JPS6261922A - 水溶液から蛋白質を分離するための改良方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野：　本発明は、たとえば、血漿又はその画分
及び生物工学的な（ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）製造
方法音用いて得た組織培養液のような水性の系から、塩
分配方法（ｓａｌｔ　　ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって治療的に活性な蛋白質類及
び核酸類を分離するための改良方法に関し、且つそれ全
目的としている。

従来の方法の記述：　血漿は、たとえｉ４、ａ、　Ｊ。

コーンら、ジャーナル・オフ・アメリカン・ケミカル・
ソサエティー、６Ｂ、４５９（１９４６）及びコーン、
米国特許第２，３９　Ｇ、０７４号に開示されているコ
ーン分画法によって、それから治療的に活性な蛋白質全
分離するために、よく知られた方法で分画することがで
きる。

血漿又はその両分から単離し且つ回収するととができる
治療的に活性な蛋白質の中には、アルファー１　アンチ
トリズシン（アルファ−４−プロテイナーゼ抑制因子と
して且つ略称＠ＰＩ　”としても呼ばれる）を挙げるこ
とができる。

アルファー１−７″ロテイナーゼ抑制因子（ｉｎｈｔｂ
ｉｔｏｒ）は、パネルら、ビオケミストリー、工３，５
４３９（１９７４）；サクラトバラら、ビオケミカル・
ジャーナル、１５７．３３９（１９７６）：ムシアニラ
、ビオケミストリー、二、７９８（１９７５）：クレス
ら、プレノぐラテイブ・ビオケミストリー、４（６）、
５４１（１９７３）ニゲレーザーら、同上、旦（４）、
３３３（１９７５）：ハオら、グロシーテイング・オフ
・ザ・インターナショナル・ワークショップ・オン・テ
クノロジー場フオーグロテイン・セパレーショ、ン・ア
ンド・イングループメント・オフ・ブラッド・グラズマ
・フラクショネーション、１９７７年９月７〜９日開イ
損、バージニア州ルストン；及びコーン及びブロックウ
ェー、米国特許第４．５７９．０８７号、同４．４３９
．３５８号罠記されているような多くの方法によって、
血漿から単離することができる。取得されるＰＩ″Ｊｋ
含有する両分、たとえはコーン画分■、ｆｌ／−１、及
び流出液１１＋ＩＩＩを、次いで１回以上のクロマドグ
２フイ一分離工程にかけて不必要な蛋白質を除去する。

公知の方法に、ＰＩを単離するために有用であるけれど
も、これらの方法は、使用する温度とｐＨのような苛酷
な物理的条件によシ生じる変性、使用する沈殿剤による
化学的変性、クロマトクラフィー分離工程における望ま
しくない蛋白質の不完全な分離、及び公知の方法によっ
て取得される最終沈、殿物及び溶液からの不完全な回収
のための収率の低下を包含する欠点を有している。

免役グロブリンは、上記のコーン分画方法を包含する多
くの公知の方法によって、血漿から分離されている。さ
らに加えて、主としてＩｇＧ免疫グロブリンから成る、
静脈注射可能な免疫血清グロブリンは、テノルド、米国
特許第４．３９へ６０８号及び４．４９９．０７５号に
開示するようにして、取得することができる。免疫グロ
ブリンＭは組織培養技術の修飾によって製造することが
できる。

ヒトの血清アルブミンは、たとえば、シュナイダーら、
米国特許第４．１５６．６８１号：イパノフら、米国特
許第４９２６．９３９号；シャックら第４．０７５，１
９７号；ハンセンら、米国特許第４゜１１ス１８８号；
グランら、米国特許第４９９２゜３６７号；及びピンク
、米国特許第２，９５８，６２８号によって開示されて
いるもののような方法により、血漿から単離することが
できる。

