JPS63152329A - 肝炎ｂデーン粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は肝炎Ｂデーン（Ｄａｎｅ）粒子に関するもので
ある。さらに詳細には本発明は肝炎Ｂデーン粒子を高収
率および高純度で製造する方法に関するものである。

本発明はデーン粒子を含有するヒトの生物学的流体を硫
酸アンモニウムで処理することによるデーン粒子からな
る蛋白質留分を沈殿させ、沈殿を透析して透析した沈殿
を密度勾配に帯化させることを特徴とする肝炎８表面抗
原を含有するヒトの生物学的流体からデーン粒子を濃縮
する方法を提供するものである。

ＨＢｓＡｇを含有するヒトの生物学的流体は約１．２３
〜１．３０ｇ／ｃｃの密度域に留分の除去による同密度
帯化（ｉｓｏｐｙｃｎｉｃ　ｂａｎｄｉｎｇ）をうけし
める。これらの留分はデーン粒子に富んている。

本発明の精製された肝炎Ｂウィルスまたはデーン粒子用
出発物質（ＨＢＶ）はｌｌＢｓＡｇを含有する流体であ
る。流体は例えば血漿、唾液、糞抽出物、咽頭鼻分泌物
、胆汁、髄液、汗、尿、精液、腟分泌物または月経血液
などのようなＨＢｓＡｇを含有するあらゆるヒトの生物
学的流体であることかてきる。最も容易に獲得てきる生
物学的流体は血漿である。血漿は例えば血漿泳動法（ｐ
ｌａｓｍａｐｈｏｒｅｓｉｓ）などによる通常の方法て
得られる。ヒトの生物学的流体中のＨＢｓＡｇレベルは
例えば逆受動血球凝集（ｒｅｖｅｒｓｅｄ　ｐａｓｓｉ
ｖｅ　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）または補体
結合などのあらゆる好適な手段によって公知の方法て測
定することかてきる。生成流体中のデーン粒子は同密度
帯化段階によって単離される。生物学的流体が血漿であ
る場合には、所望により冷却することかてき、そして生
成する低温沈殿物を同密度帯化段階前に光遠心法によっ
て除去することかてきる。

同密度帯化において部分精製濃縮物は単離される特定抗
原密度を包含する密度勾配を有する液体媒質と接触され
る。次いで液体媒質を超遠心分離にかけ個々の密度に応
じた密度勾配によって平衡分布の血清成分を得るのであ
る。媒質の連続した留分を置換し希望する抗原を含有す
るそれら即ち約１．２３〜１．３０ｇ／ｃｃを有する留
分を分離する。

勾配を生成する溶液の濃度は約１．０〜１．４１ｇ／ｃ
ｃの密度範囲を包含するように選択される。液体媒質は
直線勾配または階段勾配の形て使用されることかてきる
。好ましくは分別のより高い固有の能力かあるため段勾
配の形で使用される。

同密度帯化段階で使用される液体媒質はあらゆる適当範
囲の密度勾配であることができる。技術より前にかかる
溶液の溶質は例えば白糖、臭化カリウム、塩化セシウム
、酒石酸カリウム等を包含する。臭化ナトリウムはこれ
まてＨＢＶを回収に開示されておらず好ましい。

同密度帯化段階は生理食塩水で固定回転子を充填し、次
いで引続き段勾配か生成するまで密度が増加する液体媒
質溶液のアリフォートで上の方に生理食塩水を連続的に
置換することにより遠心機、例えば、エレクトロヌクレ
オニクスーにで有利に実施される。血漿は回転子の頭部
に導入され底部から最も高いある密度溶液に置換される
。典型的には血漿容量は段勾配の約１５〜４０％である
。遠心機は開始の再定位相中混合を妨げるプログラムさ
れた速度制御系による速度に導かれる。平衡に達し生成
物か好適な密度位にある時、回転子は最初の再定位まで
混合を妨げる同系によって減速される。次いて勾配を下
から排水し好適な密度カットを収集する。

