曲面法进行优化，得到蛋白质最佳萃取参数，并且同浓度脱蛋白后的黄精多糖抗氧化能力优于未脱蛋白黄精多糖；本研究为高效开发黄精多糖食品和药品奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及黄精多糖中蛋白质提取技术领域，具体为一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺。
背景技术
黄精为百合科(Liliaceae)黄精属Polygonatum Mill，多年生草本植物的干燥根茎，属于药食同源中草药，主要分布于北亚热带和北温带。黄精除了具有补气养阴、润肺、益肾的作用，还具有抗衰老、降血压、调节免疫力等作用。黄精含有皂甙、多糖、生物碱等有效成分，多糖作为黄精的主要活性成分之一，具有抗氧化、降血脂以及提高机体免疫能力等药理作用，在食品、医疗等方面具有较好的研究前景。
国内多采用水浴醇沉法、超声辅助法等提取多糖，但普遍存在着在提取出多糖的同时，其他可溶性成分如蛋白质也会被提取出来；传统的sevege法、酶法、离子交换色谱法等多糖脱蛋白工艺复杂，效率不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺，包括以下步骤：
S1、精选优质黄精，然后将精选的黄精放入真空干燥箱内，通过真空干燥箱对黄精进行干燥处理，然后将干燥后的黄精加入到粉碎机中，通过粉碎机将黄精粉碎成粉末状，然后采用80目过滤筛将粉末状黄精中的大颗粒杂质过滤出，并将得到的黄精粉末密封贮藏，以备后续使用；
S2、通过电子天平称取10g黄精粉末，然后将称取的10g黄精粉末加入到500mL具塞锥形瓶中，然后向500mL具塞锥形瓶中加入200mL的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，并搅拌均匀；
S3、将500mL具塞锥形瓶放入HH-1数显恒温水浴锅，然后向500mL具塞锥形瓶中加入1.5％的纤维素酶和果胶酶，并将HH-1数显恒温水浴锅的温度调节至50℃，在50℃条件下，纤维素酶和果胶酶促进500mL具塞锥形瓶中的黄精粉末酶解；
S4、将酶解后的500mL具塞锥形瓶放入到超声波清洗器中，然后500mL 具塞锥形瓶在超声波清洗器中处理30分钟，然后依次经过热水浸提、抽滤，并收集滤液，从而得到黄精水提液，并在4℃条件下保存；
S5、精密移取2.00mL黄精水提液于100mL容量瓶内，然后加入清水定容至100mL，并测得蛋白质浓度，后续均采用该浓度的黄精水提液；
S6、黄精水提液中蛋白质的萃取：精密移取5.00mL步骤S5步骤中的黄精水提液于刻度离心管中，然后向刻度离心管中加入聚乙二醇PEG和不同浓度的(NH4)2SO4、KCl，并调节刻度离心管中黄精水提液的PH值，然后充分混合，接着将混合后的黄精水提液加入到离心机内，通过离心机离心10分钟，使得黄精水提液形成分相(上相和下相)，分别读取上相和下相的体积，测定上、下两相中多糖和蛋白质的浓度，平行3次取样，并通过UV-1800PC-DS2型紫外可见分光光度计测定3次取样的吸光度，得吸光度平均值，然后通过考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。
其中，在S1步骤中，所述真空干燥箱采用DZF-6050真空干燥箱，所述真空干燥箱的真空干燥温度为60℃。
其中，在S2步骤中，所述电子天平采用LE204E电子天平。
其中，在S2步骤中，所述磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液的PH值为5.0。
其中，在S3步骤中，所述纤维素酶与果胶酶质量比为1:1。
其中，在S4步骤中，所述超声波清洗器采用高功率数控超声波清洗器，所述超声波清洗器的工作功率为360W。
其中，在S6步骤中，所述离心机采用TDL-5-A低速台式大容量离心机，所述离心机的转速为2000r/min。
其中，在S6步骤中，所述考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量回归方程为 y＝0.1396x-0.0028(R2＝0.9981)。
其中，在S6步骤中，所述蛋白质的萃取率(E)、多糖回收率(Y)和相比(R)分别根据式(1)、式(2)和式(3)求得：
