JPH0784478B2 - 水溶液から蛋白質を分離するための改良方法 - Google Patents
水溶液から蛋白質を分離するための改良方法Info
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- JPH0784478B2 JPH0784478B2 JP61210830A JP21083086A JPH0784478B2 JP H0784478 B2 JPH0784478 B2 JP H0784478B2 JP 61210830 A JP61210830 A JP 61210830A JP 21083086 A JP21083086 A JP 21083086A JP H0784478 B2 JPH0784478 B2 JP H0784478B2
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野：本発明は、たとえば、血漿又はその画分及
び生物工学的な（biotechnology）製造方法を用いて得
た組織培養液のような水性の系から、塩分配方法（salt
partitioning technology）によつて治療的に活性な蛋
白質類及び核酸類を分離するための改良方法に関し、且
つそれを目的としている。
び生物工学的な（biotechnology）製造方法を用いて得
た組織培養液のような水性の系から、塩分配方法（salt
partitioning technology）によつて治療的に活性な蛋
白質類及び核酸類を分離するための改良方法に関し、且
つそれを目的としている。
従来の方法の記述：血漿は、たとえば、E.J.コーンら、
ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイ
ー、68、459（1946）及びコーン、米国特許第2,390,074
号に開示されているコーン分画法によつて、それから治
療的に活性な蛋白質を分離するために、よく知られた方
法で分画することができる。
ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイ
ー、68、459（1946）及びコーン、米国特許第2,390,074
号に開示されているコーン分画法によつて、それから治
療的に活性な蛋白質を分離するために、よく知られた方
法で分画することができる。
血漿又はその画分から単離し且つ回収することができる
治療的な活性な蛋白質の中には、アルフア−１ アンチ
トリプシン（アルフア−１−プロテイナーゼ抑制因子と
して且つ略称“PI"としても呼ばれる）を挙げることが
できる。
治療的な活性な蛋白質の中には、アルフア−１ アンチ
トリプシン（アルフア−１−プロテイナーゼ抑制因子と
して且つ略称“PI"としても呼ばれる）を挙げることが
できる。
アルフア−１−プロテナーゼ抑制因子（inhibitor）
は、パネルら、ビオケミストリー、13、5439（1974）；
サクラトバラら、ビオケミカル・ジヤーナル、157、339
（1976）；ムシアニら、ビオケミストリー、15、798（1
976）；クレスら、プレパラテイブ・ビオケミストリ
ー、3 （６）、541（1973）；グレーザーら、同上、5
（４）、333（1975）；ハオら、プロシーデイング・オ
ブ・ザ・インターナシヨナル・ワークシヨツプ・オン・
テクノロジー・フオープロテイン・セパレーシヨン・ア
ンド・インプルーブメント・オブ・ブラツド・プラズマ
・フラクシヨネーシヨン、1977年９月７〜９日開催、バ
ージニア州、レストン；及びコーン及びブロツクウエ
ー、米国特許第4,379,087号、同4,439,358号に記載され
ているような多くの方法によつて、血漿から単離すこと
ができる。また、特開昭58-225023号公報には、血漿画
分の水性溶液を一定の温度で一定のpH条件下に維持した
後、ポリエチレングリコールのような水溶性重合体を添
加し、次いでpHを特定範囲に調節することで、所望でな
い蛋白質を優先的に沈殿させ、一方PIを重合体溶液から
分離する方法が開示されている。取得されるPIを含有す
る画分、たとえばコーン画分IV、IV−１、及び流出液II
＋IIIを、次いで１回以上のクロマトグラフイー分離工
程にかけて不必要な蛋白質を除去する。公知の方法はPI
を単離するために有用であるけれども、これらの方法
は、使用する温度とpHのような苛酷な物理的条件により
生じる変性、使用する沈殿剤による化学的変性、クロマ
トグラフイー分離工程における望ましくない蛋白質の不
完全な分離、及び公知の方法によつて取得される最終沈
殿物及び溶液からの不完全な回収のための収率の低下を
包含する欠点を有している。
は、パネルら、ビオケミストリー、13、5439（1974）；
サクラトバラら、ビオケミカル・ジヤーナル、157、339
（1976）；ムシアニら、ビオケミストリー、15、798（1
976）；クレスら、プレパラテイブ・ビオケミストリ
ー、3 （６）、541（1973）；グレーザーら、同上、5
（４）、333（1975）；ハオら、プロシーデイング・オ
ブ・ザ・インターナシヨナル・ワークシヨツプ・オン・
テクノロジー・フオープロテイン・セパレーシヨン・ア
ンド・インプルーブメント・オブ・ブラツド・プラズマ
・フラクシヨネーシヨン、1977年９月７〜９日開催、バ
ージニア州、レストン；及びコーン及びブロツクウエ