核酸、たとえばＤＮＡ、は動物の組織から単離すること
ができ、又は公知の方法を用いるｒ”ＤＮＡ技術によっ
て製造することができる。

免疫グロブリン、ヒトの血清アルブミン及び核酸の単離
と回収のための公知の方法は、ＰＩに対する上記のもの
と同様な欠点を有している。

発明の要約 本発明は、（１）治療的に活性な蛋白質類及び核酸類か
ら成るグループの中の少なくとも一員、及び（２）少な
くとも部分的に水と混和性であり且つポリアルキレング
リコール、セルロース性骨格を有する重合体及びポリア
クリルアミド骨格を有する重合体から成るグループから
選んだ、水性の系中で２液相七与える能力を有している
、少なくとも１０重合体成分を含有する該水性の系から
、治療的に活性な蛋白質及び核酸から成るグループの中
の該少なくとも一員全分嬢するだめの方法であって、こ
の方法は、該水性の系に対して、それｆ：２液相に分離
するために十分な量の水溶性無機塩を添加し、該２液相
の中の一つは治療的に活性な蛋白質及び核酸のグループ
の中の少なくとも該−員の大部分の坂（ｍａｊｏｒ　　
ａｍｏｕｎｔ）　　を含めしていることから成っている
。

好適具体例の説明 本発明の方法に従って、治療的に活性な蛋白質及び／又
１は核酸物質全含有する水性の系は血漿、水中に的解し
た血漿画分、水中に溶解した血漿蛋白質薗縮物、及び生
物工学的製造方法を用いて取得した組織培養液（組織流
体培養基又は１流体培養基′とも呼ばれる）から選択す
る。この方法は、血漿又は組織（ヒトの組織）源から取
イ０したか又は組換え−ＤＮＡ（ｒ−ＤＮＡ）技術、あ
るいは抗体又はモノクローナル抗体技術などを含む生物
工学的製造方法によって取得したかを問わず、アルファ
ー１アンチトリプシン（アルファー１−プロテイナーゼ
抑制因子、又は＠ＰＩ　”）；免疫グロブリン、特に免
疫グロブリンＧ及び免疫グロブリンＭ（それぞれ　＠　
１　ｇＧ＃と”ＩｇＭ”）：ヒトの血清アルブミン：及
び、たとえばＤＮＡのような、核酸の中の少なくとも一
つ全含有する水性の系に対して適用するときに特に有用
であることが認められている。

重合体成分は、少なくとも部分的に水中に混和性であり
且つそれを水性の系に加えるときに、２液相、たとえば
、重合体成分に富んだ一相と加えた塩に富んだ他相を生
じる疎水性−親水性を有していなければならない。重合
体成分としては、ポリエチレングリコール及びポリプロ
ピレングリコールのようなポリアルキレングリコール又
はたとえばデキストランのようなセルロース質、あるい
は、広く言えば、炭水化物骨格を有する重合体、又は基
礎アクリルアミドモノマーのアミン部分がポリアクリル
アミドの疎水性−親水性を変化させる公知の置換基で置
換してあってもよいポリアクリルアミド骨格を有する重
合体を用いることができる。重合体成分はポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）であることが好ましい。ポリエチ
レングリコールは約２００〜２α０００、好ましくは約
２．０００〜１０，０００、一層好ましくは約へ０００
〜ａ０００、もつとも好ましくは約４０００〜４．００
０の範囲の分子量を有するものを１吏用することができ
る。

水溶性の塩は、広く、任意の水溶性無機又は有機塩、好
ましくは水溶性無機塩、一層好ましくは二塩基性燐酸カ
リウム；二塩基性硫酸アンモニウム：二塩基性燐酸ナト
リウム：及び二塩基性亜硫酸ナトリウムから成るグルー
プから選択した水溶性無機塩とすることができる。塩は
二塩基性燐酸カリウム及び二塩基性硫酸アンモニウムか
ら選択することがもつとも好ましい。塩は約０５〜２．
０Ｍの濃度で用いることが好ましく、一層好ましくは約
α５〜１．６Ｍ、　もつとも好ましくは約１ｌｌＬ８〜
１．０Ｍの濃度全使用する。

一般に、水性の系は、蛋白質又は核酸のほかに、少なく
ともＰＥＧ及び任意的に、たとえばデキストラン又はポ
リアクリルアミドのような重合体を含有すること及びそ
れに対して水溶性の無機塩が添加しであることが、特に
好適である。

分離する２相中のＰＥＧと蛋白質のｉ：を制御するため
のパラメーターは、ＰＥＧ（又はデキスト２ン）の鎗、
塩、塩濃度、温度、ＰＨ及び容量を包含するが、その中
容量は重要でないかも知れない。