デーン粒子の小さなサイズのために同密度帯化段階はか
なり時間を消費し、約１８時間遠心分離する時間を必要
とする。１日２４時間、１週間７日操業する時でさえ結
果として１週間遠心機当り約４バツチしか処理すること
かてきない。勿論生産力は追加の遠心機を利用すること
によって増大させることかてきる。しかしこれは各遠心
機の高価格のため巨額な資本投資を伴う。

そこで実質的な生産力の増大および実質的に経費を節し
た操業コストが同密度帯勾配の多重負荷（ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）によって得られることを見出し
た。多重負荷はＨＢＶを含有する生物学的流体の試料を
流体中の実質的に全ての１（ＢＶが勾配中に通ることが
可能であることに十分であるか平衡に達するには不十分
な時間同密度帯状態をうけしめ、平衡に達するのに十分
な時間同密度帯状態を続ける前に１ｆＢＶを含有する流
体の追加試料で少なくとも１回この段階を繰り返すこと
を意味する。希望するならば勾配は数回例えば生物学的
流体の６試料まで負荷せしめることがてきる。勾配に入
る流体のＨＢＶに必要とされる時間は平衡に達する留分
の必要時間だけであり、次の平衡に達するのに必要とさ
れる時間は勾配か単一または増加負荷であるかどうかで
あるのて時間の実質的な節約および単位処理価格におけ
る削減が得られる。

一方そこて生産力の実質的な増大および実質的に経費を
節約した操業価格か流体を同密度帯状態をうけしめる前
にデーン粒子からなる蛋白質留分な沈殿させるのに効果
のある硫酸アンモニウムで生物学的流体を処理すること
によって得られることを見出した。血漿の場合には、一
般的には血漿１文当り硫酸アンモニウム約２００〜２５
０ｇ好ましくは血漿ＩＪＩ当たり約２２５ｇが使用され
る。より少ない量ではＨＢｓＡｇのすべては沈殿せず、
一方多量ては追加の希望しない蛋白質性物質を沈殿する
。この沈殿の結果として、血漿約２０文のデーン粒子を
１ハツチ中の同密度帯化をうけしめることかてきるが、
硫酸アンモニウム沈殿なしでは血漿的１．５１しか単一
ハツチて同密度帯化をうけしめることがてきない。

硫酸アンモニウムを添加後、流体は硫酸アンモニウムの
溶解を助けるために攪拌される。好ましくは流体は約２
−１Ｏ°Ｃ好ましくは約５°Ｃの低温で少なくとも約３
蒔間好ましくは少なくとも４時間攪拌される。約４時間
を超える追加攪拌は有害ではない。生成する沈殿物は遠
心分離によって収集されベレットは食塩中に再懸濁させ
、硫酸アンモニウムを除去するために食塩に透析される
。次いで生成流体濃縮物は許容密度範囲的１．１〜１．
４ｇ／ｃｃを有する勾配材料を使用する同密度帯にゆだ
ねられる。

デーン粒子濃縮物は密度範囲的１．２３〜ｌ・　３０ｇ
／ｃｃて見出される。

デーン粒子濃縮物は例えば白糖、酒石酸カリウム、ファ
イコール（Ｆｉｃｏｌｌ）または臭化ナトリウムのよう
な勾配材料でベレット化することによって精製すること
かてきる。

本発明の硫酸アンモニウム沈殿技術および多重帯化技術
（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｂａｎｄｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅ）の増大された生産力および節約した価格はあらゆ
る好適な勾配で達成することができるか好ましい勾配は
臭化ナトリウムである。

