JPS5815989A - 生理活性蛋白質の精製方法 - Google Patents
生理活性蛋白質の精製方法Info
- Publication number
- JPS5815989A JPS5815989A JP56089709A JP8970981A JPS5815989A JP S5815989 A JPS5815989 A JP S5815989A JP 56089709 A JP56089709 A JP 56089709A JP 8970981 A JP8970981 A JP 8970981A JP S5815989 A JPS5815989 A JP S5815989A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liquid
- phase
- physiologically active
- rotor
- stationary
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/38—Flow patterns
- G01N30/42—Flow patterns using counter-current
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は医薬品、臨床検査用試薬、研究用試薬として用
いられる生理活性蛋白質の大量分画精製方法およびその
目的に使用される装置に関するものである。
いられる生理活性蛋白質の大量分画精製方法およびその
目的に使用される装置に関するものである。
臨床検査試薬として用いられる各種脱水素酵素。
各種酸化酵素、各種加水分解酵素等、医学、生化学研究
用試薬として用いられる各種酵素、高分子抽出液、もし
くはそれらの細胞の培養液を原料として濃縮、精製され
る。酵素、核酸等の生体高分子の一般的精製法は、硫安
塩析、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマメフ
ィー、ケル・ξ−ミエーションクロマトグラフィー、を
気泳動、超遠心分離、透析等の各種分離精製手段を数回
以上組み合せて行なわれる。しかしながら、上記生理活
性蛋白質は細胞破砕抽出液、細胞培養液中にきわめて低
濃度でしか存在せず、加熱、酸、アルカリ等の薬品処理
に対し不安定で失活し易いものが多い。
用試薬として用いられる各種酵素、高分子抽出液、もし
くはそれらの細胞の培養液を原料として濃縮、精製され
る。酵素、核酸等の生体高分子の一般的精製法は、硫安
塩析、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマメフ
ィー、ケル・ξ−ミエーションクロマトグラフィー、を
気泳動、超遠心分離、透析等の各種分離精製手段を数回
以上組み合せて行なわれる。しかしながら、上記生理活
性蛋白質は細胞破砕抽出液、細胞培養液中にきわめて低
濃度でしか存在せず、加熱、酸、アルカリ等の薬品処理
に対し不安定で失活し易いものが多い。
従来から知られている生体高分子の分離精製法を、工業
的生産を目的とする大量分画精製に適用した場合、分離
精製工程に大量の水を使用し、また精製工程に長時間を
要し吸着、失活等の損失により、目的とする生理活性生
体高分子の収率が低下する等の不都合を生じる。
的生産を目的とする大量分画精製に適用した場合、分離
精製工程に大量の水を使用し、また精製工程に長時間を
要し吸着、失活等の損失により、目的とする生理活性生
体高分子の収率が低下する等の不都合を生じる。
きわめて低濃度、微量しか存在しない物質を濃縮、精製
する場合、液々分配抽出、液々向流分配が有利であるこ
とは知られている。しかしながら。
する場合、液々分配抽出、液々向流分配が有利であるこ
とは知られている。しかしながら。
通常の低分子量有機、無機化合物の分配抽出、向流分配
に用Ｌ）られる有機溶媒は、生理活性蛋白質を濃縮、精
製する目的のためには、その溶媒中で失活するため、用
いることができない。
に用Ｌ）られる有機溶媒は、生理活性蛋白質を濃縮、精
製する目的のためには、その溶媒中で失活するため、用
いることができない。
水溶性の天然もしくは合成高分子の１種類またはそれ以
上と無機イオンの混合水溶液の相分離によって生じる水
性二相分配液中では生理活性蛋白質はきわめて安定であ
り、水性二相分配液の上層液（軽液〕、下層液（重液）
間に生理活性蛋白質が一定の比率で分配されることが知
られている（ Ｐ、Ａ、Ａ Ｉ−ｂｅｒｔｓｓｏｎ、Ｐ
ａｒｔｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅ１ｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅ
ｓ ＆ Ｍａｃｒ −ｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｗｉ Ｉ
ｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９７１ ）。
上と無機イオンの混合水溶液の相分離によって生じる水
性二相分配液中では生理活性蛋白質はきわめて安定であ
り、水性二相分配液の上層液（軽液〕、下層液（重液）
間に生理活性蛋白質が一定の比率で分配されることが知
られている（ Ｐ、Ａ、Ａ Ｉ−ｂｅｒｔｓｓｏｎ、Ｐ
ａｒｔｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅ１ｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅ
ｓ ＆ Ｍａｃｒ −ｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｗｉ Ｉ
ｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９７１ ）。
水性二相分配液の重液、軽液間への生体高分子の分配係
数は、二相分配液を作成するために使用した水溶性天然
もしくは合成高分子の種類１分子量、濃度、二相分配液
の［（、共存する無機塩の種数、濃度によって決定され
るが、生理活性蛋白質の分離精製を目的とする場合、目
的物質が優先的に水性二相分配液の重液もしくは軽液の
一方の相に分配され、共存する他の生体高分子は他方の
相に大部分が分配される様な条件を選定しなければなら
ない。
数は、二相分配液を作成するために使用した水溶性天然
もしくは合成高分子の種類１分子量、濃度、二相分配液
の［（、共存する無機塩の種数、濃度によって決定され
るが、生理活性蛋白質の分離精製を目的とする場合、目
的物質が優先的に水性二相分配液の重液もしくは軽液の
一方の相に分配され、共存する他の生体高分子は他方の
相に大部分が分配される様な条件を選定しなければなら
ない。
我々は１分画精製を目的とする生理活性蛋白質が生体細
胞中で細胞膜もしくは細胞内オルガネラ膜に結合して存
在するか、もしくは生体膜上でその特有の生理活性機能
を発揮する様な疎水的性質を有する物質である場合、ポ
リエチレングリコールと種々の無機塩の混合水溶液より
成る水性二相分配液において、生理活性生体高分子は上
層液（ポリエチレングリコール溶液相）に優先的に分配
され、一方他の共存する親水性生体高分子、アミノ酸、
糖等の低分子量化合物は下層液（無機塩溶液相）に分配
されることを見出した。これをさらに詳しく説明すると
、水性二相分配液を構成するポリエチレングリコール水
溶液は、分子量２０，０００から５００の範囲にある均
一な分子量分布をもつ一種類のポリエチレングリコール
の水溶液、もしくは分子量分布の異なる二種類数のポリ
エチレングリコール、の混合水溶液が用いられる。水性
二相分配液中のポリエチレングリコール濃度は５から２
０重量パーセントの範囲である。水性二相分配液を構成
する無機塩は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫
酸ナトリウム、硫酸カリウム等のごとき多価陰イオンの
アルカリ金属塩の水溶液、もしくは上記多価陰イオンの
アルカリ金属塩と塩化ナトリウム、塩化カリウム等、−
価陰イオンのアルカリ金属塩の混合水溶液が用いられる
。水性二相分配液中の無機塩濃度の範囲は０．２モルか
ら２モルである。
胞中で細胞膜もしくは細胞内オルガネラ膜に結合して存
在するか、もしくは生体膜上でその特有の生理活性機能
を発揮する様な疎水的性質を有する物質である場合、ポ
リエチレングリコールと種々の無機塩の混合水溶液より
成る水性二相分配液において、生理活性生体高分子は上
層液（ポリエチレングリコール溶液相）に優先的に分配
され、一方他の共存する親水性生体高分子、アミノ酸、
糖等の低分子量化合物は下層液（無機塩溶液相）に分配
されることを見出した。これをさらに詳しく説明すると
、水性二相分配液を構成するポリエチレングリコール水
溶液は、分子量２０，０００から５００の範囲にある均
一な分子量分布をもつ一種類のポリエチレングリコール
の水溶液、もしくは分子量分布の異なる二種類数のポリ
エチレングリコール、の混合水溶液が用いられる。水性
二相分配液中のポリエチレングリコール濃度は５から２
０重量パーセントの範囲である。水性二相分配液を構成
する無機塩は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫
酸ナトリウム、硫酸カリウム等のごとき多価陰イオンの
アルカリ金属塩の水溶液、もしくは上記多価陰イオンの
アルカリ金属塩と塩化ナトリウム、塩化カリウム等、−
価陰イオンのアルカリ金属塩の混合水溶液が用いられる
。水性二相分配液中の無機塩濃度の範囲は０．２モルか
ら２モルである。
上記の様な組成を有する水性二相分配液中において、疎
水的性質を有する生理活性蛋白質は分配係数２．０１
だ１ｔｔｌ上の値で、上層液に優先的に分配し、一方、
親水的性質ケ有するその他の生体高分子は分配係数１．
０以下の値で下層液に優先的に分配される。ここで１分
配係数とは、二相分配液の上層液中の物質の濃度に対す
る。下層液中の物質の濃度の比率である。
水的性質を有する生理活性蛋白質は分配係数２．０１
だ１ｔｔｌ上の値で、上層液に優先的に分配し、一方、
親水的性質ケ有するその他の生体高分子は分配係数１．
０以下の値で下層液に優先的に分配される。ここで１分
配係数とは、二相分配液の上層液中の物質の濃度に対す
る。下層液中の物質の濃度の比率である。
疎水的な生理活性蛋白質と、親水的なその他の生体高分
子の水性二相分配液への分配係数の間に。
子の水性二相分配液への分配係数の間に。
充分な差がある場合、上層液中へ生理活性蛋白質全抽出
するか、あるいは上層液、下層液の間で多段向流分配を
行うことに、Ｃシ、細胞破砕抽出液または細胞、培養液