ー、米国特許第4,379,087号、同4,439,358号に記載され
ているような多くの方法によつて、血漿から単離すこと
ができる。また、特開昭58-225023号公報には、血漿画
分の水性溶液を一定の温度で一定のpH条件下に維持した
後、ポリエチレングリコールのような水溶性重合体を添
加し、次いでpHを特定範囲に調節することで、所望でな
い蛋白質を優先的に沈殿させ、一方PIを重合体溶液から
分離する方法が開示されている。取得されるPIを含有す
る画分、たとえばコーン画分IV、IV−１、及び流出液II
＋IIIを、次いで１回以上のクロマトグラフイー分離工
程にかけて不必要な蛋白質を除去する。公知の方法はPI
を単離するために有用であるけれども、これらの方法
は、使用する温度とpHのような苛酷な物理的条件により
生じる変性、使用する沈殿剤による化学的変性、クロマ
トグラフイー分離工程における望ましくない蛋白質の不
完全な分離、及び公知の方法によつて取得される最終沈
殿物及び溶液からの不完全な回収のための収率の低下を
包含する欠点を有している。
免疫グロブリンは、上記のコーン分画方法を包含する多
くの公知の方法によつて、血漿から分離されている。さ
らに加えて、主としてIgG免疫グロブリンから成る、静
脈注射可能な免疫血清グロブリンは、テノルド、米国特
許第4,396,608号及び4,499,073号に開示するようにし
て、取得することができる。免疫グロブリンＭは組織培
養技術の修飾によつて製造することができる。
くの公知の方法によつて、血漿から分離されている。さ
らに加えて、主としてIgG免疫グロブリンから成る、静
脈注射可能な免疫血清グロブリンは、テノルド、米国特
許第4,396,608号及び4,499,073号に開示するようにし
て、取得することができる。免疫グロブリンＭは組織培
養技術の修飾によつて製造することができる。
ヒトの血清アルブミンは、たとえば、シユナイダーら、
米国特許第4,156,681号；イバノフら、米国特許第3,92
6,939号；シヤツクら第4,075,197号；ハンセンら、米国
特許第4,17.7,188号；プランら、米国特許第3,992,367
号；及びヒンク、米国特許第2,958,628号によつて開示
されているもののような方法により、血漿から単離する
ことができる。
米国特許第4,156,681号；イバノフら、米国特許第3,92
6,939号；シヤツクら第4,075,197号；ハンセンら、米国
特許第4,17.7,188号；プランら、米国特許第3,992,367
号；及びヒンク、米国特許第2,958,628号によつて開示
されているもののような方法により、血漿から単離する
ことができる。
核酸、たとえばDNA、は動物の組織から単離することが
でき、又は公知の方法を用いるｒ−DNA技術によつて製
造することができる。
でき、又は公知の方法を用いるｒ−DNA技術によつて製
造することができる。
免疫グロブリン、ヒトの血清アルブミン及び核酸の単離
と回収のための公知の方法は、PIに対する上記のものと
同様な欠点を有している。
と回収のための公知の方法は、PIに対する上記のものと
同様な欠点を有している。
発明の要約 本発明は、（１）治療的に活性な蛋白質類及び核酸類か
ら成るグループの中の少なくとも一員、及び（２）少な
くとも部分的に水と混和性であり且つポリアルキレング
リコール、セルロース性骨格を有する重合体及びポリア
クリルアミド骨格を有する重合体から成るグループから
選んだ、水性の系中で２液相を与える能力を有してい
る、少なくとも１の重合体成分を含有する該水性の系か
ら、治療的に活性な蛋白質及び核酸から成るグループの
中の該少なくとも一員を分離するための方法であつて、
この方法は、該水性の系に対して、それを２液相に分離
するために十分な量の水溶性無機塩を添加し、該２液相
の中の一つは治療的に活性な蛋白質及び核酸のグループ
の中の少なくとも該一員の大部分の量（major amount）
を含有していることから成つている。
ら成るグループの中の少なくとも一員、及び（２）少な
くとも部分的に水と混和性であり且つポリアルキレング
リコール、セルロース性骨格を有する重合体及びポリア
クリルアミド骨格を有する重合体から成るグループから
選んだ、水性の系中で２液相を与える能力を有してい
る、少なくとも１の重合体成分を含有する該水性の系か
ら、治療的に活性な蛋白質及び核酸から成るグループの
中の該少なくとも一員を分離するための方法であつて、
この方法は、該水性の系に対して、それを２液相に分離
するために十分な量の水溶性無機塩を添加し、該２液相
の中の一つは治療的に活性な蛋白質及び核酸のグループ
の中の少なくとも該一員の大部分の量（major amount）
を含有していることから成つている。
好適具体例の説明 本発明の方法に従つて、治療的に活性な蛋白質及び／又
は核酸物質を含有する水性の系は血漿、水中に溶解した
血漿画分、水中に溶解した血漿蛋白質濃縮物、及び生物
工学的製造方法を用いて取得した組織培養液（組織流体
培養基又は“流体培養基”とも呼ばれる）から選択す
る。この方法は、血漿又は組織（ヒトの組織）源から取
得したか又は組換え−DNA（ｒ−DNA）技術、あるいは抗
体又はモノクローナル抗体技術などを含む生物工学的製
造方法によつて取得したかを問わず、アルフア−１アン
チトリプシン（アルフア−１−プロテイナーゼ抑制因
子、又は“PI"）；免疫グロブリン、特に免疫グロブリ
