JPS5962312A - 生理活性天然有機化合物の精製方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は医栗品、農薬、化粧品、食品・飼料添加剤とし
て使用される生理活性天然有９ｆヒ合物の大量分画精製
方法及び装置に関するものである。

上記目的に使用される物質は微生物培養培地、゛微生物
菌体、動物・植物組織等の生体材料より抽出、精製され
るが、精製された目的物質を得るために順相才たは逆相
の分配クロマトグラフィーか使用される事が多い。分配
クロマトグラフィーは通常、シリカゲル、アルミナゲル
、セライト、ケイノウ士、多孔性ポリスチレン樹脂等を
担体とし表面に液体相を物理的に吸着被覆させるか化学
的に結合した微粒子を充填したカラムを用いて行なわれ
る。しかしながら、生物材料、Ｃり抽出される成分の中
には、目的とする生理活性物質以外に大量の色素、不純
物が含まれるため、使用した担体が不可逆的に汚染され
頻煩に交換、排棄しなければならない。また、目的とす
る生理活性物質が担体表面の液体相（固定相）に強く保
持されるか、担体表面に吸着される場合、目的物質はカ
ラムから回収されず、これケ力ラムから溶離させる様な
条件下では、生理活性物質が失活、変性する場合がある
。

固体担体表面に吸着もしくは結合した固定相は、とくう
すい分子層であり試料保持容量はきわめて少い。大量の
試料を分画精製するためには大量の担体を充填した大口
径のカラムを使用しなければならず、技術的、経済的に
有利な方法ではない。

相互に自由には混和せず、二相に分離する二種類または
それ以上の溶媒の混゛合液の一方の相を固定相、他方の
相を移動相とし、二相間の物質の分配係数の差を利用し
て多段分配平衡に、ｒ、９混合物質から各成分を分離精
製する方法は向流分配クロマトグラフィーとして知られ
ている。自流分配クロマトグラフィーは、分離精製媒体
として固体担体を使用しないため試料の回収、装置の洗
条が容易であり、穏和な条件で分離が行なわれるため、
試料中の各成分が安定に１００９ｉ回収され、試料保持
容量が太きいため大量分離精製に適する等の利点がある
。

この目的に使用される装置としてフレイブの向流分配装
置、液滴向流分配装置が知られているが、これらは取扱
、操作が煩雑で分離精製に要する時間が長い等の難点が
ある。

我々は、向流分配クロマトグラフィーを短時間で精度工
ぐ行ない、かつ大量の試料を分離精製するに適した方法
として二相分離液のうち一方を固定相として遠心力によ
り保持しつつ、他方を移動相として連続的に固定相同全
通過させて、移動胎内に注入された試料を連続的に分画
採集する装置及びそれケ用いる分離精製方法を開発した
。

この装置の原理を躯１図に示す。遠心力ロ速度の方向と
平行に配列され、細管２で相互に連結された多数の分配
管１の中に、固定相液３が遠心力で保持される。配列さ
れた分配管の一方の端より移動相液４が細管２を通じて
導入され、分配管１の中を遠心力の作用によって生じる
浮力を受けて微細な液滴となって通過する。移動相液４
が順次配列された分配管１の中を連続的に通過する間に
、移動相液４中に導入された試料の各成分は移動相／ｉ
！４と固定相液３の間で多段の分配がぐジ返され、分配
係数の差に応じて分離されて配列された分配管１の他方
の端エフ連続的に流出し、分画採集される。第１図は二
相分離液のうち比重の大きい液相を固定相、比重の小さ
い液相を移動相として用いた場合の送液方向を示す。

この装置を用いて、生体材料から抽出された試料中の生
理活性物質を分離精製する場合、次の様な方法が考えら
れる。

その第１は、移動相液中の濃度に対する固定相液中の濃
度で定義される試料中の各成分の二相液間での分配係数
（Ｋ）が極端に大きな値、もしくは小さな値をとらず、
に＝２．０〜０５の範囲にある場合である。分配管中の
固定相の総容積＼７Ｂ、固定相同全通過し分配管の一端
より流出する移動相液量ＶＭ　、分配管配列内に滞留す
る移動相液量〜ｒＯとするとき、分配係数Ｋ　＝　２．
０〜０５の範囲にある各成分は移動相液を一方向に送液
するとき分配管配列の一端から流出する移動相液ＭＶＭ
　”　Ｖ○＋０．５　Ｖｓ〜ｖＭ＝　ｖ○＋２０＼ｒｓ
　　の範囲で溶出し分画採集される（第２図）。