中に多量に存在する物質の中から疎水的な性質を有する
生理活性蛋白質全効率良く分画、精製することができる
。
するか、あるいは上層液、下層液の間で多段向流分配を
行うことに、Ｃシ、細胞破砕抽出液または細胞、培養液
中に多量に存在する物質の中から疎水的な性質を有する
生理活性蛋白質全効率良く分画、精製することができる
。
この分画精製手順奮工沙具体的に説明すると。
目的とする生理活性蛋白質上台む細胞培養液もしくは細
胞破砕抽出液にポリエチレングリコール及び無機塩全溶
解し二相分離した水性二相分配液全ント（５）全通して
回転軸（６）からカラムカートリッヂ（７）へ送シ込む
。同時に試料溶液が試料注入ｉＭ （３）’に通じて注
入される。移動相液はカラムカートリップ内で固定相液
と混合、遠心加速度による分離が多数回〈シ返され、そ
の間に試料溶液中の１分配係数の異なる各成分が分離さ
れる。分離された各試料成分は回転軸（６）の中心全通
り、下部回転ジョイン） （５）ｆｆｉ通って移動相液
と共に流出する。連続的に流出する移動相液中の試料成
分は紫外吸収モニター（１４）で検出され、レコーシさ
れた試料溶液の中から、目的の生理活性上布する画分を
採集する事ができる。この装置は、生理活性生体高分子
ｔ、水水性二相分配液用用る連続向流分配クロマトグラ
フィーにＬって精密に分画精製し得る事が特徴である。
胞破砕抽出液にポリエチレングリコール及び無機塩全溶
解し二相分離した水性二相分配液全ント（５）全通して
回転軸（６）からカラムカートリッヂ（７）へ送シ込む
。同時に試料溶液が試料注入ｉＭ （３）’に通じて注
入される。移動相液はカラムカートリップ内で固定相液
と混合、遠心加速度による分離が多数回〈シ返され、そ
の間に試料溶液中の１分配係数の異なる各成分が分離さ
れる。分離された各試料成分は回転軸（６）の中心全通
り、下部回転ジョイン） （５）ｆｆｉ通って移動相液
と共に流出する。連続的に流出する移動相液中の試料成
分は紫外吸収モニター（１４）で検出され、レコーシさ
れた試料溶液の中から、目的の生理活性上布する画分を
採集する事ができる。この装置は、生理活性生体高分子
ｔ、水水性二相分配液用用る連続向流分配クロマトグラ
フィーにＬって精密に分画精製し得る事が特徴である。
この装置で用いるカラムカートリッヂ（７）は第１図（
ｂ）の構造上布するものである。樹脂製の直方体ブロッ
クに固定相液を保持する分配管（１７） 。
ｂ）の構造上布するものである。樹脂製の直方体ブロッ
クに固定相液を保持する分配管（１７） 。
移動相液の通路（１８）に相当する穴が交互に多数明け
られている。（１７） 、 （１８）は直方体ブロンク
上、下面に刻まれた連結溝（１９）によって相互に連結
され、ブロック上、下両面ニジシート？密着して密封さ
れる。直方体ブロック上端に、固定相液注入、移動相液
送液のためのチューブ接続端子（２０）が設置される。
られている。（１７） 、 （１８）は直方体ブロンク
上、下面に刻まれた連結溝（１９）によって相互に連結
され、ブロック上、下両面ニジシート？密着して密封さ
れる。直方体ブロック上端に、固定相液注入、移動相液
送液のためのチューブ接続端子（２０）が設置される。
カラムカートリッヂ（７）は、第１図（、Ｃ）に示す様
に遠心機ローター（２１）の周辺に放射状に配列される
。分離カラムカートリッヂ（７）は接続チューブ（２２
）で相互に連結され１回転軸（６）の上端に設置された
回転送液ジョイ７ ） （５）ｔ−通して固定相液の注
入、移動相液の送液が行なわれ１回転軸（６）の下端に
設置された回転送液ジヨイント（５）全通じて移動相液
が流出する。
に遠心機ローター（２１）の周辺に放射状に配列される
。分離カラムカートリッヂ（７）は接続チューブ（２２
）で相互に連結され１回転軸（６）の上端に設置された
回転送液ジョイ７ ） （５）ｔ−通して固定相液の注
入、移動相液の送液が行なわれ１回転軸（６）の下端に
設置された回転送液ジヨイント（５）全通じて移動相液
が流出する。
この装置で使用する回転送液ジヨイント（５）は第１図
（ｄ）の様な構造上布する。 （２３）は上部送液接続
管で、その下面に金属酸化物焼結体円盤（２４）が固定
される。（２５）はグラファイト摺動回転子であシ、静
止した（２４）の面と、 ローター回転軸（６）と共に
回転する（２５）の面を密着させ。
（ｄ）の様な構造上布する。 （２３）は上部送液接続
管で、その下面に金属酸化物焼結体円盤（２４）が固定
される。（２５）はグラファイト摺動回転子であシ、静
止した（２４）の面と、 ローター回転軸（６）と共に
回転する（２５）の面を密着させ。
静止した（２３）より送り込まれる液体を、 ローター
と共に回転する下部送液接続管（２６）へ送液接続する
。（２７）は上部送液接続管ホルダーで、固定ピンホー
ル（２８）に固定ビンをそう人して固定される。（２９
）はベアリング、 （３０）はベアリングホルダー、
（３１）は（３０）を回転軸（６）に止めつける金具で
ある。 （３２）はグラファイト摺動回転子（２５）
’に金属酸化物焼結体円盤（２４）へ密着させるバネで
あり、バネ圧で（２５）の上面ｉ （２４）の下面に圧
着しつつ（２５） ｋ回転させる事により回転に対し静
止した（２３）と１回転軸と共に回転する（２６）の間
で５０ Ｋｙ／ｌｔ／１以上の高圧送液接続？可能にす
るものである。
と共に回転する下部送液接続管（２６）へ送液接続する
。（２７）は上部送液接続管ホルダーで、固定ピンホー