ンＧ及び免疫グロブリンＭ（それぞれ、“IgG"と“Ig
M"）；ヒトの血清アルブミン；及び、たとえばDNAのよ
うな、核酸の中の少なくとも一つを含有する水性の系に
対して適用するときに特に有用であることが認められて
いる。
は核酸物質を含有する水性の系は血漿、水中に溶解した
血漿画分、水中に溶解した血漿蛋白質濃縮物、及び生物
工学的製造方法を用いて取得した組織培養液（組織流体
培養基又は“流体培養基”とも呼ばれる）から選択す
る。この方法は、血漿又は組織（ヒトの組織）源から取
得したか又は組換え−DNA（ｒ−DNA）技術、あるいは抗
体又はモノクローナル抗体技術などを含む生物工学的製
造方法によつて取得したかを問わず、アルフア−１アン
チトリプシン（アルフア−１−プロテイナーゼ抑制因
子、又は“PI"）；免疫グロブリン、特に免疫グロブリ
ンＧ及び免疫グロブリンＭ（それぞれ、“IgG"と“Ig
M"）；ヒトの血清アルブミン；及び、たとえばDNAのよ
うな、核酸の中の少なくとも一つを含有する水性の系に
対して適用するときに特に有用であることが認められて
いる。
重合体成分は、少なくとも部分的に水中に混和性であり
且つそれを水性の系に加えるときに、２液相、たとえ
ば、重合体成分に富んだ一相と加えた塩に富んだ他相を
生じる疎水性−親水性を有していなければならない。重
合体成分としては、ポリエチレングリコール及びポリプ
ロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール
又はたとえばデキストランのようなセルロース質、ある
いは、広く言えば、炭水化物骨格を有する重合体、又は
基礎アクリルアミドモノマーのアミノ部分がポリアクリ
ルアミドの疎水性−親水性を変化させる公知の置換基で
置換してあつてもよいポリアクリルアミド骨格を有する
重合体を用いることができる。重合体成分はポリエチレ
ングリコール（PEG）であることが好ましい。ポリエチ
レングリコールは約200〜20,000、好ましくは約2,000〜
10,000、一層好ましくは約3,000〜8,000、もつとも好ま
しくは約3,000〜4,000の範囲の分子量を有するものを使
用することができる。
且つそれを水性の系に加えるときに、２液相、たとえ
ば、重合体成分に富んだ一相と加えた塩に富んだ他相を
生じる疎水性−親水性を有していなければならない。重
合体成分としては、ポリエチレングリコール及びポリプ
ロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール
又はたとえばデキストランのようなセルロース質、ある
いは、広く言えば、炭水化物骨格を有する重合体、又は
基礎アクリルアミドモノマーのアミノ部分がポリアクリ
ルアミドの疎水性−親水性を変化させる公知の置換基で
置換してあつてもよいポリアクリルアミド骨格を有する
重合体を用いることができる。重合体成分はポリエチレ
ングリコール（PEG）であることが好ましい。ポリエチ
レングリコールは約200〜20,000、好ましくは約2,000〜
10,000、一層好ましくは約3,000〜8,000、もつとも好ま
しくは約3,000〜4,000の範囲の分子量を有するものを使
用することができる。
水溶性の塩は、広く、任意の水溶性無機又は有機塩、好
ましくは水溶性無機塩、一層好ましくは二塩基性燐酸カ
リウム；二塩基性硫酸アンモニウム；二塩基性燐酸ナト
リウム；及び二塩基性亜硫酸ナトリウムから成るグルー
プから選択した水溶性無機塩とすることができる。塩は
二塩基性燐酸カリウム及び二塩基性硫酸アンモニウムか
ら選択することがもつとも好ましい。塩は約0.5〜2.0M
の濃度で用いることが好ましく、一層好ましくは約0.5
〜1.6M、もつとも好ましくは約0.8〜1.0Mの濃度を使用
する。
ましくは水溶性無機塩、一層好ましくは二塩基性燐酸カ
リウム；二塩基性硫酸アンモニウム；二塩基性燐酸ナト
リウム；及び二塩基性亜硫酸ナトリウムから成るグルー
プから選択した水溶性無機塩とすることができる。塩は
二塩基性燐酸カリウム及び二塩基性硫酸アンモニウムか
ら選択することがもつとも好ましい。塩は約0.5〜2.0M
の濃度で用いることが好ましく、一層好ましくは約0.5
〜1.6M、もつとも好ましくは約0.8〜1.0Mの濃度を使用
する。
一般に、水性の系は、蛋白質又は核酸のほかに、少なく
ともPEG及び任意的に、たとえばデキストラン又はポリ
アクリルアミドのような重合体を含有すること及びそれ
に対して水溶性の無機塩が添加してあることが、特に好
適である。
ともPEG及び任意的に、たとえばデキストラン又はポリ
アクリルアミドのような重合体を含有すること及びそれ
に対して水溶性の無機塩が添加してあることが、特に好
適である。
分離する２相中のPEGと蛋白質の量を制御するためのパ
ラメーターは、PEG（又はデキストラン）の量、塩、塩
濃度、温度、pH及び容量を包含するが、その中容量は重
要でないかも知れない。
ラメーターは、PEG（又はデキストラン）の量、塩、塩
濃度、温度、pH及び容量を包含するが、その中容量は重
要でないかも知れない。
PEGは好ましくは約10〜30％（重量／容量）、一層好ま
しくは約15〜25％（重量／容量）、もつとも好ましくは
約10〜20％（重量／容量）の範囲で使用すればよい。
しくは約15〜25％（重量／容量）、もつとも好ましくは
約10〜20％（重量／容量）の範囲で使用すればよい。
