CN216273870U - 一种全自动密度梯度分离仪与蛋白纯化系统联用装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及生物分子分离技术领域，公开了一种全自动密度梯度分离仪与蛋白纯化系统联用装置。该装置包括全自动密度梯度分离仪、第一三通、在线过滤器、透明定量容器、第二三通、第三三通、PEEK管线和蛋白纯化系统，所述透明定量容器的上端设置有第一接口和第二接口，所述透明定量容器的下端设置有第三接口。采用该联用装置可以将密度梯度不同介质层的溶液快速精细纯化，节省时间、快速高效；同时可以将密度梯度分离出来的生物分子与蛋白纯化系统进样系统引入的生物分子实现在线反应、结合、孵育等操作后，再利用蛋白纯化系统进行分离纯化收集。

Description

一种全自动密度梯度分离仪与蛋白纯化系统联用装置

技术领域

本实用新型涉及生物分子分离技术领域，具体涉及一种全自动密度梯度分离仪与蛋白纯化系统联用装置。

背景技术

密度梯度离心是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把样品分配到梯度溶液介质中某些位置。即不同组份的分离是依靠混合物穿过密度梯度介质溶液层的沉降或上浮实现的的。商品化的全自动密度梯度离心制备分离系统主要用于生物样品的分离与收集，如病毒、衣原体、疫苗、外泌体、亚细胞器、膜、DNA、RNA、蛋白等。该分离系统包括两个仪器：分别是密度梯度制备仪和密度梯度分离仪。密度梯度制备仪主要用于快速制备线性密度梯度溶液，制备成功的密度梯度溶液有利于提高样品的后续密度梯度离心分离效果。制备完成后在密度梯度配套离心管上加样后进行超速离心。离心后利用密度梯度分离仪进行分离和收集，即将超速离心后的样品从梯度介质中分离出来，做到最大程度的纯化，尽量避免不同层样品间的扰动。商品化的密度梯度分离仪是通过喇叭吸头，匀速的将样品分离并通过紫外实时检测并收集。全自动的密度梯度制备仪是在商品化的的离心管中按照操作规程加入低浓度介质溶液和高浓度介质溶液各一半，即先用注射器加样针(一定要插到离心管底部)，把低浓度介质溶液注入离心管底部至标尺帽沿，然后用另一只注射器把高浓度介质溶液缓缓注入离心管底部使离心管液面逐渐上升。将离心管内介质溶液加好后，离心管帽盖好后。制备仪采用倾斜管旋转处理技术，进行密度梯度介质制备。制备好后在离心管上方加入样品后，进行超速离心。在超速离心快结束前，进行密度梯度分离仪准备工作。在开电源前根据实验需求选择254nm或280nm波长，拧开滤光片位置，倒转滤光片就可以换。做蛋白检测用280nm，核酸254nm。然后开电源和软件，设置程序清洗仪器管路。当超速离心结束后，安装分离仪离心管套(holder)：取下离心管套顶部的接头配件，将离心管插入其内，固定好。确定好起始收集点，进行一步法自动分离或者手动分离，分离结束后清洗管路。密度梯度分离仪的优点是喇叭吸头吸取离心管液体的过程可视化，吸取液体活塞移动的速度可根据实验需要调整。密度梯度分离常用的梯度介质如不同浓度的蔗糖溶液、氯化铯溶液等。

蛋白纯化系统是一个快速分离肽、核酸、蛋白等的常用液相色谱系统，如常用来分离纯化蛋白质、多糖、肽类、寡核苷酸、核苷酸、病毒及天然小分子(TCM)等，非常适合分离纯化活性物质。蛋白纯化系统硬件由系统泵、样品泵、紫外可见检测器、电导检测器、温度检测器、pH检测器、组分收集器等组成。耗材是各种类型色谱层析柱，主要有凝胶过滤柱、离子交换柱、疏水层析柱、反向层析柱和亲和层析柱等多种。AKTA蛋白纯化系统是生物实验室常用的分离纯化蛋白、核酸等的设备。其中常用的层析柱有凝胶过滤柱、离子交换柱、亲和层析柱等。凝胶过滤柱是依据被分离物分子大小和形状的差异进行分离，离子交换柱是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离。亲和层析柱是AKTA蛋白纯化系统中最常用的柱子，利用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键结合于载体上而制得的。