ル（２８）に固定ビンをそう人して固定される。（２９
）はベアリング、 （３０）はベアリングホルダー、
（３１）は（３０）を回転軸（６）に止めつける金具で
ある。 （３２）はグラファイト摺動回転子（２５）
’に金属酸化物焼結体円盤（２４）へ密着させるバネで
あり、バネ圧で（２５）の上面ｉ （２４）の下面に圧
着しつつ（２５） ｋ回転させる事により回転に対し静
止した（２３）と１回転軸と共に回転する（２６）の間
で５０ Ｋｙ／ｌｔ／１以上の高圧送液接続？可能にす
るものである。
摩擦係数が小さく、耐摩耗性にすぐれた材料として、
（２５）はグラフアイ）、（２４）はアルミナ、シリ
カ等金属酸化物焼結体金高度研摩したものが使用される
。
（２５）はグラフアイ）、（２４）はアルミナ、シリ
カ等金属酸化物焼結体金高度研摩したものが使用される
。
第２の装置は、第２図（ａ）に示す様な、水性二相分配
液の相分離した上層液、下層液それぞれｔ比がいに逆方
向に送液し一定の遠心加速度の作用の下に、上層液、下
層液の混合と分離を多段で行なう事に工り、試料中の各
成分のうち分配係数が１．０より大きい成分を上層液の
流れの中に、１．０ニジ小さい成分？下層液の流れの中
に分配させ分画採集する連続向流分配抽出装置である。
液の相分離した上層液、下層液それぞれｔ比がいに逆方
向に送液し一定の遠心加速度の作用の下に、上層液、下
層液の混合と分離を多段で行なう事に工り、試料中の各
成分のうち分配係数が１．０より大きい成分を上層液の
流れの中に、１．０ニジ小さい成分？下層液の流れの中
に分配させ分画採集する連続向流分配抽出装置である。
第２図（ａ）の（３３）はモーター、 （３４）は多
段分離ローターを内部に有する分離筒、（３５）は上層
液タンク、 （３６）は下層液タンク、 ＜３７）
、 （３８）は送液ポンプ、 （３９） 、 （４
０）は試料注入器、 （４１）、 （４２）は紫外吸
収モニ／ −、、（４３） 、 （４４）はレコーダー
＊ （４５） 、 （４６）はフラクションコレクタ
ーである。
段分離ローターを内部に有する分離筒、（３５）は上層
液タンク、 （３６）は下層液タンク、 ＜３７）
、 （３８）は送液ポンプ、 （３９） 、 （４
０）は試料注入器、 （４１）、 （４２）は紫外吸
収モニ／ −、、（４３） 、 （４４）はレコーダー
＊ （４５） 、 （４６）はフラクションコレクタ
ーである。
第２図（ｂ）は分離筒（３５）の構造である。（３６）
は多段分離ローター、 （３７）は上層液保持隔壁。
は多段分離ローター、 （３７）は上層液保持隔壁。
（３８）は下層液保持隔壁、 （３９）は連続分配分
離室。
離室。
（４０）は上層液送液注入口、（４１）は上層液流出口
。
。
（４２）は下層液送液注入口、 （４３）は下層液流
出口である。
出口である。
上層液、下層液は連続分配分離室内を、混合と遠心力に
よる分離？くり返しつったがいに逆方向に流れる。上層
液、または下層液の流れに注入された試料は１分配係数
が１．０より大であるが。
よる分離？くり返しつったがいに逆方向に流れる。上層
液、または下層液の流れに注入された試料は１分配係数
が１．０より大であるが。
１．０より７ｈであるかによって土層液または下層液に
分配され１分離してそれぞれ流出する。この装置は、生
理活性生体高分子を水性二相分配液音用いる連続向流分
配クロマトグラフィーに工って分画抽出し得る事が特徴
である。
分配され１分離してそれぞれ流出する。この装置は、生
理活性生体高分子を水性二相分配液音用いる連続向流分
配クロマトグラフィーに工って分画抽出し得る事が特徴
である。
以下に、向流分配分画もしくは向流分配抽出による生理
活性蛋白質の精製例盆述べる。
活性蛋白質の精製例盆述べる。
実施例１
枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ菌体細
胞工りロイシン脱水素酵素の抽出 ロイシン脱水素酵素は、Ｌ−ロイシン及び側鎖アルキル
基奮有するアミノ酸全酸化的に脱テミノ化しα−ケト酸
を生成する反応を触媒する酵素で。
胞工りロイシン脱水素酵素の抽出 ロイシン脱水素酵素は、Ｌ−ロイシン及び側鎖アルキル
基奮有するアミノ酸全酸化的に脱テミノ化しα−ケト酸
を生成する反応を触媒する酵素で。
臨床検査試薬として有用な生体高分子である。
ペプトン１．５％、グリセロール０．１％、リン酸第−
カリウム０．２％、リン酸第二カリウム０．２ ％ 。
カリウム０．２％、リン酸第二カリウム０．２ ％ 。
塩化ナトリウム０．５％、硫酸マグネシウムｏ、ｏｉ％
。
。
酵母エキス０．０．１％’に含む培地で培養して得られ
たＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ菌体細胞２
．０ ｔ ｋポリエチレングリコール６０００ ９．Ｏ
Ｗ／Ｗ％、リン酸カリウム帆６ Ｍ （ｐＨ７−５）ｋ
含む水性二相分配液にけんだくし、３分間超音波処理し
て菌体細胞？破壊、細胞内に含まれるロイシン脱水素酵
素ケ可溶化し友。得られた酵素？含む水性二相分配液？
１４０ｏｒｐｍで２０分間遠心分離し、上層液と下層液
に分離した。上層液中には菌体細胞内に含まれるロイシ
ン脱水素酵素の８０係が抽出され、一方菌体細胞破細断
片、溶出した目的酵素以外の大部分の蛋白質は下層液中
に分配されて。上層液に抽出されたロイシン脱水素酵素
の比活性は８８．０ユニツト／〜蛋白質であった。対照
