JPS635381B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は肝炎Ｂデーン（Dane）粒子に関する
ものである。さらに詳細には本発明は肝炎Ｂデー
ン粒子を高収率および高純度で製造する方法に関
するものである。

本発明は、デーン粒子を含有するヒトの生物学
的流体を実質的に流体中の全HBVを、約1.0〜
1.41g／c.c.の密度範囲を包含する密度勾配中を通
過させるのに有効であるが平衡に達するには効果
のない条件下の密度勾配中で同密度帯化をうけし
め、廃物流体を除去し、少なくとも１回新しい試
料で最初の段階を繰返すことにより密度勾配を多
重負荷し、次いで実質的に平衡点すなわち約1.23
〜1.30g／c.c.に達するのに有効な条件下で同密度
帯化を継続することを特徴とするデーン粒子の精
製方法を提供するものである。

HBsAgを含有するヒトの生物学的流体は約
1.23〜1.30ｇ／c.c.の密度域に留分の除去による同
密度帯化（isopycnic banding）をうけしめる。
これらの留分はデーン粒子に富んでいる。

本発明の精製された肝炎Ｂウイルスまたはデー
ン粒子用出発物質（HBV）はHBsAgを含有する
流体である。流体は例えば血漿、唾液、糞抽出
物、咽頭鼻分泌物、胆汁、髄液、汗、尿、精液、
膣分泌物または月経血液などのようなHBsAgを
含有するあらゆるヒトの生物学的流体であること
ができる。最も容易に獲得できる生物学的流体は
血漿である。血漿は例えば血漿泳動法
（plasmaphoresis）などによる通常の方法で得ら
れる。ヒトの生物学的流体中のHBsAgレベルは
例えば逆受動血球凝集（reversed passive
hemagglutination）または補体結合などのあら
ゆる好適な手段によつて公知の方法で測定するこ
とができる。生成流体中のデーン粒子は同密度帯
化段階によつて単離される。生物学的流体が血漿
である場合には、所望により冷却することがで
き、そして生成する低温沈澱物を同密度帯化段階
前に光遠心法によつて除去することができる。

同密度帯化において、部分精製濃縮物は単離さ
れる特定抗原密度を包含する密度勾配を有する液
体媒質と接触される。次いで液体媒質を超遠心分
離にかけ個々の密度に応じた密度勾配によつて平
衡分布の血清成分を得るのである。媒質の連続し
た留分を置換し希望する抗原を含有するそれら即
ち約1.23〜1.30ｇ／c.c.を有する留分を分離する。
勾配を生成する溶液の濃度は約1.0〜1.41ｇ／c.c.
の密度範囲を包含するように選択される。液体媒
質は直線勾配または階段勾配の形で使用されるこ
とができる。好ましくは分別のより高い固有の能
力があるため段勾配の形で使用される。

同密度帯化段階で使用される液体媒質はあらゆ
る適当範囲の密度勾配であることができる。本出
願前において公知の溶液の溶質は例えば白糖、臭
化カリウム、塩化セシウム、酒石酸カリウム等を
包含する。臭化ナトリウムはこれまでHBVを回
収に開示されておらず好ましい。

同密度帯化段階は固定回転子（ローター）に生
理食塩水を充填し、次いで引続き段勾配が生成す
るまで密度が増加する液体媒質溶液のアリクオー
トで上の方に生理食塩水を連続的に置換すること
により遠心機、例えば、エレクトロヌクレオニク
ス−Ｋで有利に実施される。血漿は回転子の頭部
に導入され底部から最も高いある密度溶液に置換
される。典型的には血漿容量は段勾配の約15〜40
％である。遠心機は開始の再定位相中混合を妨げ
るプログラムされた速度制御系による速度に導か
れる。平衡に達し生成物が好適な密度位にある
時、回転子は最初の再定位まで混合を妨げる同系
によつて減速される。次いで勾配を下から排水し
好適な密度カツトを収集する。

デーン粒子の小さなサイズのために同密度帯化
段階はかなり時間を消費し、約18時間遠心分離す
る時間を必要とする。１日24時間、１週間７日操
業する時でさえ結果として１週間遠心機当り約４
バツチしか処理することができない。勿論生産力
は追加の遠心機を利用することによつて増大させ
ることができる。しかしこれは各遠心機の高価格
のため巨額な資本投資を伴う。