全自动密度梯度分离仪和蛋白纯化系统都是生物分子分离的常规方法，只是原理不同，密度梯度分离主要依靠样品超速离心后在不同密度梯度溶液介质中分布不同进行分离收集，这种相对粗糙的收集方式决定了收集到的样品往往纯度不够。而蛋白纯化系统是依靠色谱分离的原理可以实现精细纯化，蛋白纯化系统对样品的要求是样品必须经0.2微米的滤膜过滤或者12000rpm 至少离心10min，防止样品有杂质堵系统。目前商品化的密度梯度分离仪是采用喇叭吸头吸取离心管中不同层溶液进行分离的。这种分离方法得到的样品很多情况下纯度都不够进行下一步精细实验。分离仪配套的收集管可根据出峰收集相应的溶液。但要想进一步利用AKTA蛋白纯化系统纯化时，收集管里样品需要过0.22μm滤膜或者离心取上清再转移到AKTA进样定量环中，利用蛋白纯化系统纯化。缺点在于：(1)收集管里的液体转移到蛋白纯化系统进样系统中耽误时间长，且转移过程中不可避免会损失样品。在此过程中，有些生物活性强的样品容易失活。(2)分离仪中不同层溶液的收集管分别转移到蛋白纯化系统中定量环上样，操作繁琐，效率低下。

实用新型内容

本实用新型的目的是为了克服现有技术存在的采用密度梯度分离仪分离的生物分子，分离的纯度不够，需要进一步纯化，采用密度梯度分离仪分离样品后再转移到蛋白纯化系统进行纯化，由于转移过程中耽误时间长，导致样品损失，有些生物活性强的样品容易失活，并且分离仪中不同层的溶液需要分别转移到蛋白纯化系统中定量环上样，操作繁琐，效率低下的问题，提供一种全自动密度梯度分离仪与蛋白纯化系统联用装置，采用该联用装置可以将密度梯度不同介质层的溶液快速精细纯化，节省时间、快速高效；同时可以将密度梯度分离出来的生物分子与蛋白纯化系统进样系统引入的生物分子实现在线反应、结合、孵育等操作后，再利用蛋白纯化系统进行分离纯化收集。

为了实现上述目的，本实用新型提供了一种全自动密度梯度分离仪与蛋白纯化系统联用装置，该装置包括全自动密度梯度分离仪、第一三通、在线过滤器、透明定量容器、第二三通、第三三通、PEEK管线和蛋白纯化系统，所述透明定量容器的上端设置有第一接口和第二接口，所述透明定量容器的下端设置有第三接口，所述全自动密度梯度分离仪的在线紫外检测器的出口通过PEEK管线与所述第一三通的入口连接，所述第一三通的第一出口通过 PEEK管线与废液收集管连接，所述第一三通的第二出口通过PEEK管线与所述在线过滤器的进口连接，所述在线过滤器的出口通过PEEK管线与所述透明定量容器的第一接口连接，所述透明定量容器的第三接口通过PEEK管线与所述第三三通的第一出口连接，所述第三三通的第二出口通过PEEK管线与所述蛋白纯化系统的层析柱的入口连接，所述蛋白纯化系统进样系统六通阀的接口通过PEEK管线与所述第二三通的入口连接，所述第二三通的第一出口通过PEEK管线与所述透明定量容器的第二接口连接，所述第二三通的第二出口通过PEEK管线与所述第三三通的入口连接。