本発明の方法の実施において生じる混合物の温度は、約
−５℃乃至約100℃、好ましくは約−５℃乃至約50℃、
一層好ましくは約−５℃乃至約20℃、もつとも好ましく
は約−５℃乃至約５℃の範囲とすることができる。
−５℃乃至約100℃、好ましくは約−５℃乃至約50℃、
一層好ましくは約−５℃乃至約20℃、もつとも好ましく
は約−５℃乃至約５℃の範囲とすることができる。
本発明の方法の実施において生じる混合物のpHは、約４
〜11、一層好ましくは約５〜９、もつとも好ましくは約
７〜９の範囲とすることができる。
〜11、一層好ましくは約５〜９、もつとも好ましくは約
７〜９の範囲とすることができる。
特定の蛋白質、たとえば、アルフア−１抗トリプシン、
は広い範囲の条件において低い分離係数（S.C.＝PEG相
中の量／水相中の量）を示す。比較的高い塩濃度と高い
pHは、比較的高い上記のような分離係数をみちびく。PI
の分離係数は0.6Mの塩濃度において0.0025であり、1.6M
の塩では0.0062に増大する。一般に、蛋白質は約0.1〜1
00の分離係数を示す。PEG分離係数は1.0Mの塩濃度にお
いて約200又はそれ以上に増大する。蛋白質又はその他
の分配した材料を多かれ少なかれ親水性とするためのpH
の変化は水溶性の増大又は低下を生じさせる。５〜９の
範囲のpHは一般に分離係数を約100倍以上に増大させ
る。塩濃度の変更によつて生じる傾向は、さらに増大さ
せることができる。比較的低い温度は蛋白質分離係数を
ほとんど変化させずにPEG分離係数を約２〜１倍ほど増
大させる。
は広い範囲の条件において低い分離係数（S.C.＝PEG相
中の量／水相中の量）を示す。比較的高い塩濃度と高い
pHは、比較的高い上記のような分離係数をみちびく。PI
の分離係数は0.6Mの塩濃度において0.0025であり、1.6M
の塩では0.0062に増大する。一般に、蛋白質は約0.1〜1
00の分離係数を示す。PEG分離係数は1.0Mの塩濃度にお
いて約200又はそれ以上に増大する。蛋白質又はその他
の分配した材料を多かれ少なかれ親水性とするためのpH
の変化は水溶性の増大又は低下を生じさせる。５〜９の
範囲のpHは一般に分離係数を約100倍以上に増大させ
る。塩濃度の変更によつて生じる傾向は、さらに増大さ
せることができる。比較的低い温度は蛋白質分離係数を
ほとんど変化させずにPEG分離係数を約２〜１倍ほど増
大させる。
両成分の間に十分な不溶性が存在する場合に、系中に自
動的に２以上の液相の出現が生じる。ポリエチレングリ
コール（PEG）と塩（たとえば燐酸二カリウム）から成
る水性の系においては、上相はPEGに富み、下相は塩に
富んでいる。
動的に２以上の液相の出現が生じる。ポリエチレングリ
コール（PEG）と塩（たとえば燐酸二カリウム）から成
る水性の系においては、上相はPEGに富み、下相は塩に
富んでいる。
変化させることができるパラメーターは以下のものを包
含する： （ａ） 在要重合体（たとえばPEG）の科学的成分と分
子量。
含する： （ａ） 在要重合体（たとえばPEG）の科学的成分と分
子量。
（ｂ） 第二の添加剤（たとえば重合体、塩）の化学的
成分。
成分。
（ｃ） 添加剤の濃度。
（ｄ） pH。
（ｅ） 温度。
分配相の使用は、分離のためのその他の広く用いられる
方法よりも、いくつかの利点を有している。（１）物理
的及び化学的パラメーターを制御することによつて変性
を最低限とすることができる。単なる混合を必要とする
のみであるが、分離を促進するために、遠心分離を用い
てもよい。剪断はほとんど排除される。重合体と塩の適
切な選択は変性剤への暴露を低下させる。（２）条件を
特定の単離の必要条件に合わすことによつて、他の方法
によつては得られない分離の基盤（pHに基づく化学的親
和性と溶解性及び塩の存在）を提供することができる。
（３）最低の資本投下のもとで、どのような量の材料に
対しても適用するように容易にプロセスを変更させるこ
とができる。
方法よりも、いくつかの利点を有している。（１）物理
的及び化学的パラメーターを制御することによつて変性
を最低限とすることができる。単なる混合を必要とする
のみであるが、分離を促進するために、遠心分離を用い
てもよい。剪断はほとんど排除される。重合体と塩の適
切な選択は変性剤への暴露を低下させる。（２）条件を
特定の単離の必要条件に合わすことによつて、他の方法
によつては得られない分離の基盤（pHに基づく化学的親
和性と溶解性及び塩の存在）を提供することができる。
（３）最低の資本投下のもとで、どのような量の材料に
対しても適用するように容易にプロセスを変更させるこ
とができる。
一般的な生成物以外に、この方法は独特の可能性によつ
て、生物工学的な分離に対して適用することができる。
相の分配は、別の操作の範囲内で、成分を分離すること
を可能とする。物質の製造（たとえば醗酵とその後の細
胞分離）を簡単化することができる。PEG/デキストラン
系においては、細胞及び細胞成分は底の相に分離して、
生成物を上相に残すことが可能である。アルフアアミラ
ーゼは上相に分配され、枯草菌細胞は下相に分配され
る。生物学的に活性な物質の製造は、二つの理由によつ
て、細胞又は細胞成分からの生成物の除去により、増進
させることができる： （１） 培養基中になお存在する細胞外又は細胞内酵素
による生成物の減成が防がれる、 （２） 生成物の除去は、細胞の生長又は生産の負のフ