同密度帯勾配の多重負荷（multiple loading）
により、実質的な生産力の増大および実質的な操
業コストの節減が可能となることが見い出され
た。多重負荷はHBVを含有する生物学的流体の
試料を流体中の実質的に全てのHBVが勾配中に
通ることが可能であることに十分であるが平衡に
達するには不十分な時間同密度帯状態をうけし
め、平衡に達するのに十分な時間同密度帯状態を
続ける前にHBVを含有する流体の追加試料で少
なくとも１回この段階を繰り返すことを意味す
る。希望するならば勾配は数回例えば生物学的流
体の６試料まで負荷せしめることができる。流体
中HBVの勾配に入るだけにのみ必要とされる時
間は、平衡に達するために必要とされる時間の一
部で足り、次に平衡に達するために必要とされる
時間は、単一負荷であろうと、多重負荷であるう
と、同じであるので、時間の実質的な節約および
単位処理価格における削減が得られる。

一方そこで生産力の実質的な増大および実質的
に経費を節約した操業価格が流体を同密度帯状態
をうけしめる前にデーン粒子からなる蛋白質留分
を沈殿させるのに効果のある硫酸アンモニウムで
生物学的流体を処理することによつて得られるこ
とを見出した。血漿の場合には、一般的には血漿
１当り硫酸アンモニウム約200〜250ｇ好ましく
は血漿１当たり約225ｇが使用される。より少
ない量ではHBsAgのすべては沈殿せず、一方多
量では追加の希望しない蛋白質性物質が沈殿す
る。この沈殿の結果として、血漿約20のデーン
粒子を１バツチ中の同密度帯化をうけしめること
ができるが、硫酸アンモニウム沈殿なしでは血漿
約1.5しか単一バツチで同密度帯化をうけしめ
ることができない。

硫酸アンモニウムを添加後、流体は硫酸アンモ
ニウムの溶解を助けるために撹拌される。好まし
くは流体は約２−10℃好ましくは約５℃の低温で
少なくとも約３時間好ましくは少なくとも４時間
撹拌される。約４時間を超える追加撹拌は有害で
はない。生成した沈殿物を遠心分離し、得られた
ペレツトは食塩中に再懸濁させ、硫酸アンモニウ
ムを除去するために食塩に透析される。次いで硫
酸アンモニウムが除去された流体濃縮物は許容密
度範囲約1.1〜1.4ｇ／c.c.を有する勾配材料を使用
する同密度帯にゆだねられる。

デーン粒子濃縮物は密度範囲約1.23〜1.30ｇ／
c.c.で見出される。

デーン粒子濃縮物は例えば白糖、酒石酸カリウ
ム、フアイコール（Ficoll）または臭化ナトリウ
ムのような勾配材料でペレツト化することによつ
て精製することができる。

本発明の硫酸アンモニウム沈殿技術および多重
帯化技術（multiple banding technique）の増大
された生産力および節約した価格はあらゆる好適
な勾配で達成することができるが好ましい勾配は
臭化ナトリウムである。

同密度帯化は約40000〜80000×ｇで約10時間ま
たはそれ以上遠心分離することによつて平衡に達
する。しかしながら流体を約４時間遠心分離する
ことによつて実質的にすべてのHBVが同密度勾
配に移動せしめることが見出された。次いで廃物
流体試料が除去され新しい流体試料が勾配上に重
ねられる。次いで両試料のHBVをバンドを完全
にする平衡密度域勾配（約1.23〜1.30ｇ／c.c.）に
移動させるように約10時間またはそれ以上遠心分
離を継続することができる。一方では遠心分離を
４時間継続し廃流体を除去し、新しい流体の第三
試料を勾配に重ねることができる。この多重負荷
操作は約18時間遠心分離によつてバンドを完了す
る前に６回またはさらにそれ以上繰り返すことが
できる。

勾配作成に使用される液体（例えば、NaBr）
の量に対する装填（流体）容量の比は約１：３〜
１：６であることができる。単一流体装填が勾配
に適用され同密度帯条件下遠心分離される場合
（例えばKII遠心機で30000rpm、約16〜20時間ま
たはより高速度で短時間またはより低速度で長時
間）得られる生成物は既して最初の血漿における
蛋白質量に依存して容量1.0中約２〜５mg／ml
の蛋白質含有量を有するであろう。

流体のダブル装填が勾配に適用される同密度帯
条件下遠心分離される場合（30000rpmで約16〜
20時間またはより高速度で短時間またはより低速
度で長時間）、得られる生成物は最初の血漿中の
蛋白質量に依存して典型的には1.0容量中約４
〜10mg／ml血漿の場合、使用される各装填物にお
ける蛋白質含有量の合計量を有するであろう。蛋
白質レベルは、この方法により装填の２回以後加
法的に増加する。