その第２は、各成分の分配係数０（）が、２０以上の値
、もしくは０５以下の値をとる場合である。

分配係数２．０以上の各成分は、流出する移動相液の最
初の部分に接近して溶出されるため、各成分が充分に分
離されない。分配係数が０５以下の各成分は、分配係数
Ｋ）と試料溶出液量ＶＭＯ間にＶＭ　＝　Ｖ□　＋　Ｖ
３　／　Ｋ　　の関係があるため、分配管内の固定相体
積の２倍以上の多量の移動相を送液しなければ溶出分離
せず、実際的でない。

分配係数０５以下の試料成分は、移動相送液中に配列さ
れた分配管内でしだいに展開され分離されてぐる。配列
された分配管の一方の端より移動相液を送液注入し、他
端、ｒ、り流出する移動相液を再び分配管の入口へ還流
送液し、分配管内で各成分全充分に展開分離させる。そ
の後、最初の送液方向の逆方向力・ら、最初に固定相液
として使用した相を送液するとき、分配管内では移動相
／固定相の関係が逆転し、最初分配係数が０５以下であ
った各成分は新たな移動相液に対し分配係数２０以上の
成分となり、分配管内に展開分離された順に、分配管配
列の最初の入ロエク流出し分画採集される（第３図）。

分配係数２０以上の各成分を相互に分離しようとする場
合、最初の操作として固定相／移動相の間係を逆にし、
以下、上に述べたのと同様な操作を行なうことによｐ分
画採集される。

この方法により、二相分離液間の分配が一方に片よって
いる成分を、最小限度の溶媒使用量で相互に分離する事
が可能になる。

その第３は、試料中に分配係数０５〜２ｏの範囲にある
成分、および分配係数０５以下の成分、分配係数２０以
上の成分が同時に含まれる場合である。移動相液を一方
向に送液し最初に溶出する分配係数２０以上の成分を採
集した後、引きつづき溶出する分配係数０５〜２０の範
囲にある各成分を分画採集する。その後、第２の方法で
述べた操作により、分配係数０５以下の各成分を分画採
集し、最後にあらかじめ採集された分配係数２０以上の
成分を同様に分画採集する。（第４図）。

遠心向流分配クロマトグラフィーでは、送液方向を変え
るととに工って二相分離液のいづれの相を移動相、固定
相として使用することが可能であり、この特徴を利用し
て分配係数が広い範囲に分布する試料中の各成分をそれ
ぞれ分離精製する事ができる。

本発明に含まれる装置及び方法によって分離精製される
対象となる生理活性天然有機ｆヒ合物には、植物組織よ
り抽出されるステロイド、アルカロイド、テルペノイＦ
、フラゼン及びその配糖体、微生物培養培地より抽出さ
れるマクロライド、ペプタイド、アミノ配糖体系抗生物
質、動物、植物脂肪組織より抽出される高級アルコール
、高級脂肪酸、アルカン、アルケン、ポリエン等の炭化
水素、リン脂質、糖脂質、ステロイド及びその脂肪酸エ
ステル、プロスタグランジン、ビタミンＡ、　、　Ｄ　
。

Ｅ、Ｋ、ユビキノン等の脂溶性ビタミンが含まれる。

本発明に含まれる方法にエフ生理活性生体高分子を分離
精製する装置は次の様なものである。第５図に示す様に
溶液タンク１、送液ポンプ２、試料注入器３、回転送液
接続器止め４、回転送液ジヨイント５、回転軸６、カラ
ムカートリッヂ７、ローター８、加温及び冷却器９、温
度コントロー・ルセンサー１０、モーター１１、回転数
及び温度コントロールユニット１２、回転数コントロー
ルセンサー１３、紫外吸収モニター１４、レコーダー１
５、フラクションコレクター１６を備えた遠心向流分配
クロマトグラフである。

二相分離分配液の上、下二相に分離した一方の液を固定
相液としてカラムカート１ノツヂ７にあらかじめ充填し
た後、ローターを回転させる。回転数は５００　ｒｐｍ
から２００　Ｏｒｐｍであり、直径３００門のローター
を使用する場合、重力場加速度の２５倍から３００倍の
遠心加速度が与えられる。口〜ターを回転させつつ、溶
液タンク１から二相分配液の他方の液を移動相液として
送液し上部回転送液ジョイント５全通して回転軸６から
カラムカートリッヂ７へ送り込む。同時に試料溶液が試
料注入器３を通じて注入される。移動相液はカラムカー
トリッヂ内で固定相液と混合、遠心力ロ速度による分離
が多数回くり返され、その間に試料溶液中の分配係数が
異なる各成分が分離される。