同密度帯化は約４０，０００〜８０，０００×ｇで約１
０時間またはそれ以上遠心分離することによって平衡に
達する。しかしながら流体を約４時間遠心分離すること
によって実質的にすべてのＩＩＢＶか同密度勾配に移動
せしめることか見出された。次いて廃物流体試料か除去
され新しい流体試料が勾配上に重ねられる。次いて両試
料のＨＢＶをバンドを完全にする平衡密度域勾配（約１
．２３〜１．３０ｇ／ｃｃ）に移動させるように約１０
時間またはそれ以上遠心分離を継続することかてきる。

一方ては遠心分離を４時間継続し廃流体を除去し、新し
い流体の第三試料を勾配に重ねることかてきる。この多
重負荷操作は約１８時間遠心分離によってハントを完了
する前に６回またはさらにそれ以上繰り返すことかてき
る。

勾配容量に対する装填（流体）容量の比は約１．３〜１
・６であることがてきる。単一流体装填か勾配に適用さ
れ同密度帯条件下遠心分離される場合（例えばＫｌｌ遠
心機で３００．００ｒｐｍ　、約１６〜２０時間または
より高速度て短時間またはより低速度て長時間）得られ
る生成物は既して最初の血漿における蛋白質量に依存し
て容量１．Ｏｎ中約２〜５ｍｇ／ｍｌの蛋白質含有量を
有するであろう。

流体の二倍の装填が勾配に適用され同密度帯条件下遠心
分離される場合（３００００ｒｐｍて約１６〜２０時間
またはより高速度て短時間またはより低速度て長時間）
、得られる生成物は最初の血漿中の蛋白質量に依存して
典型的には１．Ｏｎｎ容量的約４〜１０１１ｇｌｌ１１
、血漿の場合、使用される装填に対して添加する蛋白質
含有量を有するであろう。

蛋白質レベルは勾配に適用された流体の各々の次の装填
に対してこの方法において増加する。

本発明の一つの好ましい態様によれば勾配は臭化ナトリ
ウムて生成される。従来使用された材料に比べて臭化ナ
トリウムは明確な利点を有する。臭化ナトリウムの溶解
性は冷凍器温度（２〜６°Ｃ）での勾配生成において高
密度溶液の使用を認める。塩化セシウムのような塩に加
えて臭化ナトリウムの使用は明確な経済上の利点かある
。臭化ナトリウム勾配において生物理学特性のためにＨ
ＢＶに結合するあらゆるイオンは多くの生物学的系とさ
らに適合するナトリウム塩になるであろう。

ＫＢｒに関する低温度でのＮａＢｒの秀れた溶解性は生
物学的材料の安定性にさらに助けとなる低温度の使用を
可能にする。直線勾配よりもむしろ段勾配の使用は段境
界で不純物を蓄積するのて好ましく単一勾配において樹
葉のより大きな容量を処理することを可能にする。

デーン粒子はリン酸塩緩衝サリーン （ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎ
ｅ）のような希釈剤で勾配を希釈しデーン粒子をペレッ
ト化することによってＮａＢｒ勾配から分離することか
てきる。次いて粒子はトリスサリーン緩衝液（Ｔｒｉｓ
−ｓａｌｉｎｅ　ｂｕｆｆｅｒ）のような好適な媒質中
で濃縮物として回収することかできる。

デーン粒子濃縮物はさらに牛の血清アルラミン　（ＢＳ
Ａ）のような蛋白質性安定剤を含有する白糖のような好
適な媒質でペレット化することによって精製することが
できる。生成ベレットは次いてＢＳＡのような蛋白質性
安定剤を含有するトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ　ｂｕｆｆｅ
ｒ）のような好適な媒質中に再懸濁することかできる。

デーン粒子濃縮物または精製粒子濃縮物はホルマリン処
理によって不活化することかでき、ミョウバンのような
生理学的に認められる基質に吸収することができさらに
免液剤として使用することかできる。

次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するか
、本発明の要旨を超えない限りこれらに限定されるもの
てはない。