ＰＥＧは好ましくは約１０〜３０％（重量／容量）、一
層好ましくは約１５〜２５％（重量／容量）、もつとも
好ましくは約１０〜２０％（１量／容量）の範囲で使用
すればよい。

本発明の方法の実施において生じる混合物の温度は、約
−５℃乃至約１００℃、好ましくは約−５℃乃至約５０
℃、一層好ましくは約−５℃乃至約２０℃、もつとも好
ましくは約−５℃乃至約５℃の範囲とすることができる
。

本発明の方法の実施において生じる混合物のｐＨは、約
４〜１１、一層好ましくは約５〜９、もつとも好ましく
は約７〜９の範囲とすることができる。

特定の蛋白質、たとえば、アルファー１抗トリプシン、
は広い範囲の条件において低い分離係数（Ｓ、Ｃ，＝Ｐ
ＥＧ相中の量／水相中の量）を示す。比較的高い塩濃度
と高いｐＨは、比較的高い上記のような分離係数をみろ
びく。ＰＩの分離係数はＣＬ６Ｍの塩濃度においてα０
０２５であυ、１．６Ｍの塩では［１００６２に増大す
る。一般に、蛋白質は約α１〜１００の分離係数を示す
。ＰＥＧ分離係数は１．０Ｍの塩濃度において約２００
又はそれ以上に増大する。蛋白質又はその他の分配した
材料を多かれ少なかれ親水性とするためのｐＨの変化は
水溶性の増大又は低下を生じさせる。５〜９の範囲のｐ
　Ｈに一般に分離係数を約１００倍以上に増大させる。

塩濃度の変更によって生じる傾向は、さらに増大させる
ことができる。比較的低い湿度は蛋白質分離係数をほと
んど変化させずにｐＥｃ分離係数を約２〜１倍はど増大
させる。

両成分の間に十分な不溶性が存在する場合に、系中に自
動的に２以上の液相の出現が生じる。ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）と塩（たとえば燐酸二カリウム）から
成る水性の系においては、上相ＨＰＥＧに富み、下相は
塩に富んでいる。

変化させることができるパラメーターは以下のものを包
含する： （、）　　在要重合体（たとえばＰＥＧ　）の化学的成
分と分子量。

（ｂ）　　第二の添加剤（たとえば重合体、塩）の化学
的成分。

（ｃ）　　添加剤の濃度。

（ｄ）　　ｐ）Ｉｏ （、）　　温度。

分配相の使用は、分離のためのその他の広く用いられる
方法よりも、いくつかの利点を有している。（１）物理
的及び化学的パラメーターを制御することによって変性
を最低限とすることができる。

単なる混合を必要とするのみであるが、分離を促進する
ために、遠心分離を用いてもよい。剪断は（江とんど排
除される。重会体と塩の適切な選択は変性剤への暴露を
低下させる。（２）条件全特定の単離の必要条件に合わ
すことによって、他の方法によっては得られない分離の
基盤（ｐＨに基づく化学的親和性と溶解性及び塩の存在
）を提供することができる。（３）最低の資本投下のも
とで、どのような麓の材料拠対しても適応するように容
易にプロセスを変更させることができる。

一般的な生成物以外に、この方法は独特の可能性によっ
て、生物工学的な分離に対して適用することができる。

相の分配は、別の操作の範囲内で、成分を分離すること
を可能とする。物質の製造（たとえは醗酵とその後の細
胞分＃１）を簡単化す相に残すことが可能である。アル
ファアミラーゼは上相に分配され、枯草菌細胞は下相に
分配される。生物学的に活性な物質の製造は、二つの理
由によって、細胞又は細胞成分からの生成物の除去によ
り、増進させることができる： （１）培養基中になお存在する細胞外又は細胞内酵素に
よる生成物の減成が防がれる、 （２）生成物の除去は、細胞の生長又は生産の負のフィ
ードバック抑制を低下させる。