本発明の一つの好ましい態様によれば勾配は臭
化ナトリウムで生成される。従来使用された材料
に比べて臭化ナトリウムは明確な利点を有する。
臭化ナトリウムの溶解性は冷凍器温度（２〜６
℃）での勾配生成において高密度溶液の使用を認
める。塩化セシウムのような塩に加えて臭化ナト
リウムの使用は明確な経済上の利点がある。臭化
ナトリウム勾配において生物学的特性のために
HBVに結合するあらゆるイオンは多くの生物学
的系とさらに適合するナトリウム塩になるであろ
う。

KBrに関する低温度でのNaBrの秀れた溶解性
は生物学的材料の安定性にさらに助けとなる低温
度の使用を可能にする。直線勾配よりもむしろ段
勾配の使用は段境界で不純物を蓄積するので好ま
しく単一勾配において血漿のより大きな容量を処
理することを可能にする。

デーン粒子はリン酸塩緩衝サリーン
（phosphate buffered saline）のような希釈剤で
勾配を希釈しデーン粒子を遠心によりペレツト化
することによつてNaBr勾配から分離することが
できる。次いで粒子はトリスサリーン緩衝液
（Tris−saline buffer）のような好適な媒質中に
濃縮物として回収することができる。

デーン粒子濃縮物はさらに牛の血清アルブミン
（BSA）のような蛋白質性安定剤を含有する白糖
のような好適な媒質でペレツト化することによつ
て精製することができる。生成ペレツトは次いで
BSAのような蛋白質性安定剤を含有するトリス
緩衝液（Tris buffer）のような好適な媒質中に
再懸濁することができる。

デーン粒子濃縮物または製精粒子濃縮物はホル
マリン処理によつて不活化することができ、ミヨ
ウバンのような生理学的に認められる基質に吸収
することができさらに免疫剤として使用すること
ができる。

次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説
明するが、本発明の要旨を超えない限りこれらに
限定されるものではない。

実施例 １ 遠心機エレクトロヌクレオニクスＫの回転子を
リン酸塩緩衝液８，400mlで充填した。系をガス
除去するために10，000rpmまで回転子を動かし
た後、次の段勾配を固定回転子の底部に注入し
た。

1.10％NaBr 2400ml ρ＝1.08 2.20％NaBr 1000ml ρ＝1.17 3.30％NaBr 1500ml ρ＝1.28 4.40％NaBr 3500ml ρ＝1.41 HBsAgを含有する血漿1750mlを据え付けの回
転子の頭部に注入し回転子の底部から40％
NaBr1750mlを排出した。回転子を30000rpmに
加速しこの速度で４時間運転した。次いで回転子
を停止させ、40％NaBr1750mlを回転子の底部に
注入し血漿を頭部から無理に出した。HBsAgを
含有する新しい追加の血漿1750mlを回転子の頭部
に注入し回転子の底部から40％NaBrの等量を置
換排出した。次いで回転子を30000rpmで18時間
運転した。回転子を停止した後1.23〜1.30密度域
のデーン粒子に富んだ材料1000mlを収集した。

（HBV）デーン粒子を次の操作でNaBrの帯
状の留分から分離した。帯状の留分（1000ml）を
リン酸塩緩衝サリーンを使用して3000mlに希釈し
た。次いでこの材料を12タイプの19回転子のプラ
スチツクビン（各250ml／ビン）に入れた。次い
で材料をタイプ19回転子（ベツクマン）を使用し
て遠心分離した。回転子をデーン粒子をペレツト
化するために17000rpm（45000×ｇ）で24時間回
した。次いで回転子を停止し各ビンから上澄を傾
瀉した。12ビンすべてからペレツト材料を総容量
５〜７mlのトリスサリーン緩衝液中に回収した。
この材料はデーン粒子濃縮物であつた。

実施例 ２ デーン粒子濃縮物をさらに抗体蛋白質の残渣ト
レースを除去するために精製した。実施例１のデ
ーン濃縮物１mlを1/2×2″セルロースニトレート
管を有するSW65回転子（ベツクマン）で20％白
糖−１％牛の血清アルブミン（BSA）のトリス
サリーン緩衝液４mlに積層した。粒子を
35000rpm（125000×ｇ）で４時間遠心分離した。
遠心分離後上澄流体を傾瀉しペレツトを綿を先に
つけた綿棒（緩衝液で予め給湿した）を使用して
１％BSAを有するトリスサリーン緩衝液0.5ml中
に緩かに再懸濁した。次いで綿棒を緩衝液0.5ml
ですすいだ。デーン粒子材料の最終容量は１mlで
あつた。デーン粒子を−70℃で貯蔵した。