イードバツク抑制を低下させる。
て、生物工学的な分離に対して適用することができる。
相の分配は、別の操作の範囲内で、成分を分離すること
を可能とする。物質の製造（たとえば醗酵とその後の細
胞分離）を簡単化することができる。PEG/デキストラン
系においては、細胞及び細胞成分は底の相に分離して、
生成物を上相に残すことが可能である。アルフアアミラ
ーゼは上相に分配され、枯草菌細胞は下相に分配され
る。生物学的に活性な物質の製造は、二つの理由によつ
て、細胞又は細胞成分からの生成物の除去により、増進
させることができる： （１） 培養基中になお存在する細胞外又は細胞内酵素
による生成物の減成が防がれる、 （２） 生成物の除去は、細胞の生長又は生産の負のフ
イードバツク抑制を低下させる。
この方法は、速度及び大量の処理の容易さの点で、独特
であるが、これは過敏な系に対しては必須のことであ
る。
であるが、これは過敏な系に対しては必須のことであ
る。
蛋白質又は核酸を含有する水性の系からそれらを分離す
るための本発明の方法の使用は、組織培養液中で細胞を
崩壊させそれによつて退化する酵素と共に所望の蛋白質
と細胞内生成物を解放させるために、特に有用である。
本発明の方法の使用によつて、水性の組織培養液を分配
することにより、生物工学的生産プロセスによつて製造
した物質の細胞成分及び退化酵素からの迅速な大量分離
を達成することができる。
るための本発明の方法の使用は、組織培養液中で細胞を
崩壊させそれによつて退化する酵素と共に所望の蛋白質
と細胞内生成物を解放させるために、特に有用である。
本発明の方法の使用によつて、水性の組織培養液を分配
することにより、生物工学的生産プロセスによつて製造
した物質の細胞成分及び退化酵素からの迅速な大量分離
を達成することができる。
材料／方法： ポリエチレングリコール（PEG3350）は
ユニオン、カーバイドから取得した。PEG3350は3300〜3
400の分子量を有している。試剤（二塩基性燐酸カリウ
ム、燐酸）は、J.T.ベーカーから取得した“ベーカー分
析”試薬級であつた。系をフアルコンポリプロピレン遠
心分離管中で平衡化した。
ユニオン、カーバイドから取得した。PEG3350は3300〜3
400の分子量を有している。試剤（二塩基性燐酸カリウ
ム、燐酸）は、J.T.ベーカーから取得した“ベーカー分
析”試薬級であつた。系をフアルコンポリプロピレン遠
心分離管中で平衡化した。
下記の物質を用いて簡単な系（限られた成分による）を
設計した。重合した、コウシの胸腺DNAはシグマから取
得した。蛋白質源は容器内で調製し、次いで透析して低
濃度塩溶液とした。ヒトの血清アルブミンと免疫グロブ
リンＧ（IgG）は血漿から誘導した。ヒトの免疫グロブ
リンＭ（IgM）は組織培養物により生産し且つ精製し
た。複合体系（不確定）はアルフア−１抗トリプシン
（アルフア−１）及びアルブミンを含有するコーン血漿
分画の中間材料によつて調製した。
設計した。重合した、コウシの胸腺DNAはシグマから取
得した。蛋白質源は容器内で調製し、次いで透析して低
濃度塩溶液とした。ヒトの血清アルブミンと免疫グロブ
リンＧ（IgG）は血漿から誘導した。ヒトの免疫グロブ
リンＭ（IgM）は組織培養物により生産し且つ精製し
た。複合体系（不確定）はアルフア−１抗トリプシン
（アルフア−１）及びアルブミンを含有するコーン血漿
分画の中間材料によつて調製した。
単純な系において、20％の重量／容量PEGと適当な塩に
よるPEG/塩系を激しく混合して、燐酸によつてpHを調節
した。緩衝してない溶液中の蛋白質濃縮物を10mg/mlの
濃度まで加えた。この複合系においては、PEGと塩を血
漿画分に加えた。規定温度で穏やかに動遥させることに
よつて系を混合した。混合物を終夜沈降させたのち、20
00RCFで遠心分離した。
よるPEG/塩系を激しく混合して、燐酸によつてpHを調節
した。緩衝してない溶液中の蛋白質濃縮物を10mg/mlの
濃度まで加えた。この複合系においては、PEGと塩を血
漿画分に加えた。規定温度で穏やかに動遥させることに
よつて系を混合した。混合物を終夜沈降させたのち、20
00RCFで遠心分離した。
試料をブラツドフオード蛋白質分析による280nmにおけ
る吸収及びラジアル免疫拡散板（ヘレナ研究所）によつ
て分析した。DNAは修飾したバートン、ギブス及びマイ
ヤーズの方法によつて分析した。
る吸収及びラジアル免疫拡散板（ヘレナ研究所）によつ
て分析した。DNAは修飾したバートン、ギブス及びマイ
ヤーズの方法によつて分析した。
結果 塩濃度の増大又はその他のパラメーターの変化につれて
２相の間の相対的な容量が変化した。一般に、容量比
（PEG/水系）は塩濃度又はプロツトの増大につれて低下
した。成分又は成分濃度の動遥（たとえば燐酸又はその
他の酸によるpHの調節）さらに大きな変化を与える。た
とえば、塩酸によるpHの調節は、pH5.5以下で界面が生
成するのを妨げる。
２相の間の相対的な容量が変化した。一般に、容量比
（PEG/水系）は塩濃度又はプロツトの増大につれて低下
した。成分又は成分濃度の動遥（たとえば燐酸又はその
他の酸によるpHの調節）さらに大きな変化を与える。た
とえば、塩酸によるpHの調節は、pH5.5以下で界面が生
成するのを妨げる。
DMA、アルブミン、IgG、IgM及びアルフア−１は同様な
傾向に従う。アルブミンによる結果は他の物質における