其中，Ct1和Cb1分别为萃取完全后蛋白质在上相(PEG相)和下相(硫酸铵相)中的浓度，Vt和Vb分别为双水相上相和下相的体积；Ct2和Cb2分别为萃取完全后多糖在上相(PEG相)和下相(硫酸铵相)中的浓度，Vt和 Vb分别为双水相上相和下相的体积。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用聚乙二醇(PEG)-硫酸铵双水相体系将黄精多糖与蛋白质进行分离，通过响应曲面法进行优化，得到蛋白质最佳萃取参数：黄精多糖溶液5.00mL，当液料比为18:1(mL/g)，(NH4)2SO4浓度16％，pH6.5，KCl浓度 1％时，蛋白质的萃取率82.78％，多糖回收率91.29％，在此工艺下，蛋白质萃取率和多糖回收率较酶法脱蛋白分别高出11.55％和4.99％；黄精多糖具有一定的抗氧化能力，但远远不及同浓度Vc的抗氧化能力，同浓度脱蛋白后的黄精多糖抗氧化能力优于未脱蛋白黄精多糖；本研究为高效开发黄精多糖食品和药品奠定了基础。
附图说明
图1为PEG/(NH4)2SO4双水相体系相图
图2为不同分子量PEG对蛋白质的萃取率影响
图3为PEG4000浓度对蛋白质萃取率的影响
图4为(NH4)2SO4浓度对蛋白质萃取率的影响
图5为pH对蛋白质萃取率的影响
图6为KCl浓度对蛋白质萃取率的影响
图7为pH值6.0，KCl溶液浓度0.5％时蛋白质萃取率
图8为(NH4)2SO4浓度18％，KCl溶液浓度0.5％时蛋白质萃取率
图9为(NH4)2SO4浓度18％，pH值6.0时蛋白质萃取率
图10为PEG4000浓度16％，KCl溶液浓度0.5％时蛋白质萃取率
图11为PEG4000浓度16％，pH值6.0时蛋白质萃取率
图12为PEG4000浓度16％，(NH4)2SO4浓度18％时蛋白质萃取率
图13为黄精多糖和Vc对DPPH自由基的清除作用
图14为黄精多糖和Vc对
的清除作用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例，请参阅图1-14，本发明提供如下技术方案：一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺，包括以下步骤：
S1、精选优质黄精，然后将精选的黄精放入真空干燥箱内，通过真空干燥箱对黄精进行干燥处理，然后将干燥后的黄精加入到粉碎机中，通过粉碎机将黄精粉碎成粉末状，然后采用80目过滤筛将粉末状黄精中的大颗粒杂质过滤出，并将得到的黄精粉末密封贮藏，以备后续使用；
S2、通过电子天平称取10g黄精粉末，然后将称取的10g黄精粉末加入到500mL具塞锥形瓶中，然后向500mL具塞锥形瓶中加入200mL的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，并搅拌均匀；
S3、将500mL具塞锥形瓶放入HH-1数显恒温水浴锅，然后向500mL具塞锥形瓶中加入1.5％的纤维素酶和果胶酶，并将HH-1数显恒温水浴锅的温度调节至50℃，在50℃条件下，纤维素酶和果胶酶促进500mL具塞锥形瓶中的黄精粉末酶解；
S4、将酶解后的500mL具塞锥形瓶放入到超声波清洗器中，然后500mL 具塞锥形瓶在超声波清洗器中处理30分钟，然后依次经过热水浸提、抽滤，并收集滤液，从而得到黄精水提液，并在4℃条件下保存；
S5、精密移取2.00mL黄精水提液于100mL容量瓶内，然后加入清水定容至100mL，并测得蛋白质浓度，后续均采用该浓度的黄精水提液；
S6、黄精水提液中蛋白质的萃取：精密移取5.00mL步骤S5步骤中的黄精水提液于刻度离心管中，然后向刻度离心管中加入聚乙二醇PEG和不同浓度的(NH4)2SO4、KCl，并调节刻度离心管中黄精水提液的PH值，然后充分混合，接着将混合后的黄精水提液加入到离心机内，通过离心机离心10分钟，使得黄精水提液形成分相(上相和下相)，分别读取上相和下相的体积，测定上、下两相中多糖和蛋白质的浓度，平行3次取样，并通过UV-1800PC-DS2型紫外可见分光光度计测定3次取样的吸光度，得吸光度平均值，然后通过考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。
其中，在S1步骤中，真空干燥箱采用DZF-6050真空干燥箱，真空干燥箱的真空干燥温度为60℃。
其中，在S2步骤中，电子天平采用LE204E电子天平。
其中，在S2步骤中，磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液的PH值为5.0。
其中，在S3步骤中，纤维素酶与果胶酶质量比为1:1。
其中，在S4步骤中，超声波清洗器采用高功率数控超声波清洗器，超声波清洗器的工作功率为360W。
其中，在S6步骤中，离心机采用TDL-5-A低速台式大容量离心机，离心机的转速为2000r/min。
其中，在S6步骤中，考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量回归方程为 y＝0.1396x-0.0028(R2＝0.9981)。