実験として。
たＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ菌体細胞２
．０ ｔ ｋポリエチレングリコール６０００ ９．Ｏ
Ｗ／Ｗ％、リン酸カリウム帆６ Ｍ （ｐＨ７−５）ｋ
含む水性二相分配液にけんだくし、３分間超音波処理し
て菌体細胞？破壊、細胞内に含まれるロイシン脱水素酵
素ケ可溶化し友。得られた酵素？含む水性二相分配液？
１４０ｏｒｐｍで２０分間遠心分離し、上層液と下層液
に分離した。上層液中には菌体細胞内に含まれるロイシ
ン脱水素酵素の８０係が抽出され、一方菌体細胞破細断
片、溶出した目的酵素以外の大部分の蛋白質は下層液中
に分配されて。上層液に抽出されたロイシン脱水素酵素
の比活性は８８．０ユニツト／〜蛋白質であった。対照
実験として。
０．０１ Ｍ ＋Ｊン酸カリウム中で菌体細胞？超音波
破砕、抽出した場合、抽出されたロイシン脱水素酵素の
比活性は２．７５ユニツト／■蛋白質であり。
破砕、抽出した場合、抽出されたロイシン脱水素酵素の
比活性は２．７５ユニツト／■蛋白質であり。
水性二相分配成金用い、上層液中にロイシン脱水素酵素
を抽出した場合の方が、リン酸カリウム水溶液のみｔ用
いて抽出した場合ニジも比活性で比較して３２倍、精製
されている。
を抽出した場合の方が、リン酸カリウム水溶液のみｔ用
いて抽出した場合ニジも比活性で比較して３２倍、精製
されている。
実施例２
０イシン脱水素酵素の分画精製
ポリエチレシグリコール６０００ ９．ＯＷ／Ｗ％。
リン酸カリウム０．６ Ｍ ’ｉ含む水性二相分配液の
。
。
下層液全固定相液、上層液全移動相ｉとして実施例１で
得られた抽出液を連続向流分配クロマトグラフィーに工
す分画した。ローター回転数２００’Ｏｒｐｍ、 送
液速度０．１７−毎分で、カラムカートリッヂから流出
する上層波音３．５−づつフラクションコレクターで分
画し、活性画分を集めた。抽出液中の酵素比活性８８．
０ユニツト／〜蛋白質は。
得られた抽出液を連続向流分配クロマトグラフィーに工
す分画した。ローター回転数２００’Ｏｒｐｍ、 送
液速度０．１７−毎分で、カラムカートリッヂから流出
する上層波音３．５−づつフラクションコレクターで分
画し、活性画分を集めた。抽出液中の酵素比活性８８．
０ユニツト／〜蛋白質は。
フラクションコレクターで集めた活性画分中では１２２
ユニツト／〜蛋白質まで精製された。
ユニツト／〜蛋白質まで精製された。
第３図に、連続向流分配クロマトグラムｈ示ｔ。
第１図（ａ）は本発明の生理活性蛋白質ケ精製するため
の連続分配分画装置の説明図； 第１図（ｂ）は本発明の装置におけるカラムカートリッ
ヂの説明図； 第１図（ｃ）は本発明の装置におけるローターの、説明
図； 第１図（ｄ）は本発明の装置における回転送液ジヨイン
トの説明図； 第２図（ａ）は本発明における連続向流分配抽出装置の
概要図； 第２図（ｂ）は本発明の装置における連続分配分離管の
説明図； 第３図は実施例２における連続向流分配クロマトグラＡ
ｔ示すグラフである。 特許出願人 三鬼エンヂニアリング株式会社本ｌ
図 （ａ） 幕！図ｒｂ＞ ０ 罠／図（ｃ） ４１２ ｂσ （ａ） 本２ 回（ｂ） 手続補正書（自発） 昭和５７年７月見日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １、事件の表示 昭和５６年特許願第０８９７０９号 ２発明の名称 生理活性蛋白質の精製方法及び装置 ３補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 京都府長岡京市今里２丁目１６番１ｏ号名 称
三鬼エンヂニアリング株式会社４代理人 住 所 〒１０４東京都中央区銀座８丁目１５番１ｏ号
銀座ダイヤハイツ４１０号電話０３−５４２−０９１７
氏 名 （６１４８）弁理士 桑 原 尚 雄、・ ・
５：：１２、：ｌｌ、 −、’： 、Ｑ 、、、＋ ５、補正の対象 ４：、
、、、、・−１″゛６補正の内容 １、（１１明細二との第１３頁下から２行の「第２図に
１）」を「第２図」に訂正する； （２） 第１４頁１４〜１９行の［第２図（１））は
・・、・出［］である。」を削除する： 末行の「連続分配分離室」を「分離筒」に訂正する； （３）第１８頁５行の「第２図（ａ）」を「第２図」に
訂正する； ７〜８行の［第２図（１））は・・・・説明図；」を削
除する； （４）添付図面のＷ２図（ｂ）を削除する；図面番号の
「第２図（ａ）」を「第２図」に削正する、 （５）第５頁１４行の「用そられ」を「用いられ」に訂
正する； （６）第６頁９行の「種数」を「種類」に訂正する；
− （７）第１４頁１１行の「モニター」とｒ（４３）Ｊの
間の「、」を「、」に訂正する。 牽２胆
の連続分配分画装置の説明図； 第１図（ｂ）は本発明の装置におけるカラムカートリッ
ヂの説明図； 第１図（ｃ）は本発明の装置におけるローターの、説明
図； 第１図（ｄ）は本発明の装置における回転送液ジヨイン
トの説明図； 第２図（ａ）は本発明における連続向流分配抽出装置の
概要図； 第２図（ｂ）は本発明の装置における連続分配分離管の
説明図； 第３図は実施例２における連続向流分配クロマトグラＡ
ｔ示すグラフである。 特許出願人 三鬼エンヂニアリング株式会社本ｌ