実施例１ 遠心機エレクトロヌクレオニクスにの回転子をリン酸塩
緩衝液８，４００ｍ１で充填した。系をガス除去するた
めに１０，０００ｒｐｎ＋まで回転子を動かした後、次
の段勾配を固定回転子の底部に注入した。

１．１０％ＮａＢｒ　　　２４０［］ｍｌ　　　ｐ　＝
　１．０８２．２０％ＮａＢｒ　　　１０１００Ｏｐ　
＝　１．１７３．３０％ＮａＢｒ　　　１５００ｍｌ　
　　ρ−１，２８４，４０％ＮａＢｒ　　　３５００１
ｐ　＝　１．４１）ＩＢｓＡｇを含有する血漿１７５０
ｍ１を据え付けの回転子の頭部に注入し回転子の底部か
ら４０％ＮａＢｒ１７５０ｍｌに置換した。回転子を３
００００　ｒｐｎ＋に加速しこの速度で４時間運転した
。次いて回転子を停止させ、４０％ＮａＢｒ１７５０ｍ
ｌを回転子の底部に注入し血漿を頭部から無理に出した
。ＨＢｓＡｇを含有する新しい追加の鹿漿１７５０ｍ１
を回転子の頭部に注入し回転子の底部から４０％ＮａＢ
ｒの等量を置換排出した。次いて回転子を３００００ｒ
ｐＩ１１で１８時間運転した。回転子を停止した後１．
２３〜１．３０密度域のデーン粒子に富んだ材料１０１
００Ｏを収集した。

（ＨＢＶ）デーン粒子を次の操作てＮａＢｒの帯状の留
分から分離した。帯状の留分（１０００ｎ＋１）をリン
酸塩緩衝サリーンを使用して３０００ｍｌに希釈した。

次いでこの材料を１２タイプの１９回転子のプラスチッ
クビン（各２５０ｍ１７１ビン）に入れた。次いで材料
をタイプ１９回転子（ベックマン）を使用して遠心分離
した。回転子をデーン粒子をペレット化するために１７
，０００ｒｐｍ（４５，ＯＯＯＸｇ）で２４時間回した
。次いで回転子を停止し各ビンから上澄を傾瀉した。１
２ビンすべてからベレット材料を総容量５〜７１の三−
食塩緩衝液中に回収した。

この材料はデーン粒子濃縮物であった。

実施例２ デーン粒子濃縮物をさらに抗体蛋白質の残渣トレースを
除去するために精製した。実施例１のデーン濃縮物１１
を％　ｘ　２　″セルロースニトレート管を有する５Ｗ
６５回転子（ベックマン）で２０％白糖−１％牛の血清
アルラミン　（ＢＳＡ）のトリスサリーン緩衝液４ｍｌ
に積層した。粒子を３５０００　ｒｐｍ（１２５０００
ｘｇ）て４時間遠心分離した。遠心分離後上澄流体を傾
瀉しベレットを綿を先につけた綿棒（緩衝液で予め給温
した）を使用して１％ＢＳＡを有するトリスサリーン緩
衝液０．５ｎ＋１中に緩かに再懸濁した。次いて綿棒を
緩衝液０．５ｍｌですすいた。デーン粒子材料の最終容
量は１１てあった。デーン粒子を一７０°Ｃて貯蔵した
。

実施例３ 実施例１に従って製造したデーン粒子濃縮物（タイプＡ
ｄ）を密度範囲１．１〜１．４ｇ／ｃＩ１１３を包含す
る臭化ナトリウム勾配に適用し浮遊密度１．２３〜１．
３０ｇ／ｃｍ’を有するデーン粒子を分離した。この抗
原は約１０１０の４２−ｎｍデーン粒子を含有する。材
料を無菌条件下、１　：　４０００ホルマリンで３７６
Ｃ７２時間処理した。過剰ホルマリンを重亜硫酸ナトリ
ウムて中和した。