分離された各試料成分は回転軸６の中心を通り、下部回
転ジヨイント５を通って移動相液と共に流出する。連続
的に流出する移動相液中の試料成分は紫外吸収モニター
１４で検出され、レコーダー１５に記録されると同時に
、フラクションコレクター１６で一定容量づつ分取され
る。分取された試料溶液の中から、目的の生加活性を有
する画分を採集する事ができる。

移動相液をリザイクルする場合、紫外吸収モニター１４
のフローセルエフ流出するＷ　ｋ　４　Ｍで溶液タンク
１へ還流させる。一定時間還流の後、溶液タンク１の内
容ヲ二相分配液の他方の液とし、送液ポンプ２によって
下部回転ジョイント５全通９カラムカートリッヂ７、回
転軸６、上部回転ジヨイント５を経由して流出させ、還
流送ｉ［よってカラムカートリッジ内に展開分離された
成分を紫外吸収モニター］４で検出しフラクションコレ
クターで一定容量づつ分取する。

この装置で用いるカラムカートリッジ７は第６図の構造
を有するものである。仙脂製の直方体ブロックに固定相
ｉ’ｉ保持する分配管１７、移動相液の通路１８に和尚
する穴が交互に多数明けられている。１７　、１．８は
直方体ブロック上、下面に刻まれた連結溝１　’９　Ｋ
よって相互に連結され、ブコック上、下両面Ｉクシ一ト
を密着して密封される。直方体ブロック上端に、固定相
液注入、移動相液送液のためのチューブ接続・蝙子２０
が設置される。

カラムカートリッヂ７は、第７図に示す様に遠心機ロー
ター２１の周辺に放射状に配列される。

７は接続チューブ２２で相互に連結され、回転軸６の上
端、下端に設置された回転送液ジョイント５全通して固
定相液の注入、移動相液の送液、流出が行なわれる。

この装置で使用する回転送液ジヨイント５は第８図の様
な構造を有する。２３は上部送液接続管で、その下面に
金属酸ｆヒ物焼結体円盤２４が固定される。２５はグラ
ファイト摺動回転子であり、静止した２４の面と、ロー
ター回転軸６と共に回転する２５の面金密着させ静止し
た２３より送り込まれる液体を、ロータ〜と共に回転す
る下部送液接続管２６へ送液接続する。２７は上部送液
接続管ホルダーで、固定ピンホール２８に固定ピンをそ
う人して固定される。２９はベアリング、３０はベアリ
ングホルダー、３１は３０’を回転軸６に止めつける金
具である。３２はグラファイト摺動回転子２５を金属酸
化物焼結体円盤２４へ密着させるバネであり、ノ々ネ圧
で２５の上面を２４の下面（Ｃ圧着しつつ２５を回転さ
せる事により回転に対し静止した２３と、回転軸と共に
回転する２６の間で５０　ｋ？　／　ｔＵ以上の高圧送
液接続全可能にするものである。

磨擦係数が小さく耐摩耗性にすぐれた材料として２５は
グラファイト、２４はアルミナ、シリカ等金属酸化物焼
結体を高度研摩したものが使用される。

以下ニ、遠心向流分配クロマトグラフィーによる生理活
性天然有機化合物の精製例を述べる。

実施例１ 荀栗抽出物、ｃクペオニフロリンの分離精製和漢薬とし
て使用される勺薬（Ｐ、ａｌｂｉｆｌｏｒａ）のメタノ
ール抽出物、ｒ、り有効成分ペオニフロリン（Ｐａｅｏ
ｎｉｆｌｏｒｉｎ　）　　ｆ遠心向流分配クロマトグラ
フィーに工って分離精製した。

メタノール抽出物の中には、目的成分の他に脂溶性成分
、色素、糖の様な極性成分が含まれる。

クロロホルム：メタノール：水＝５：６：４の混合溶液
の上層液全固定相としてカラムカートリッジに充填後、 荀薬のメタノール抽出物５０′？金上層ｉ２０ｄに溶解
し試料インジェクターを通して注入した。