図 （ａ） 幕！図ｒｂ＞ ０ 罠／図（ｃ） ４１２ ｂσ （ａ） 本２ 回（ｂ） 手続補正書（自発） 昭和５７年７月見日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １、事件の表示 昭和５６年特許願第０８９７０９号 ２発明の名称 生理活性蛋白質の精製方法及び装置 ３補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 京都府長岡京市今里２丁目１６番１ｏ号名 称
三鬼エンヂニアリング株式会社４代理人 住 所 〒１０４東京都中央区銀座８丁目１５番１ｏ号
銀座ダイヤハイツ４１０号電話０３−５４２−０９１７
氏 名 （６１４８）弁理士 桑 原 尚 雄、・ ・
５：：１２、：ｌｌ、 −、’： 、Ｑ 、、、＋ ５、補正の対象 ４：、
、、、、・−１″゛６補正の内容 １、（１１明細二との第１３頁下から２行の「第２図に
１）」を「第２図」に訂正する； （２） 第１４頁１４〜１９行の［第２図（１））は
・・、・出［］である。」を削除する： 末行の「連続分配分離室」を「分離筒」に訂正する； （３）第１８頁５行の「第２図（ａ）」を「第２図」に
訂正する； ７〜８行の［第２図（１））は・・・・説明図；」を削
除する； （４）添付図面のＷ２図（ｂ）を削除する；図面番号の
「第２図（ａ）」を「第２図」に削正する、 （５）第５頁１４行の「用そられ」を「用いられ」に訂
正する； （６）第６頁９行の「種数」を「種類」に訂正する；
− （７）第１４頁１１行の「モニター」とｒ（４３）Ｊの
間の「、」を「、」に訂正する。 牽２胆
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 水溶性高分子物質と無機塩との混合水溶液の相分離
によって生じる二相液間の分配により生理活性蛋白質全
分離精製する方法において２分子量５ ｏｏ〜２０，０
００のポリエチレングリコールの５〜２０重量係の水溶
液と多価陰イオンのナトリウムまたはカリウム塩の０．
２〜２．０モル濃度の水溶液とを混合して生じた二相分
離液を使用して生理活性蛋白質を上層液に優先的に分配
させることを特徴とする生理活性蛋白質の精製方法。 ２、回転軸の上下両端にそれぞれ回転送液ジョイントヶ
有し、複数個のカラムカートリッジを周辺に沿って放射
状に設置した円筒形のローターから成シ１回転軸の上端
の回転送液ジヨイントは任、ｔｏｌつのカラムカートリ
ッジに接続チューブで連結し、該カラムカートリッジは
隣接するカラムカートリッジに順次接続チューブで連結
し、最後のカラムカートリッジは回転軸の下端の回転送
液ジヨイントに連結し、該上端回転送液ジヨイントには
移動相液タンクおよび試料注入器が連結管によって連結
され、該下端回転送液ジヨイントはフラクションコレク
ターに連結されて成る生理活性蛋白質の精製装置。 ３ 該カラムカートリッジは連結溝によって相互に連結
された交互に多数の固定相液分配管および移動相液通路
全開通し、上端に固定相液注入お工び移動相液送液のた
めのチューブ接続端子ケ有する第２項の装置。 ４ 該回転送液ジヨイントは第１図ｄＫ示すごとく下面
に金属酸化物焼結体円盤が固定された上部送液接続管、
ローターと共に回転する下部送液接続管お工び静止した
上部送液接続管工す回転する下部送液接続管に液會送り
込むため両者の間に介在し静止した該円盤の下面に密着
しローターと共に回転するグラファイト摺動回転子から
成る第２項の装置。 ５ 移動相液定流量ポンプ、温度コントロールセンサー
、回転数、温度コントロールユニット、回転数コントロ
ールセンサーおよび紫外吸収モニターを設けた第２項の
装置。 ６ 遠心機ローター回転軸の両端に設置された金属酸化
物焼結体円盤とグラファイト摺動回転子の面を密着回転
させつつ液体？送液する回転送液ジヨイントと、直方体
ブロックに多数の固定相保持空孔と移動相液通路細孔上
うがち両者が交互に直方体ブロック両面に刻まれた連結
溝で連結されたカラムカー） ＩＪッヂと、カラムカー
トリッヂ全放射状に配列し相互に連結管で連結した回転
ローター會有し。 ローターを回転させる事にニジカラムカートリッヂ内に
あら・かじめ充てんされた水性二相分配液の一方の相全
固定相液として遠心力の作用で保持しつつ他方の相？移
動相液として回転送液ジヨイントの一方エシ送液し固定
相液内全通過させ１回転送液ジヨイントの他方より流出
させる事により生理活性生体高分子を連続的に分配分画
する事を特徴とする生理活性蛋白質の精製装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56089709A JPS5815989A (ja) | 1981-06-12 | 1981-06-12 | 生理活性蛋白質の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56089709A JPS5815989A (ja) | 1981-06-12 | 1981-06-12 | 生理活性蛋白質の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5815989A true JPS5815989A (ja) | 1983-01-29 |
| JPS6228960B2 JPS6228960B2 (ja) | 1987-06-23 |
Family
ID=13978293