优选地，所述第一三通、第二三通和第三三通均为带截止阀的三通。

优选地，所述第一接口为螺纹接口。

优选地，所述第二接口为螺纹接口。

优选地，所述第三接口为螺纹接口。

优选地，所述PEEK管线可以是相同型号的管线，也可以是不同型号的管线。

优选地，所述在线过滤器内部装有一次性滤芯。

优选地，所述透明定量容器为透明定量瓶或透明定量管。

优选地，所述透明定量容器为1-10mL的透明定量容器。

优选地，所述透明定量容器为1mL、2mL、5mL或10mL的透明定量容器。

本实用新型旨在搭建一套在线联用装置，将全自动密度梯度分离仪分离后的溶液，经过在线联用装置直接进入蛋白纯化系统中进一步分离纯化，快速得到纯的蛋白或核酸等生物分子。目前市场上没有商品化的基于全自动密度梯度分离仪与蛋白纯化系统联用的装置，本实用新型首次将两种设备实现在线联用，该联用装置的优势主要体现在以下五各方面：(1)密度梯度离心后的生物样品快速进行在线色谱纯化，最终收集得到精细纯化的样品。(2) 将两个设备在线联用后，得到目标高纯度的生物分子花费的时间大大缩短，避免生物活性样品降解。(3)可利用蛋白纯化系统的多种色谱纯化手段如常用的亲和层析、离子交换、分子筛等，根据实际需要，实现密度梯度离心不同梯度介质溶液的精细纯化及快速收集。(4)该装置成本低廉，搭建简单，易得且易维护。(5)该装置实现全自动密度梯度分离仪与蛋白纯化系统联用后，可以利用该装置拓宽仪器的应用范围，例如蛋白纯化系统原来进样系统中可以引入其他生物分子，全自动密度梯度分离仪在线分离出的蛋白可以与样系统引入的其他分子结合孵育后，再通过蛋白纯化系统进行分离纯化收集等。

附图说明

图1是本实用新型所述的全自动密度梯度分离仪与蛋白纯化系统联用装置流程示意图。

附图标记说明

1全自动密度梯度分离仪的在线紫外检测器；3在线过滤器；4透明定量容器；6蛋白纯化系统的层析柱；7蛋白纯化系统进样系统六通阀的接口； 9废液收集管；10蛋白纯化系统检测器；21第一三通的入口；22第一三通的第一出口；23第一三通的第二出口；41第一接口；42第二接口；43第三接口；51第二三通的入口；52第二三通的第一出口；53第二三通的第二出口；81第三三通的入口；82第三三通的第一出口；83第三三通的第二出口。

具体实施方式

以下结合附图对本实用新型的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本实用新型，并不用于限制本实用新型。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本实用新型提供的全自动密度梯度分离仪与蛋白纯化系统联用装置，如图1所示，包括全自动密度梯度分离仪、第一三通、在线过滤器3、透明定量容器4、第二三通、第三三通、PEEK管线和蛋白纯化系统，所述透明定量容器4的上端设置有第一接口41和第二接口42，所述透明定量容器4的下端设置有第三接口43，所述全自动密度梯度分离仪的在线紫外检测器1 的出口通过PEEK管线与所述第一三通的入口21连接，所述第一三通的第一出口22通过PEEK管线与废液收集管9连接，所述第一三通的第二出口 23通过PEEK管线与所述在线过滤器3的进口连接，所述在线过滤器3的出口通过PEEK管线与所述透明定量容器4的第一接口41连接，所述透明定量容器4的第三接口43通过PEEK管线与所述第三三通的第一出口82连接，所述第三三通的第二出口83通过PEEK管线与所述蛋白纯化系统的层析柱6 的入口连接，所述蛋白纯化系统进样系统六通阀的接口7通过PEEK管线与所述第二三通的入口51连接，所述第二三通的第一出口52通过PEEK管线与所述透明定量容器4的第二接口42连接，所述第二三通的第二出口53通过PEEK管线与所述第三三通的入口81连接。

本实用新型所述装置可以实现的第一条流路为：密度梯度离心管中混合样品分散在不同层密度梯度介质中以后，设置好密度梯度分离仪离心管中活塞的移动速度，密度梯度分离仪喇叭吸头就可以从上往下吸取不同层溶液，进入全自动密度梯度分离仪的在线紫外检测器1中检测，并用软件读出 280nm或者254nm出峰；然后从全自动密度梯度分离仪的在线紫外检测器1 的出口流出的溶液经过第一三通，如果这部分密度梯度溶液经过紫外检测器检测后不需要进一步纯化，就由第一三通的第一出口22将该部分溶液排进废液收集管9中收集，如果这部分密度梯度溶液需要进一步纯化，由第一三通的第二出口23将该部分溶液引入在线过滤器3中进行在线过滤，防止溶液中有沉淀物堵塞蛋白纯化系统的层析柱6；过滤后的溶液由透明定量容器 4的第一接口41进入透明定量容器4中进行定量，然后由透明定量容器4 的第三接口43流出经过第三三通的第一出口82、第二出口83流入蛋白纯化系统检测器10的层析柱6中进行检测。由此则实现了生物分子的进一步精细纯化及快速收集，并且节约了时间。