回転数７００　ｒｐ亀送液速度２．０　ｍｌ　／　ｍｉ
ｎで下層液を上部回転ジヨイントから送液、下部回転ジ
ヨイントから流出させ、ＵＶモニター（２５０ｎｍ）で
検出しつつ流出する脂溶性成分を除去し、その後同一方
向から下層１３６０ｍ１’ｅ還流送液した。

移動相を上層液とし回転数７０Ｏｒ匝、送液速度２、　
Ｏｍ／／　ｍｉｎで下部回転ジヨイントから送液、上部
回転ジヨイントから流出させ、ＵＶモニターで検出しつ
つ流出ｉ全フラクションコレクターで分取した（第９図
）。

ペオニフロリンに相当するピーク画分（Ｐ）を集め減圧
濃縮しペオニフロリンの結晶ｏ９８１が得られた。シリ
カゲル薄層クロマトグラフィーによる分析（展開液クロ
ロホルム：メタノール：水−３０：１０：１）の結果、
得られた結晶は純粋なペオニフロリンである事が確認さ
れた。

実施例２ 柴胡抽出物エクザポニンの分離精製 和漢薬として使用される柴胡（Ｂ、ｆａｌｃａｔｕｍ）
根のメタノール抽出物、ｌ：タサポニンａ１サポニンｄ
全遠心向流分配クロマトグラフによって分離精製した。

ｎ−ブタノール：メタノール：水＝１０：２．５：１０
の混合溶液の上層液を固定相としてカラムカートリッジ
に充填後、柴胡のメタノール抽出物１０．０Ｐ’ｅ上層
液４０ｍ１に溶解し試料インジェクターを通して注入し
た。回転数］　ＯＯＯｒｐｍｓ　送液速度２．　Ｑ　ｍ
ｌ　／　ｍｉｎで下層液を上部回転ジヨイントから送液
、下部回転ジヨイントから流出させた。

ＵＶモニター（２５０ｎｍ）で検出される色素等の水溶
性成分を流出除去後、下層液５００ｒｎｌを同一方向力
・ら還流送液した。

移動相全上層液とし回転数１．　ＯＯＯｒｐｍ、送液速
度２．　Ｑ　ｍｅ　／　ｍｉｎで下部回転ジヨイント力
・ら送液、上部回転ジヨイントから流出させ、ＵＶモニ
ターで検出しつつ流出液をフラクンヨンコレクターで分
取した（第１０図）。