其中，在S6步骤中，蛋白质的萃取率(E)、多糖回收率(Y)和相比(R) 分别根据式(1)、式(2)和式(3)求得：
其中，Ct1和Cb1分别为萃取完全后蛋白质在上相(PEG相)和下相(硫酸铵相)中的浓度，Vt和Vb分别为双水相上相和下相的体积；Ct2和Cb2分别为萃取完全后多糖在上相(PEG相)和下相(硫酸铵相)中的浓度，Vt和 Vb分别为双水相上相和下相的体积。
其中，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，以吸光度(y)对蛋白质浓度(x)回归，得回归方程为y＝0.1396x-0.0028(R2＝0.9981)，表明在40～200 μg/mL浓度范围内，蛋白质浓度与其吸光度呈良好的线性关系。
其中，蛋白质萃取的影响因素主要包括聚乙二醇(PEG)浓度、(NH4)2SO4 浓度、KCl浓度、PH值，根据不同的影响因素进行对比试验，详细如下：
1、黄精多糖体外抗氧化活性测定。
1.1、DPPH自由基清除能力测定；
取等量相同浓度脱蛋白前、后的黄精多糖溶液，配制成0.40、0.80、1.20、 1.60、2.00、2.40mg/mL黄精多糖水溶液，备用。采用DPPH法，准确移取4 mL不同浓度的黄精多糖提取液于比色管中，加入预先配置好的2mL 0.15 mmol/L的DPPH甲醇溶液，摇匀后暗处放置30min，以样品溶剂为空白，测定其上清液515nm波长处吸光度A，同时测定样品溶液在515nm处的吸光度A0及DPPH甲醇溶液在515nm处的吸光度A1；以不同浓度的Vc作为阳性对照，平行测定3次。DPPH清除率公式如下所示：
1.2、超氧自由基(
)清除率测定，
取等量相同浓度脱蛋白前、后的黄精多糖溶液，将其配制0.40、0.80、1.20、 1.60、2.00、2.40mg/mL黄精多糖水溶液，备用。准确移取4mL不同浓度的黄精多糖提取液于试管中，依次加入0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.2) 4mL和20mmol/L的邻苯三酚溶液4mL，水平摇匀后，25℃水浴10min，加入4mL1％HCl溶液，于325nm处测定吸光度(Ax)，以相同体积蒸馏水作为空白对照，空白对照组吸光度A0，以不同浓度Vc作为阳性对照，平行测定3 次，
清除率公式如下所示：
其中，黄精多糖体外抗氧化活性测定结果如图1所示，曲线上的点为临界点，曲线下方属于单相区，曲线上方属于双相区。当PEG浓度一定时， (NH4)2SO4的浓度越低，越不容易分相。当PEG的相对分子量越大时，形成双水相的临界浓度越低。此相图为双水相萃取黄精多糖中的蛋白质提供理论依据。
2、单因素对蛋白质萃取率的影响试验
2.1、PEG相对分子量对蛋白质萃取率的影响；
准确量取黄精水提液5.00mL于5个刻度离心管中，称取相同质量的 PEG1500、PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000，固定PEG、(NH4)2SO4、KCl 浓度分别为16％、18％、0.5％，混合均匀，调pH值至6.0，摇匀，离心机转速设为2000r/min，离心10min；
其中，PEG相对分子量对蛋白质萃取率的影响结构如图2所示，当PEG分子量增大时，上相体积逐渐变大，下相体积逐渐变小，R由0.63增大至0.71，变化不大。而E和Y均先增大后减小，即在PEG4000双水相萃取系统中，蛋白质的萃取率和多糖的回收率均达到最高，故选择分子量为4000的PEG。
2.2、PEG4000浓度对蛋白质萃取率的影响；
准确量取黄精水提液5.00mL于5个刻度离心管中，固定(NH4)2SO4和KCl 浓度分别为18％和0.5％，加入不同浓度的PEG4000(12％、14％、16％、18％、20％)，混合均匀，调pH值至6.0，摇匀，离心机转速设为2000r/min，离心10min；
其中，PEG4000浓度对蛋白质萃取率的影响结构如图3所示，随着PEG4000 浓度的增加，R逐渐增大，E先增大后减小，Y变化不大，这是因为增加PEG4000 的浓度，会使成相物质总浓度增加，进而使萃取相极性变小，而蛋白质是具有部分极性的非极性物质，故其在萃取相中的溶解度增加，E增加；继续增加 PEG浓度，可能会导致溶液的黏度增大，阻碍相分子之间的转移，使下相中的蛋白质滞留在两相之间，导致E减小。因此，PEG4000的最佳浓度为18％。
2.3、(NH4)2SO4浓度对蛋白质萃取率的影响；
准确量取黄精水提液5.00mL于5个刻度离心管中，固定PEG4000和KCl 浓度分别为16％和0.5％，加入不同浓度的(NH4)2SO4(12％、14％、16％、18％、20％)，混合均匀，调pH值至6.0，摇匀，离心机转速设为2000r/min，离心 10min；