本实用新型所述装置可以实现的第二条流路为：蛋白纯化系统的流动相溶液由蛋白纯化系统进样系统六通阀的接口7流入第二三通的入口51，第二三通的第一出口51将流动相溶液经过透明定量容器4的第二接口42引入透明定量容器4，然后经过透明定量容器4的第三接口43、第三三通的第一出口82、第二出口83进入蛋白纯化系统的层析柱6中。该流路的目的有三个：第一，可以用蛋白纯化系统的流动相溶液清洗透明定量容器4，同一密度梯度离心管不同层溶液前后分别收集到这个透明定量容器4中时，为避免交叉混合，可以用这个流路清洗。第二，当密度梯度分离仪活塞的助推流路压力不够时，可以利用这个流路蛋白纯化系统泵的压力助推透明定量容器4中的溶液进入层析柱。第三，通过这个流路可以把蛋白纯化系统中的进样环液体和透明定量容器4中的样品进行混合，孵育结合等再进行分离纯化，满足更多的应用需求。

由此可见，透明定量容器4有两个流路选择：第一个是直接从在线过滤器3过滤完的密度梯度分离溶液流入定量瓶，流出到层析柱上端入口。第二个是从蛋白纯化系统流动相或者进样系统流入透明定量容器4，流出到层析柱上端入口。

本实用新型所述装置可以实现的第三条流路为：蛋白纯化系统的流动相或者蛋白纯化系统的进样阀进样后，直接经过第二三通和第三三通进入蛋白纯化系统的层析柱6。由此可见，蛋白纯化系统的层析柱6前的流路上设置的两个三通(第二三通和第三三通)的流路有两个：第一就是PEEK管线上和现有技术中的系统一样，流动相或者蛋白纯化系统的进样阀进样直接进入层析柱。第二个就是流经透明定量容器4，将透明定量容器4中的溶液带入层析柱系统中。

在本实用新型所述的装置中，所述第一三通、第二三通和第三三通均为带截止阀的三通。在优选实施中，所述第一三通、第二三通和第三三通的两个出口设有截止阀旋钮，可供实际需要选择合适的流路通过。

在优选实施方式中，所述第一接口41、所述第二接口42、所述第三接口43均为螺纹接口。将透明定量容器4上的接口设置螺纹接口，可与PEEK 管线接口进行完全对接，防止出现接口漏液的情况。

在本实用新型所述的装置中，根据实际需要，各个PEEK管线可以是相同型号的管线，例如1/16″*0.01″peek管线，也可以是不同型号的管线。当采用不同型号的PEEK管线时，可通过变径头进行连接。

在具体实施方式中，所述在线过滤器3内部装有一次性滤芯，使用一次性滤芯可以避免不同溶液之间交叉混合，所述在线过滤器3必须能够实现 0.22μm滤膜过滤的效果。

在本实用新型所述的装置中，所述透明定量容器4可以为本领域常见的定量容器，具体地，例如所述透明定量容器4为透明定量瓶或透明定量管。只要能够实现定容目的且便于观察定容容器内的溶液状态即可。

在具体实施方式中，所述透明定量容器4可以为1-10mL的透明定量容器。所述透明定量容器4的量程可以根据实际需要进行选择，例如1mL、2mL、 3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。在优选实施方式中，所述透明定量容器4为1mL、2mL、5mL或10mL的透明定量容器。

在一种具体实施方式中，本实用新型提供的全自动密度梯度分离仪与蛋白纯化系统联用装置，如图1所示，包括全自动密度梯度分离仪、带截止阀的第一三通、在线过滤器3、透明定量容器4、带截止阀的第二三通、带截止阀的第三三通、PEEK管线和蛋白纯化系统，所述透明定量容器4为1-10mL 的透明定量瓶，所述透明定量容器4的上端设置有第一接口41和第二接口 42，所述第一接口41、所述第二接口42、所述第三接口43均为螺纹接口，所述透明定量容器4的下端设置有第三接口43，所述全自动密度梯度分离仪的在线紫外检测器1的出口通过PEEK管线与所述第一三通的入口21连接，所述第一三通的第一出口22通过PEEK管线与废液收集管9连接，所述第一三通的第二出口23通过PEEK管线与所述在线过滤器3的进口连接，所述在线过滤器3的出口通过PEEK管线与所述透明定量容器4的第一接口41 连接，所述透明定量容器4的第三接口43通过PEEK管线与所述第三三通的第一出口82连接，所述第三三通的第二出口83通过PEEK管线与所述蛋白纯化系统的层析柱6的入口连接，所述蛋白纯化系统进样系统六通阀的接口7通过PEEK管线与所述第二三通的入口51连接，所述第二三通的第一出口52通过PEEK管线与所述透明定量容器4的第二接口42连接，所述第二三通的第二出口53通过PEEK管线与所述第三三通的入口81连接，各个 PEEK管线是相同型号的管线，均为1/16″*0.01″peek管线。