柴胡サポニンａ、ｄに相当するピークを集め減圧濃縮し
、各々のピークからそれぞれ結晶３１１ｎｇ、１．６ｍ
？’に得た。シリカゲル薄層クロマトグラフィーによる
分析の結果、得られた結晶は純粋な柴胡サポニンａ、ｄ
である事が確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の装置の原理の説明図で、１は分配管、
２は分配管を連結する細管、３は固定相液、４は移動相
液を示す： 第２図は移動相液を一方向に流した場合のピークの高さ
と分配係数の関係を示す。グラフにおいて、横軸は（’
Ｊｅｔ　−Ｖｏ　）　／　Ｖｓ　１縦軸はピークの高さ
である。 第３図は流出した移動相液を再び分配管の入口に還流送
液した後、逆方向に流した場合のピークの高さと分配係
数の関係を示す。なお還流容積は４０〆ｖｓ　　である
； 第４図は移動相液全一方向に流しＫが２０以上及び０５
〜２０の成分を分画採取した後、第３歯゛の方法を行っ
た場合のピークの高さと分配係数の関係を示す； 第５図は本発明の詳細な説明図である；第６図は本発明
の装置におけるカラムカートリッヂの説明図である； 第７図は本発明の装置におけるローターの説明図である
。 第８図は本発明の装置における回転送液ジヨイントの説
明図である； 第９図は、実施例１における流出曲線図で、横軸は流出
容積、縦軸は吸光度（２５０ｎｍ）’を表わす。 第１０図は実施例２における流出曲線図で、横軸は流出
容積、縦軸は吸光度（２５０ｎｍ）ｉ表わす。 第１１図は本発明の装置の具体的系統図である。 図において、 Ｔ２：分配液（１）槽 Ｔ３：分配液（２）槽 Ｔ４：試料溶液槽 Ｔ５：塩液槽 Ｂ１：４万切換バルブ Ｂ２：６方流路切換バルブ Ｂ３：４万流路切換バルブ Ｂ４：４万流路切換バルブ Ｂ５：４万切換バルブ Ｐｌ：高圧定流量ポンプ Ｂ２：送液ポンプ Ｓ：試料溶液ループ Ｃ：遠心向流分配クロマトグラフ Ｍ：紫外吸収モニター Ｒニレコーダー Ｆ：フラクションコレクター である。 Ｌ／図 汎２図 襄３図 Ａ、０　３．０　２Ｏｒ、ｕ ＃、！Ｌ ４．０　３．０　２．０　１．０ 孔乙図 ２ｎ 毛７　凹 孔ｑｚ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　二種類もしくはそれ以上の溶媒の混合溶液の相分離
   によって生じる二相液間の分配により生理活性有機化合
   物を分離精製する方法において、二相液（Ａ）　＋’　
   （Ｂ）のうち、第一段階として（Ａ）液を固定相、（Ｂ
   ）液を移動相として使用しくＢ）液を一方向より連続的
   に送液することＫより（Ｂ）ｉ中に分配され、（Ｂ）液
   と共に溶出する試料中の各成分を分画採集し、第二段階
   として第一段階と同一方向から（Ｂ）液を還流送液する
   ことＶＣよって試料中の各残留成分ヲ（Ａ）液中に展開
   分離させ、第三段階として（Ａ）液を移動相、（Ｂｊ液
   全全固定相して使用しくＡ）液を第一段階と逆方向から
   連続的に送液することＫより　（Ａ、）液中に展開分離
   された各残留成分ヲ（Ａ）ｇｌ、と共に溶出させ分画採
   集すること全特徴とする生理活性天然有機「ヒ合物の精
   製方法。 ２　回転軸の上下両端にそれぞれ回転送液ジヨイント４
   有し、複数個のカラムカートリッジを周辺に沿って放射
   状に設置した円筒形のローターから成り、回転軸上端の
   回転送液ジヨイントは任意の１つのカラムカートリッジ
   に接続チューブで連結し、該カラムカートリッジは隣接
   するカラムカートリッジに順次接続チューブで連結し、
   最後のカラムカートリッジは回転軸の下端の回転送液ジ
   ヨイントに連結し、該上端及び下端回転送液ジヨイント
   は流路切換バルブを経由して二相ｉ　（Ａ）　、　（Ｂ
   ）のいづれか一方の溶液タンク及び送液ポンプ、試料注
   入器、もしくは紫外吸収モニター及びフラクションコレ
   クターに連結管［！：つて連結されて成る生理活性天然
   有機化合物の精製装置。 ３　該カラムカートリッジは、連結溝によって相互に連
   結された交互に多数の固定相分配管および移動相液通路
   を開通し、上端に固定相液注入および移動相液送液のた
   めのチューブ接続端子を有する第２項の装置。 ４　該回転送液・ジヨイントは下面に金属酸化物焼結体
   円盤が固定された上部送液接続管、ローターと共に回転
   する下部送液接続管および静止した上部送液接続管エフ
   回転する下部送液接続管に液を送り込むため両者の間に
   介在し静止した該円盤の下面に密着しローターと共に回
   転するグラファイト摺動回転子方ユら成る第２項の装置
   。 ５　遠心機ローター回転軸の両端に設置された金属酸化
   物焼結体円盤とグラフアイ・ト摺動回転子の面を密着回
   転させつつ液体全送液する回転送液ジヨイントと、直方
   体ブロックに多数の固定相保持空孔と移動相液通路細孔
   をうがち両者が交互に直方体ブロック両面に刻まれた連
   結溝で連結されたカラムカートリッジと、カラムカート
   リッジを放射状に配列し相互に連結管で連結した回転ロ
   ーター全有し、ローターを回転させるとと［，１ｍ！ｌ
   ｌカラムカートリッジ内にあらかじめ充てんされた二相
   分配液の一方の相い）を固定相液として遠心力の作用で
   保持しつつ他方の相（Ｂ）　’ｆ移動相液として回転送
   液ジヨイントの一方（Ｘ）よＶ送液し固定相液内を通過
   させ、回・転送液ジヨイントの他方（Ｙ）より流出させ
   試料中の成分を分画採集した後、（Ａ）ヲ閃から（Ｙ）
   の方向へ還流送液する事ＶＣ、Ｃり試料中の残留成分子
   ｆｉ（Ａ）内で展開分離し、次いで（Ｂ）　Ｗ固定相液
   、（Ａｎ移動相液として（Ａ）　’ｋ　（Ｙ）エフ送液
   、（Ｘ）より流出させて（Ａ）内に展開分離した試料中
   の残留成分を分画採集する事を特徴とする生理活性天然
   有機１１合１吻の精製装置。