其中，(NH4)2SO4浓度对蛋白质萃取率的影响结构如图4所示，当PEG4000 浓度一定时，随着(NH4)2SO4的浓度的增大，下相的吸水能力增强，体积成增大趋势，故R逐渐减小。多糖回收率Y变化不大，蛋白质萃取率E先增大后减小，当(NH4)2SO4的浓度达到16％时，E达到最大值80.75％，这可能是因为(NH4)2SO4在一定的范围内，浓度越大，无机盐的盐析作用越强，蛋白质在萃取相中的浓度越大，E越大，但当(NH4)2SO4的浓度过大时，无机盐会影响蛋白质表面疏水性，使E减小。因此，(NH4)2SO4的最佳浓度为16％。
2.4、pH对蛋白质萃取率的影响；
准确量取黄精水提液5.00mL于5个刻度离心管中，固定PEG4000、 (NH4)2SO4、KCl浓度分别为16％、18％、0.5％，混合均匀，调节不同pH值(5.5、 6.0、6.5、7.0、7.5)，摇匀，离心机转速设为2000r/min，离心10min；
其中，pH对蛋白质萃取率的影响结果如图5所示，当pH值与蛋白质的等电点相差越大，蛋白质在两相中的分配越不均匀，pH的微小变化可能能够使蛋白质的分配系数发生大幅度的改变。pH对蛋白质萃取率的影响如图5所示，当pH增大时，R和Y变化不大，E先增大后减小，当pH为6.5时，E达到80.27％。因此，最佳pH为6.5。
2.5、KCl浓度对蛋白质萃取率的影响；
准确量取黄精水提液5.00mL于5个刻度离心管中，固定PEG4000、 (NH4)2SO4浓度分别为16％、18％，加入不同浓度的KCl溶液(0.5％、1.0％、 1.5％、2％、2.5％)，混合均匀，调pH值至6.0，离心机转速设为2000r/min，离心10min；
其中，KCl浓度对蛋白质萃取率的影响结果如图6所示，随着KCl浓度的增加，R和Y变化不大，E先增加后减小，这可能是因为在双水相中加入不同浓度的KCl溶液可使体系的电荷和疏水状态发生改变，从而影响蛋白质在两相中的分配比例。当KCl浓度在一定范围内时，KCl的加入可促进蛋白质溶解， E逐步上升，当KCl浓度过大，会使萃取相的极性增强，促使E下降，故最佳 KCl浓度为1％。
3、响应曲面法优化萃取工艺；
3.1、响应面试验结果；
表1响应面试验分析因素与水平
根据单因素分析结果，以PEG4000浓度(A)、(NH4)2SO4浓度(B)、pH (C)、KCl浓度(D)为自变量，以蛋白质萃取率为响应值(Y),按照Box-Behen 设计法对黄精多糖脱蛋白萃取工艺进行优化，分析因素与水平设计见表1，响应面试验设计及结果见表2；
表2响应分析因素与水平
通过Design-Expert 10.0.3软件将模型进行分析，拟合得到影响黄精得率的回归方程：得率
Y＝82.36-0.59A+1.49B+0.56C-0.084D-0.21AB-0.77AC+0.58AD+0.64BC-1.20BD-0.45CD-4. 28A2-6.51B2-5.10C2-1.20D2
表3回归模型方差分析
注：差异显著，P＜0.05。
由表3可知，建立的模型的F值为57.48，P<0.0001，说明该模型极显著，失拟项P＝0.4474＞0.05，不显著，说明模型适合本试验，可用于黄精多糖蛋白质萃取的工艺优化。该模型决定系数R2值为0.9829，校正后决定系数 R2 Adj值为0.9658，说明该模型能解释96.58％的响应变化。表中A、B、C、BD、 A2、B2、C2、D2对蛋白质萃取率差异显著(P＜0.05)，D、AB、AC、AD、BC、 CD项不显著(P＞0.05)，将此7项从回归方程中删除，回归方程最终得率 Y＝82.36-0.59A+1.49B+0.56C-1.20BD-4.28A2-6.51B2-5.10C2-1.20D2。
3.2、蛋白质萃取率的响应面分析；
如图7-图12表示各影响因素两两作用蛋白质萃取率的交互影响，从响应曲面分析，(NH4)2SO4浓度对蛋白质萃取率影响最大，表现为响应曲面最陡，之后影响因素依次为PEG4000浓度、pH、KCl浓度，与上述方差分析结果一致。
3.3、模型验证；
通过建立的模型预测蛋白质萃取率最佳工艺为：PEG4000浓度17.825％， (NH4)2SO4浓度16.265％，pH6.538，KCl浓度0.932％，蛋白质萃取率为82.515％，考虑实验操作的可控性，对上述最优提取工艺进行修正：液料比为18:1 (mL/g)，(NH4)2SO4浓度16％，pH6.5，KCl浓度1％。在此条件下进行验证试验，平行测定三次，求平均值，结果得出多糖回收率为91.29％，蛋白质萃取率为82.78％，与预测值82.52％较为接近，表明该模型能够预测蛋白质萃取的最佳工艺，模型可靠，在此工艺下，蛋白质的萃取率比酶法脱蛋白高出11.55％，多糖回收率高4.99％。