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56089709A Granted JPS5815989A (ja) | 1981-06-12 | 1981-06-12 | 生理活性蛋白質の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5815989A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6261922A (ja) * | 1985-09-11 | 1987-03-18 | マイルス・ラボラトリ−ス・インコ−ポレ−テツド | 水溶液から蛋白質を分離するための改良方法 |
| EP0214531A2 (en) * | 1985-09-04 | 1987-03-18 | SOLVAY ENZYMES, INC. (a Delaware corporation) | Method for the recovery of extracellular enzymes from whole fermentation beer |
| WO1995006059A1 (en) * | 1993-08-20 | 1995-03-02 | Genentech, Inc. | Aqueous multiple-phase isolation of polypeptide |
| EP1194445A1 (en) * | 1999-05-07 | 2002-04-10 | Covance Biotechnology Services | Methods for protein purification using aqueous two-phase extraction |
| JP2005315787A (ja) * | 2004-04-30 | 2005-11-10 | Univ Nihon | 遠心液液分配クロマトグラフ用コイル状カラム |
| JP2009198218A (ja) * | 2008-02-19 | 2009-09-03 | Univ Nihon | 酵素の分離精製方法 |
| JP2020148571A (ja) * | 2019-03-13 | 2020-09-17 | 株式会社島津製作所 | カラムオーブンおよびクロマトグラフィー |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0449410Y2 (ja) * | 1988-10-29 | 1992-11-20 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5616868A (en) * | 1979-07-21 | 1981-02-18 | Sanki Eng Kk | Centrifugal countercurrent distribution chromatograph unit |
-
1981
- 1981-06-12 JP JP56089709A patent/JPS5815989A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5616868A (en) * | 1979-07-21 | 1981-02-18 | Sanki Eng Kk | Centrifugal countercurrent distribution chromatograph unit |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0214531A2 (en) * | 1985-09-04 | 1987-03-18 | SOLVAY ENZYMES, INC. (a Delaware corporation) | Method for the recovery of extracellular enzymes from whole fermentation beer |
| JPS6261922A (ja) * | 1985-09-11 | 1987-03-18 | マイルス・ラボラトリ−ス・インコ−ポレ−テツド | 水溶液から蛋白質を分離するための改良方法 |
| WO1995006059A1 (en) * | 1993-08-20 | 1995-03-02 | Genentech, Inc. | Aqueous multiple-phase isolation of polypeptide |
| EP1194445A1 (en) * | 1999-05-07 | 2002-04-10 | Covance Biotechnology Services | Methods for protein purification using aqueous two-phase extraction |
| EP1194445A4 (en) * | 1999-05-07 | 2002-10-09 | Covance Biotechnology Services | PROTEIN PURIFICATION USING AQUEOUS TWO-PHASE EXTRACTION |
| JP2005315787A (ja) * | 2004-04-30 | 2005-11-10 | Univ Nihon | 遠心液液分配クロマトグラフ用コイル状カラム |
| JP4613331B2 (ja) * | 2004-04-30 | 2011-01-19 | 学校法人日本大学 | 遠心液液分配クロマトグラフ用コイル状カラム |