よりも一貫性が低い。塩濃度の増大につれて水相中の物
質の濃度が低下し且つ分離係数が増大する。pHの上昇に
よつても同じ傾向が表われる。さらに、これらの傾向
は、いくらか加成性であるように思われる：すなわち塩
濃度とpHの上昇は最高の分離係数を与える。温度変化は
ほとんど変化しない混合した結果を与える。
傾向に従う。アルブミンによる結果は他の物質における
よりも一貫性が低い。塩濃度の増大につれて水相中の物
質の濃度が低下し且つ分離係数が増大する。pHの上昇に
よつても同じ傾向が表われる。さらに、これらの傾向
は、いくらか加成性であるように思われる：すなわち塩
濃度とpHの上昇は最高の分離係数を与える。温度変化は
ほとんど変化しない混合した結果を与える。
pH9における分離係数の集約を図に示す。アルフア−１
を除けば相対値は同様である。アルフア−１の低い値
（0.002〜0.006の範囲）は塩及びpHと共に増大し、水相
に対する遥かに大きな親和性を示している。アルフア−
１と他の蛋白質の間の相違はアルフア−１の固有の性質
（たとえば低い疎水性）又はアルフア−１を吸引する水
相中の汚染物の存在又はアルフア−１を反発するPEG相
中の汚染物の存在の何れかによるものと思われる。
を除けば相対値は同様である。アルフア−１の低い値
（0.002〜0.006の範囲）は塩及びpHと共に増大し、水相
に対する遥かに大きな親和性を示している。アルフア−
１と他の蛋白質の間の相違はアルフア−１の固有の性質
（たとえば低い疎水性）又はアルフア−１を吸引する水
相中の汚染物の存在又はアルフア−１を反発するPEG相
中の汚染物の存在の何れかによるものと思われる。
図は本発明の方法のpH9における分離係数と塩濃度の関
係を示す。
係を示す。
Claims (6)
- 【請求項１】（１）治療的に活性な蛋白質類及び核酸類
からなる群よりの少なくとも１員及び（２）ポリアルキ
レングリコール、セルロース性骨格を有する重合体及び
ポリアクリルアミド骨格を有する重合体からなる群から
選ばれ、少なくとも部分的に水と混和性であり且つ水性
系の中に２相を生じさせる能力を有する少なくとも一の
重合体成分を、含有する水性系に水性系を２液相に分離
させるのに十分な量の水溶性無機塩を加えて混合物を形
成することにより治療的に活性な蛋白質類及び核酸類か
らなる群からアルフア−１−プロテイナーゼ抑制因子を
分離する方法において、 温度約−５℃〜約５℃下で約５〜９のpHに調節した該混
合物に約0.5M〜約1.6Mの水溶性無機塩の少なくとも１種
を加えて塩の相と重合体の相を形成する塩分配法によっ
て、望ましくない蛋白質を含まずそして実質的に重合体
を含まないアルフア−１−プロテイナーゼ抑制因子を含
有する水溶液を塩の相から得ることを特徴とするアルフ
ア−１−プロテイナーゼ抑制因子の分離方法。 - 【請求項２】該水性系が血漿、水中に溶解した血漿画
分、水中に溶解した血漿蛋白質濃縮物、及び生物工学的
製造プロセスを用いて得た組織培養液から選択されるも
のに由来する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】治療的に活性な蛋白質が、アルフア−１抗
トリプシン、免疫グロブリン及びヒトの血清アルブミン
から成るグループの１種であり且つ該核酸がDNAであ
る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】該無機塩が、（１）二塩基性燐酸カリウ
ム、（２）二塩基性硫酸アンモニウム、（３）二塩基性
燐酸ナトリウム、及び（４）二塩基性亜硫酸ナトリウム
から成るグループから選択される少なくとも１種であ
る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】該重合体成分がポリエチレングリコール、
ポリプロピレングリコール及びデキストランからなる群
から選択される、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】該水性系が、 （ａ） アルフア−１−プロテイナーゼ抑制因子を含有
する水溶液を約6.5〜8.5のpH及び約２〜50℃の温度にお
いて、約0.2〜24時間にわたって保持し、 （ｂ） 段階（ａ）からの溶液をアルフア−１−プロテ
イナーゼ抑制因子を含有する水溶液の容量に基づいて、
約８％乃至約23％（重量／容量）のポリアルキレングリ
コールと混合し且つアルフア−１−プロテイナーゼ抑制
因子を沈殿させることなしに混合物から不要な蛋白質を
選択的に沈殿させるために十分な時間にわたり且つその
ために十分な温度において、混合物のpHを約4.6乃至約
7.5に調節し、その際使用するポリアルキレングリコー
ルの量はpH約4.6における８％乃至10％からpH7.5におけ
る約20％乃至23％まで変えることができ且つpHの0.5の
上昇について約２％乃至約３％の範囲で漸進的に増大さ
せることができ、且つ （ｃ） 段階（ｂ）からの溶液からアルフア−１−プロ
テイナーゼ抑制因子を分離する 段階から得られる、アルフア−１−プロテイナーゼ抑制
因子を含有する水溶液に由来する特許請求の範囲第１項
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US774677 | 1985-09-11 | ||