4、黄精多糖抗氧化作用分析；
4.1、黄精多糖清除DPPH；
如图12所示，同浓度时，Vc对DPPH的清除能力远远大于黄精多糖。黄精多糖的清除能力与其浓度呈现明显的量效关系，即随着黄精多糖浓度的增加，其清除DPPH自由基的能力逐渐增强，且趋于平缓。脱蛋白后的黄精多糖对DPPH的清除能力优于未脱蛋白的黄精多糖。当黄精多糖浓度达到2.00mg/mL 时，脱蛋白前、后的黄精多糖对DPPH的清除能力分别为66.95％和78.96％，由此可见，脱蛋白后的黄精多糖对DPPH自由基的清除能力更强。
4.2、黄精多糖清除超氧自由基；
如图14所示，在0.40～2.00mg/mL浓度范围内，黄精多糖对超氧自由基
有一定的清除能力，且随着浓度的增加而增强。同浓度Vc溶液对超氧自由基
保持较高的清除率，远远优于黄精多糖。脱蛋白后的黄精多糖对超氧自由基
自由基的清除率大于脱蛋白前黄精多糖对超氧自由基
自由基的清除率，当溶液浓度达到2.00mg/mL时，脱蛋白前、后黄精多糖对超氧自由基
的清除率分别为62.12％和70.78％。由此可见，脱蛋白后的黄精多糖对超氧自由基
的清除能力更强。
综上所述：本发明采用聚乙二醇(PEG)-硫酸铵双水相体系将黄精多糖与蛋白质进行分离，通过响应曲面法进行优化，得到蛋白质最佳萃取参数：黄精多糖溶液5.00mL，当液料比为18:1(mL/g)，(NH4)2SO4浓度16％，pH6.5， KCl浓度1％时，蛋白质的萃取率82.78％，多糖回收率91.29％，在此工艺下，蛋白质萃取率和多糖回收率较酶法脱蛋白分别高出11.55％和4.99％；黄精多糖具有一定的抗氧化能力，但远远不及同浓度Vc的抗氧化能力，同浓度脱蛋白后的黄精多糖抗氧化能力优于未脱蛋白黄精多糖；本研究为高效开发黄精多糖食品和药品奠定了基础。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1、精选优质黄精，然后将精选的黄精放入真空干燥箱内，通过真空干燥箱对黄精进行干燥处理，然后将干燥后的黄精加入到粉碎机中，通过粉碎机将黄精粉碎成粉末状，然后采用80目过滤筛将粉末状黄精中的大颗粒杂质过滤出，并将得到的黄精粉末密封贮藏，以备后续使用；
S2、通过电子天平称取10g黄精粉末，然后将称取的10g黄精粉末加入到500mL具塞锥形瓶中，然后向500mL具塞锥形瓶中加入200mL的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，并搅拌均匀；
S3、将500mL具塞锥形瓶放入HH-1数显恒温水浴锅，然后向500mL具塞锥形瓶中加入1.5％的纤维素酶和果胶酶，并将HH-1数显恒温水浴锅的温度调节至50℃，在50℃条件下，纤维素酶和果胶酶促进500mL具塞锥形瓶中的黄精粉末酶解；
S4、将酶解后的500mL具塞锥形瓶放入到超声波清洗器中，然后500mL具塞锥形瓶在超声波清洗器中处理30分钟，然后依次经过热水浸提、抽滤，并收集滤液，从而得到黄精水提液，并在4℃条件下保存；
S5、精密移取2.00mL黄精水提液于100mL容量瓶内，然后加入清水定容至100mL，并测得蛋白质浓度，后续均采用该浓度的黄精水提液；
S6、黄精水提液中蛋白质的萃取：精密移取5.00mL步骤S5步骤中的黄精水提液于刻度离心管中，然后向刻度离心管中加入聚乙二醇PEG和不同浓度的(NH4)2SO4、KCl，并调节刻度离心管中黄精水提液的pH值，然后充分混合，接着将混合后的黄精水提液加入到离心机内，通过离心机离心10分钟，使得黄精水提液形成分相(上相和下相)，分别读取上相和下相的体积，测定上、下两相中多糖和蛋白质的浓度，平行3次取样，并通过UV-1800PC-DS2型紫外可见分光光度计测定3次取样的吸光度，得吸光度平均值，然后通过考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。
2.根据权利要求1所述的一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺，其特征在于：在S1步骤中，所述真空干燥箱采用DZF-6050真空干燥箱，所述真空干燥箱的真空干燥温度为60℃。
3.根据权利要求1所述的一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺，其特征在于：在S2步骤中，所述电子天平采用LE204E电子天平。