| JP2009198218A (ja) * | 2008-02-19 | 2009-09-03 | Univ Nihon | 酵素の分離精製方法 |
| JP2020148571A (ja) * | 2019-03-13 | 2020-09-17 | 株式会社島津製作所 | カラムオーブンおよびクロマトグラフィー |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6228960B2 (ja) | 1987-06-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dechow | Separation and purification techniques in biotechnology | |
| Van de Merbel | Membrane-based sample preparation coupled on-line to chromatography or electrophoresis | |
| AU654669B2 (en) | Process and apparatus for removal of DNA and viruses | |
| Michaels et al. | Membranes in biotechnology: state of the art | |
| US6660150B2 (en) | Separation of micromolecules | |
| JPH04504911A (ja) | 生物学的物質の分離及び採取様遠心分離管及び多孔性選択手段の組合せ | |
| Saunders et al. | Ribonucleic acid and ribosomes of Bacillus stearothermophilus | |
| US6090292A (en) | Device for purifying solutions containing proteins and use of the device | |
| US4846786A (en) | Bioreactor containing suspended, immobilized species | |
| JPS5815989A (ja) | 生理活性蛋白質の精製方法 | |
| US8956535B2 (en) | Single pass method and apparatus for separating a target molecule from a liquid mixture | |
| US5679231A (en) | Gel bed dialyzer | |
| Ito | Centrifugal precipitation chromatography: principle, apparatus, and optimization of key parameters for protein fractionation by ammonium sulfate precipitation | |
| JP2006242116A (ja) | チューブポンプおよび液体操作装置 | |
| EP0021606A1 (en) | Apparatus and process for treating a liquid material while it is subjected to a centrifugal force | |
| US20030006142A1 (en) | Radial electrophoresis apparatus and method | |
| JPH0774799B2 (ja) | 血中成分の測定法 | |
| Yun et al. | Strategy of combining prefiltration and chromatography using composite cryogels for large-scale separation of biotransformation compounds from crude high-cell-density broth | |
| Cooney et al. | Comparative Studies of Hemoperfusion Devices I. In Vitro Clearance Characteristics | |
| Winchester et al. | Present and future uses of hemoperfusion with sorbents | |
| Hamel et al. | Modeling and applications of downstream processing: a survey of innovative strategies | |
| JPS5962312A (ja) | 生理活性天然有機化合物の精製方法及び装置 | |
| Behera et al. | Downstream Processes | |
| SU1307332A1 (ru) | Способ разделени производных белка и микроорганизмов | |
| US20040104174A1 (en) | Chromatographic separation process |