| US06/774,677 US4684723A (en) | 1985-09-11 | 1985-09-11 | Method of separating proteins from aqueous solutions |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6261922A JPS6261922A (ja) | 1987-03-18 |
| JPH0784478B2 true JPH0784478B2 (ja) | 1995-09-13 |
Family
ID=25101938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61210830A Expired - Lifetime JPH0784478B2 (ja) | 1985-09-11 | 1986-09-09 | 水溶液から蛋白質を分離するための改良方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4684723A (ja) |
| EP (1) | EP0218090B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0784478B2 (ja) |
| AT (1) | ATE83243T1 (ja) |
| DE (1) | DE3687254T2 (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5252713A (en) * | 1988-09-23 | 1993-10-12 | Neorx Corporation | Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation |
| US5215908A (en) * | 1989-06-13 | 1993-06-01 | Genencor International, Inc. | Process for recovery and purification of chymosin |
| US5139943A (en) * | 1989-06-13 | 1992-08-18 | Genencor International, Inc. | Processes for the recovery of microbially produced chymosin |
| US5151358A (en) * | 1989-06-13 | 1992-09-29 | Genencor International, Inc. | Processes for the recovery of naturally produced chymosin |
| US5093254A (en) * | 1990-01-23 | 1992-03-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Commerce | Aqueous two-phase protein extraction |
| US5328841A (en) * | 1990-10-05 | 1994-07-12 | Genencor International, Inc. | Methods for isolating EG III cellulase component and EG III cellulase in polyethylene glycol using inorganic salt and polyethylene glycol |
| CA2093422C (en) * | 1990-10-05 | 2001-04-03 | DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING LOW CBH I CONTENT CELLULASE COMPOSITIONS | |
| US5290474A (en) * | 1990-10-05 | 1994-03-01 | Genencor International, Inc. | Detergent composition for treating cotton-containing fabrics containing a surfactant and a cellulase composition containing endolucanase III from trichoderma ssp |
| SE9301582D0 (sv) * | 1993-05-07 | 1993-05-07 | Kabi Pharmacia Ab | Purification of plasma proteins |
| US5407810A (en) * | 1993-08-20 | 1995-04-18 | Genentech, Inc. | Aqueous multiple-phase isolation of polypeptide |
| US6284874B1 (en) | 1994-06-17 | 2001-09-04 | Alpha Therapeutic Corporation | Process for separating α1-proteinase inhibitor from cohn fraction IV1 and IV4 paste |
| SE9500724D0 (sv) * | 1994-06-23 | 1995-02-24 | Pharmacia Ab | Filtrering |