4.根据权利要求1所述的一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺，其特征在于：在S2步骤中，所述磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液的pH值为5.0。
5.根据权利要求1所述的一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺，其特征在于：在S3步骤中，所述纤维素酶与果胶酶质量比为1:1。
6.根据权利要求1所述的一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺，其特征在于：在S4步骤中，所述超声波清洗器采用高功率数控超声波清洗器，所述超声波清洗器的工作功率为360W。
7.根据权利要求1所述的一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺，其特征在于：在S6步骤中，所述离心机采用TDL-5-A低速台式大容量离心机，所述离心机的转速为2000r/min。
8.根据权利要求1所述的一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺，其特征在于：在S6步骤中，所述考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量回归方程为y＝0.1396x-0.0028(R2＝0.9981)。
9.根据权利要求1所述的一种采用双水相萃取黄精多糖中蛋白质的工艺，其特征在于：在S6步骤中，所述蛋白质的萃取率(E)、多糖回收率(Y)和相比(R)分别根据式(1)、式(2)和式(3)求得：
其中，Ct1和Cb1分别为萃取完全后蛋白质在上相(PEG相)和下相(硫酸铵相)中的浓度，Vt和Vb分别为双水相上相和下相的体积；Ct2和Cb2分别为萃取完全后多糖在上相(PEG相)和下相(硫酸铵相)中的浓度，Vt和Vb分别为双水相上相和下相的体积。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6437101B1 (en) * | 1999-05-07 | 2002-08-20 | Akzo Nobel N.V. | Methods for protein purification using aqueous two-phase extraction |
| CN108840956A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-11-20 | 山西大学 | 一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法 |
| CN111793142A (zh) * | 2020-08-17 | 2020-10-20 | 江苏农牧科技职业学院 | 一种黄精多糖的超声辅助协同复合酶法提取工艺 |
| CN111978427A (zh) * | 2020-09-08 | 2020-11-24 | 上海铮信生物科技有限公司 | 一种黄精多糖的提取方法 |
-
2021
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6437101B1 (en) * | 1999-05-07 | 2002-08-20 | Akzo Nobel N.V. | Methods for protein purification using aqueous two-phase extraction |
| CN108840956A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-11-20 | 山西大学 | 一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法 |
| CN111793142A (zh) * | 2020-08-17 | 2020-10-20 | 江苏农牧科技职业学院 | 一种黄精多糖的超声辅助协同复合酶法提取工艺 |
| CN111978427A (zh) * | 2020-09-08 | 2020-11-24 | 上海铮信生物科技有限公司 | 一种黄精多糖的提取方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 梁引库: ""黄精多糖的脱色、脱蛋白及体外抗氧化活性研究"", 《江苏农业科学》 * |
| 苏瑾: "《中草药提取分离技术原理与应用》", 31 August 2015, 西安交通大学出版社 * |
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