采用本实用新型所述的装置可以实现以下应用：

具体应用1：密度梯度分离仪分离出的蛋白溶液需要置换缓冲buffer条件，将层析柱部分换成脱盐柱，直接在线连接收集，最后收集溶于蛋白层析系统流动相中的蛋白溶液即可。

具体应用2：很多精细纯化的蛋白后续可能需要做体外互作的实验，例如使用Octet Red96进行蛋白与其他分子互作结合实验，或者利用微量热泳动仪进行蛋白与其他分子互作的实验。利用Octet Red96进行实验，一般需要对蛋白进行生物素化标记。微量热泳动仪一般需要对蛋白进行染料标记。这两个标记反应结束后平时操作都需要手动用分子筛小柱子将小分子和蛋白分开。利用本实用新型所述装置，可以在密度梯度离心分离得到的蛋白流入透明定量容器中，在蛋白纯化系统进样定量环中加入生物素标记试剂或者染料标记试剂。将上述标记试剂通过蛋白纯化系统六通阀打入透明定量容器中，与蛋白溶液进行混合标记后，经过蛋白纯化系统分子筛层析柱分离得到标记后的蛋白溶液，方便快速进行后续生物互作实验。

综上所述，本实用新型所述的装置可以实现以下功能：(1)全自动密度梯度分离仪分离得到的蛋白，核酸、病毒等溶液可以在线与蛋白纯化系统联用实现精细纯化，速度快且搭建成本低。(2)蛋白纯化系统的进样环里生物分子也可以进入该装置中的透明定量容器，与密度梯度离心分离得到的溶液可以进行混合、孵育、结合等再进入蛋白纯化系统进行分离纯化收集。

以上详细描述了本实用新型的优选实施方式，但是，本实用新型并不限于此。在本实用新型的技术构思范围内，可以对本实用新型的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本实用新型所公开的内容，均属于本实用新型的保护范围。

Claims (10)

1.一种全自动密度梯度分离仪与蛋白纯化系统联用装置，其特征在于，该装置包括全自动密度梯度分离仪、第一三通、在线过滤器(3)、透明定量容器(4)、第二三通、第三三通、PEEK管线和蛋白纯化系统，所述透明定量容器(4)的上端设置有第一接口(41)和第二接口(42)，所述透明定量容器(4)的下端设置有第三接口(43)，所述全自动密度梯度分离仪的在线紫外检测器(1)的出口通过PEEK管线与所述第一三通的入口(21)连接，所述第一三通的第一出口(22)通过PEEK管线与废液收集管(9)连接，所述第一三通的第二出口(23)通过PEEK管线与所述在线过滤器(3)的进口连接，所述在线过滤器(3)的出口通过PEEK管线与所述透明定量容器(4)的第一接口(41)连接，所述透明定量容器(4)的第三接口(43)通过PEEK管线与所述第三三通的第一出口(82)连接，所述第三三通的第二出口(83)通过PEEK管线与所述蛋白纯化系统的层析柱(6)的入口连接，所述蛋白纯化系统进样系统六通阀的接口(7)通过PEEK管线与所述第二三通的入口(51)连接，所述第二三通的第一出口(52)通过PEEK管线与所述透明定量容器(4)的第二接口(42)连接，所述第二三通的第二出口(53)通过PEEK管线与所述第三三通的入口(81)连接。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第一三通、第二三通和第三三通均为带截止阀的三通。

3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第一接口(41)为螺纹接口。

4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第二接口(42)为螺纹接口。

5.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第三接口(43)为螺纹接口。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的装置，其特征在于，所述PEEK管线可以是相同型号的管线，也可以是不同型号的管线。

7.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述在线过滤器(3)内部装有一次性滤芯。

8.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述透明定量容器(4)为透明定量瓶或透明定量管。

9.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述透明定量容器(4)为1-10mL的透明定量容器。

10.根据权利要求8或9所述的装置，其特征在于，所述透明定量容器(4)为1mL、2mL、5mL或10mL的透明定量容器。

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