| US5616693A (en) * | 1996-07-01 | 1997-04-01 | Alpha Therapeutic Corporation | Process for seperating alpha-1-proteinase inhibitor from COHN IV1 +1V4 paste |
| GB2318732A (en) | 1996-11-01 | 1998-05-06 | Johnson & Johnson Medical | Wound healing compositions containing alpha-1-antitrypsin |
| US7777006B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-08-17 | Csl Behring L.L.C. | Method for purification of alpha-1-antitrypsin |
| BRPI0412835A (pt) * | 2003-08-12 | 2006-09-26 | Octapharma Ag | processo para preparação de uma solução de alfa-1-antitripsina |
| EP1761552B1 (en) | 2004-06-29 | 2008-09-17 | Ares Trading S.A. | Process for the purification of il-18 binding protein |
| GB2467124B (en) * | 2009-01-21 | 2011-04-27 | Schlumberger Holdings | Concentration of minor constituent of wellbore fluid |
| WO2014133458A1 (en) * | 2013-02-26 | 2014-09-04 | Agency For Science, Technology And Research | Protein purification in the presence of nonionic organic polymers and electropositive surfaces |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL286954A (ja) * | 1962-01-03 | |||
| US3790552A (en) * | 1972-03-16 | 1974-02-05 | Us Health | Method of removing hepatitis-associated antigen from a protein fraction using polyethylene glycol |
| JPS5815989A (ja) * | 1981-06-12 | 1983-01-29 | Sanki Eng Kk | 生理活性蛋白質の精製方法 |
| US4439358A (en) * | 1982-06-17 | 1984-03-27 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
| US4379087A (en) * | 1982-06-17 | 1983-04-05 | Cutter Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
-
1985
- 1985-09-11 US US06/774,677 patent/US4684723A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-09-01 EP EP86112060A patent/EP0218090B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-01 DE DE8686112060T patent/DE3687254T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-01 AT AT86112060T patent/ATE83243T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-09-09 JP JP61210830A patent/JPH0784478B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE83243T1 (de) | 1992-12-15 |
| US4684723A (en) | 1987-08-04 |
| EP0218090B1 (en) | 1992-12-09 |
| DE3687254T2 (de) | 1993-04-15 |
| EP0218090A2 (en) | 1987-04-15 |
| DE3687254D1 (de) | 1993-01-21 |
| JPS6261922A (ja) | 1987-03-18 |
| EP0218090A3 (en) | 1989-02-15 |
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