次いで抗原をｐ）１６．８の１０％ミョウバン（ＫＡｌ
（ＳＯ４）２　・１２Ｈ２０）に吸収させた。モルモッ
トのグループにミョウバンに吸収させた抗原を月１回の
間隔で０．５ｍｌを３用量筋肉内注射て投与した。抗原
はこれらの動物中にＨＢｓＡｂを循環させた。

実施例４ 実施例３の操作をタイプＡｙデーン粒子および他のモル
モットグループを使用した以外は繰り返した。抗原はモ
ルモットにＨＢｓＡｂを循環させた。

実施例５ 肝炎Ｂ供給者から血漿２０ｎ＋ＩをＡｐ２０フィルター
膜（ミリボール）を含有する２９３■フイルターで濾過
することによって清澄させた。硫酸アンモニウム４．５
３Ｋｇを炉液に添加し次いで５°Ｃで一晩中緩慢に攪拌
した。生成した沈殿なＪＡ−１０ローター（ハツチ当り
３文の収容力）を使用して７０００Ｘｇで３０分ハツチ
遠心分離により収集した。遠心分離後ベレットを食塩的
２．２５ｆＬ中に懸濁した。次いで濃縮した懸濁液を食
塩４０文に対して透析し硫酸アンモニウムを除去した。

エレクトロヌクレオニクスにの遠心機の回転子をリン酸
塩緩衝液８４００ｍ１で充填した。系をガス除去するた
めに１０，０００ｒｐｍまで回転子を動かした後、次の
段勾配を据え付けの回転子の底部に注入した： １．１０％ＮａＢｒ　　　２４００ｍ１　　　ｐ　＝　
１．０８芝、２０％ＮａＢｒ　　　１０１００Ｏｐ　＝
　１．１７３．３０％ＮａＢｒ　　　１５００ｍｊ　　
　ｐ　＝　１．２８４．４０％ＮａＢｒ　　　３５００
ｍｌ　　　ｐ　＝　１．４１１項の透析した懸濁液２，
２５０＋ａｌを据え付けの回転子の頭部に注入し、回転
子の底部から４０％ＮａＢｒ２　、２５０　ｍｌに置換
した。回転子を３０．ＯＯＯｒｐｍに加速し、この速度
で１８時間運転した。回転子を停止した後、１．２３〜
１．３０密度域のデーン粒子材料１．３００ｍ１を収集
した。次いでデーン粒子を実施例１に記載した通りＮａ
Ｂｒ帯状留分から分離しデーン粒子濃縮物を生じた。

本発明の態様は例えば次のとおりである。

１、流体を臭化ナトリウム密度勾配中で同密度帯化せし
めデーン（Ｄａｎｅ）粒子に富んだ留分な回収すること
を特徴とするＨＢｓＡｇを含有するヒトの生物学的流体
からデーン粒子を濃縮する改良方法。

２、密度勾配が段勾配であり、生物学的流体か血漿であ
る第１項の方法。

３、約１．２３〜１．３０ｇ／ｃｃの密度域を有する同
密度帯化留分をデーン粒子か帯化されるまで遠心分離を
うけしめることを特徴とする同密度帯化をうけしめたヒ
トの生物学的流体からデーン粒子を精製する改良方法。

４、デーン粒子を含有するヒトの生物学的流体を実質的
に流体中の全ＨＢＶを密度勾配中に通過させるのに有効
であるが平衡に達するには効果のない条件下の密度勾配
中て同密度帯化をうけしめ、廃物流体を除去し、少なく
とも１凹所しい試料て最初の段階を繰返すことを特徴と
する密度勾配を多重負荷する方法。

５、デーン粒子を含有するヒトの生物学的流体を実質的
に流体中の全）ＩＢＶを密度勾配中に通過させるのに有
効であるが平衡に達するには効果のない条件下の密度勾
配中て同密度帯化なうけしめ、廃物流体を除去し、少な
くとも１凹所しい試料て最初の段階を繰返すことにより
密度勾配を多重負荷し、次いて実質的に平衡に達するの
に有効な条件下て同密度帯化な継続することを特徴とす
るヒトの生物学的流体からデーン粒子を同密度帯化する
方法。