実施例 ３ 実施例１に従つて製造したデーン粒子濃縮物
（タイプAd）を密度範囲1.1〜1.4ｇ／cm³を包含す
る臭化ナトリウム勾配に適用し浮遊密度1.23〜
1.30ｇ／cm³を有するデーン粒子を分離した。この
抗原は約10¹⁰の42−nmデーン粒子を含有する。
材料で無菌条件下、１：4000ホルマリンで37℃72
時間処理した。過剰ホルマリンを重亜硫酸ナトリ
ウムで中和した。

次いで抗原をPH6.8の10％ミヨウバン〔KAl
（SO₄）₂・12H₂O〕に吸収させた。モルモツトの
グループにミヨウバンに吸収させた抗原を月１回
の間隔で0.5mlを３用量筋肉内注射で投与した。
抗原のこの投与により、これらの動物中に
HBsAgを生じせしめ、HBsAbは、動物体内を循
環した。

実施例 ４ 実施例３の操作をタイプAyデーン粒子および
他のモルモツトグループを使用した以外は繰り返
した。抗原はモルモツトにHBsAbを循環させた。

参考例 肝炎Ｂ供給者から血漿20mlをAp20フイルター
膜（ミリポール）を含有する293mmフイルターで
過することによつて清澄させた。硫酸アンモニ
ウム4.53Kgを液に添加し次いで５℃で一晩中緩
慢に撹拌した。生成した沈殿をJA−10ローター
（バツチ当り３の収容力）を使用して7000×ｇ
で30分バツチ遠心分離により収集した。遠心分離
後ペレツトを食塩約2.25中に懸濁した。次いで
濃縮した懸濁液を食塩40に対して透析し硫酸ア
ンモニウムを除去した。

エレクトロヌクレオニクスＫの遠心機の回転子
をリン酸塩緩衝液8400mlで充填した。系をガス除
去するために10000rpmまで回転子を動かした後、
次の段勾配を据え付けの回転子の底部に注入し
た： 1.10％NaBr 2400ml ρ＝1.08 2.20％NaBr 1000ml ρ＝1.17 3.30％NaBr 1500ml ρ＝1.28 4.40％NaBr 3500ml ρ＝1.41 前記の透析した懸濁液2250mlを据え付けの回転
子の頭部に注入し、回転子の底部から40％
NaBr2250mlに置換した。回転子を30000rpmに
加速し、この速度で18時間運転した。回転子を停
止した後、1.23〜1.30密度域のデーン粒子材料
1300mlを収集した。次いでデーン粒子を実施例１
に記載した通りNaBr帯状留分から分離しデーン
粒子濃縮物を生じた。

以下に、本発明において使用される平衡密度勾
配遠心法の操作手順の概略を示す。

１ 段階勾配の作成： 第１図に示されるように、勾配が薄いものか
ら順にＡから注入される。

２ 試料の装填： 第２図に示されるように、試料がＢから注入
され、それにともないＡから、上記で作成した
勾配の一番濃いものが排出される。

３ 遠心中の勾配の状態： 段勾配は第３図に示されるような遠心中の状
態を示し、特定の時間の後、試料は例えば斜線
に示される密度勾配中に集まる。

４ 試料の回収： 遠心を停止した後、第４図に示されるように
Ａから勾配液を注入してゆき、試料をＢから押
し出し回収する。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は、本発明方法において用い得
る平衡密度勾配遠心装置によるデーン粒子の分離
操作手順を示す概略図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ デーン粒子を含有するヒトの生物学的流体を
   実質的に流体中の全HBVを、約1.0〜1.41g／c.c.
   の密度範囲を包含する密度勾配中を通過させるの
   に有効であるが平衡に達するには効果のない条件
   下の密度勾配中で同密度帯化をうけしめ、廃物流
   体を除去し、少なくとも１回新しい試料で最初の
   段階を繰返すことにより密度勾配を多重負荷し、
   次いで実質的に平衡点すなわち約1.23〜1.30g／
   c.c.に達するのに有効な条件下で同密度帯化を継続
   することを特徴とするデーン粒子の精製方法。 ２ 密度勾配が段勾配である特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。