この方法は、速度及び大１の処理の容易さの点で、独特
であるが、これは過敏な系に対してね必須のことである
。

蛋白質又は核散を含有する水性の系からそれらを分離す
るための本発明の方法の使用は、組織培養液中で細胞を
崩壊させそれによって退化する酵素と共に所望の蛋白質
と細胞内生成Ｊ’を解放させるために、特に有用である
。本発明の方法の使用によって、水性の組織培養液を分
配することにより、生物工学的生産プロセスによって製
造した物質の細胞成分及び退化酵素からの迅速な大量分
離を達成することができる。

材料／方法：　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ５３５
０　）ｉ；Ｌユニオン・カーバイドから取得した。

ＰＥＧ５３５０は３３００〜３４０００分子量全３４０
０る。試剤（二塩基性燐酸カリウム、燐酸）は、Ｊ、Ｔ
、ベーカーから取得した１ベ一カー分析”試薬級でめっ
た。系全ファルコンポリプロピレン遠心分離管中で平衡
化した。

下記の物質を用いて簡単な系（限られた成分による）を
設計した。ｉ介した、コウゾの胸腺ＤＮＡはシグマから
取得した。蛋白質源は容器内でｖ／Ａｉし、次いで透析
して低濃度塩溶液とした。

ヒトの血清アルブミンと免疫グロブリンＧ（Ｉ　ｇＧ　
）は血漿から誘導した。ヒトの免疫グロブリンＭ（Ｉｇ
Ｍ）は組織培養物により生産し且つ精製した。複合体系
（不確定）はアルファー１抗トリプシン（アルファー１
）及びアルブミンを含有するコーン血漿分画の中間材料
によって調製した。

単純な系において、２０％の重量／容１ＰＥＧと適当な
塩によるＰＥＧ／塩系全激しく混合して、燐酸によって
ｐＨを調節した。緩衝してない溶液中の蛋白質譲縮物を
１０η／ｒｒ１ｔｃＤ濃度まで加えた。

この複合系においては、ＰＥＧと塩を血漿画分に加えた
。規定温度で穏やかに動遥させることＫよって系を混合
した。混合物を終夜沈降させたのち、２０００ＲＣＦで
遠心分離した。

試料をブラッドフォード蛋白質分析による２８Ｏｒ＋ｍ
における吸収及びラジアル免疫拡散板（ヘレナ研究所）
によって分析した。ＤＮＡ１ｑ修飾したバートン、ギブ
ス及びマイヤーズの方法によって分析した。

結果 塩濃度の増大又はその他のｔ４ラメ−ターの変化につれ
て２相の間の相対的な容量か変化した。一般に、容量比
（ＰＥＧ／水系）は塩濃度又はグロットの増大につれて
低下した。成分又は成分濃度の動逼（たとえば燐酢又は
その他の酸によるｐＨの調節）さらに大きな変化を与え
る。たとえば、塩酸によるｐＨの調節は、ｐＨａ５以下
で界面が生成するのを妨げる。

ＤＭＡ、アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びアルファー１
は同様な傾向に従う。アルブミンによる結果は他の物質
におけるよシも一貫性が低い。塩濃度の増大につれて水
相中の物質の濃度が低下し且つ分離係数が増大する。ｐ
Ｈの上昇によっても同じ傾向が表われる。さらに、これ
らの傾向は、いくらか加成性であるように思われる：す
なわち塩濃度とｐ　Ｈの上昇は最高の分離係数を与える
。

温度変化はほとんど変化しない混合した結果を与える。

ｐ　）１９における分離係数の集約上図に示す。アルフ
ァー１を除けば相対値は同様である。アルファー１の低
い値（α００２〜α００６の範囲）は塩及びｐｉと共に
増大し、水相に対する遥かに大きな親和性２示している
。アルファー１と他の蛋白質の間の相違はアルファー１
の固有の性質（たとえば低い疎水性）又はアルファー１
を吸引する水相中の汚染物の存在又はアルファー１を反
発するＰＥＧ相中の汚染物の存在の何れかによるものと
思われる。