６、密度勾配がＮａＢｒであり生物学的流体か血漿であ
る第５項の方法。

７、　デーン粒子を含有するヒトの生物学的流体を実質
的に流体中の全ＨＢＶを密度勾配中に通過させるのに有
効であるが平衡に達するには効果のない条件下の密度勾
配中で同密度帯化をうけしめ廃物流体を除去し、少なく
とも１凹所しい試料で最初の段階を繰返すことにより密
度勾配を多重負荷し、次いて実質的に平衡に達するのに
有効な条件下で同密度帯化を継続することを特徴とする
ヒトの生物学的流体からデーン粒子を同密度帯化する方
法によって得られる密度勾配。

８、デーン粒子を含有するヒトの血漿を実質的に血漿中
の全ＨＢＶをＮａＢｒ中に通過させるのに有効であるが
平衡に達するには効果のない条件下のＮａＢｒ中て同密
度帯化なうけしめ廃物血漿を除去し、少なくとも１凹所
しい試料で最初の段階を繰返すことによりＮａＢｒを多
重負荷し、次いて実質的に平衡に達するのに有効な条件
下で同密度帯化を継続することを特徴とするヒトの血漿
からデーン粒子を同密度帯化する方法によって得られる
密度勾配。

９、流体を硫酸アンモニウムで処理することによるデー
ン粒子からなる蛋白質留分な沈殿させ、沈殿を透析して
透析した沈殿を密度勾配に帯止させることを特徴とする
肝炎８表面抗原を含有するヒトの生物学的流体からデー
ン粒子を濃縮する方法。

１０、密度勾配が臭化ナトリウムである第９項の方法。

１１、密度勾配か段勾配である第９項の方法。

１２、密度勾配か臭化ナトリウムである第１１項の方法
。

１３、生理学的に認められる媒質中のデーン粒子からな
る組成物。

１４、媒質が臭化ナトリウム溶液である第１３項の組成
物。

１５、臭化ナトリウム溶液か段勾配である第１４項の組
成物。

１６、臭化ナトリウムが密度的１．２３〜１．３０ｇ／
ｃｍ”を有する第１４項の組成物。

１７、媒質かリン酸塩緩衝サリーンである第１３項の組
成物。

１８、媒質がトリスサリーン緩衝剤である第１３項の組
成物。

【９．媒質か蛋白質性安定剤を含有するトリス緩衝剤で
ある第１３項の組成物。

２０、安定剤が牛のｍ清アルブミンである第１９項の組
成物。

２１、実質的に勾配に起因するセシウムまたはカリウム
イオンのないデーン粒子ナトリウム塩分子。

２２、生理学的に認められる基質に吸収されたデーン粒
子からなる免疫学的薬剤。

２３、基質かミョウバンである第２２項の組成物。

２４、生理学的に認められる基質に吸収されたデーン粒
子を含有する水性媒質からなる免疫学的薬剤。

２５、基質かミョウバンである第２４項の組成物。

手続補正盲動式） 昭和６３年１月１２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、デーン粒子を含有するヒトの生物学的流体を硫酸ア
   ンモニウムで処理することによ るデーン粒子からなる蛋白質留分を沈殿さ せ、沈殿を透析して透析した沈殿を密度勾 配に帯化させることを特徴とする肝炎Ｂ表 面抗原を含有するヒトの生物学的流体から デーン粒子を濃縮する方法。 ２、密度勾配が臭化ナトリウムである特許請求の範囲第
   １項に記載の方法。 ３、密度勾配が段勾配である特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。 ４、密度勾配が臭化ナトリウムである特許請求の範囲第
   ３項に記載の方法。