【図面の簡単な説明】

図は本発明の方法のｐＨ９における分隠係数と塩濃度の
関係を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（１）治療的に活性な蛋白質類及び核酸類からなる
   群よりの少くとも１員及び（２）ポリアルキレングリコ
   ール、セルロース性骨格を有する重合体及びポリアクリ
   ルアミド骨格を有する重合体からなる群から選ばれ、少
   くとも部分的に水と混和性であり且つ水性系の中に２相
   を生じさせる能力を有する少なくとも一の重合体成分を
   、含有する水性糸から治療的に活性な蛋白質類及び核酸
   類からなる群の中の少くとも一員を分離する方法であつ
   て、該水性系に水性系を２液相に分離させるのに十分な
   量の水溶性無機塩を加え、該２液相の一つが治療的に活
   性な蛋白質類と核酸類からなる群の中の少なくとも１員
   の主要量を含有する方法。 ２、該水性系は血漿、水中に溶解した血漿画分、水中に
   溶解した血漿蛋白質濃縮物、及び生物工学的製造プロセ
   スを用いて得た組織培養液から選択する、特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３、治療的に活性な蛋白質は、アルファー１抗トリプシ
   ン、免疫グロブリン及びヒトの血清アルブミンから成る
   グループの一員であり且つ該核酸はＤＮＡである、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ４、該塩は水溶性であり、該無機塩は（１）二塩基性燐
   酸カリウム；（２）二塩基性硫酸アンモニウム；（３）
   二塩基性燐酸ナトリウム；及び（４）二塩基性亜硫酸ナ
   トリウムから成るグループから選択した少なくとも一員
   である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、該重合体成分はポリエチレングリコールとポリプロ
   ピレングリコールを包含するポリアルキレングリコール
   及び該セルロース性骨格重合体デキストランのグループ
   から選択する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、該塩は該水性の系中に約０．５Ｍ乃至約２．０Ｍの
   範囲の塩濃度を与えるために十分な量で該水性の系に添
   加し且つ生成する混合物を十分に撹拌して添加した塩を
   溶解したのち、約−５℃乃至約１００℃の範囲の温度で
   約４乃至約１１の範囲のｐＨにおいて約１時間乃至約２
   ４時間保持する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、該塩濃度は約０．５Ｍ乃至約１．６Ｍの範囲であり
   、該温度は約−５℃乃至約５０℃の範囲であり、且つ該
   ｐＨは約５乃至約９の範囲である、特許請求の範囲第６
   項記載の方法。 ８、該塩濃度は約０．８Ｍ乃至約１．０Ｍの範囲であり
   、該温度は−５℃乃至約２０℃の範囲であり且つ該ｐＨ
   は約７乃至約９の範囲である、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ９、（ａ）アルファー１−プロテイナーゼ抑制因子を含
   有する水溶液を約６．５〜８．５のｐＨ及び約２〜５０
   ℃の温度において、約０．２〜２４時間にわたつて保持
   し、 （ｂ）段階（ａ）からの溶液をアルファ−１−プロテイ
   ナーゼ抑制因子を含有する水溶液の容量に基づいて、約
   ８％乃至約２３％（重量／容量）のポリアルキレングリ
   コールと混合し且つアルファ−１−プロテイナーゼを沈
   殿させることなしに混合物から不要な蛋白質を選択的に
   沈殿させるために十分な時間にわたり且つそのために十
   分な温度において、混合物のｐＨを約４．６乃至約７．
   ５に調節し、その際使用するポリアルキレングリコール
   の量はｐＨ約４．６における８％乃至１０％からｐＨ７
   ．５における約２０％乃至２３％まで変えることができ
   且つｐＨの０．５の上昇について約２％乃至約３％の範
   囲で漸進的に増大させることができ、且つ （ｃ）段階（ｂ）からの溶液からアルファ−１−プロテ
   イナーゼを分離する 段階から成る、アルファ−１−プロテイナーゼ抑制因子
   を含有する水溶液からの該抑制因子の分離のための方法
   において、約−５℃乃至約５℃の温度と約５乃至約９の
   ｐＨにおける該混合物への約０．５Ｍ乃至約１．６Ｍの
   少なくとも一の水溶性無機塩の添加により、不要の蛋白
   質の存在しないアルファ−４−プロテイナーゼ抑制因子
   を含有する水溶液を取得する塩分配方法によつて、該混
   合物からアルファ−１−プロテイナーゼ抑制因子を分離
   することを特徴とする改良。