JPH0231687A - 血清アルブミンの純化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は組換え技法により産生されたタンパク質、特に
血清アルブミンの純化方法に関する。

〔従来の技術〕

ヒト血清アルブミン（“ＩＳＡ”）は血漿の主なタンパ
ク成分であって５８５個のアミノ酸の単鎖ポリペプチド
から成り、約６６．０００ダルトンの分子量を有する。

その１７個の分子内ジスルフィド架橋はアルブミン分子
の高度の安定性に寄与している。

血漿中のアルブミンの主機能は血管内のコロイド滲透圧
の保持である。更に該タンパク質は数種の配位子（リガ
ンド）例えばビリルビン及び脂肪酸の担体として作用す
る〔諸文献：　Ｆ、　ＲｏｔｈｓＬｅｉｎ＋ν、　Ｍ、
　Ｒｏｓｅｎｏｅｒ　ａｎｄ　Ｗ、　Ｌ、　Ｆｌｕｇｈ
ｅｓ　ｉｎ　ＡｌｂｕｍｉｎＳｔｒｕｃｔ、　Ｆｕｎｃ
ｔ、　Ｕｓｅｓ　　（１９７７）　？−２５：Ｕ、　　
Ｋｒａｇｈ−Ｈａｎｓｅｎ、　　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、
　　Ｒｅｖ、　　（１９８１）３３　：　１７−５３　
；Ｔ、　Ｐｅｔｅｒｓ　Ｊｒ、、＾ｄｖ、　Ｐｒｏｔ。

Ｃｈｅｗ、　　（１９８５）３７：１６１−２４５）参
照のこと〕。

純化血清アルブミンは、重度の低アルブミン血症の状態
の際に血液量減少性ショックの予防と治療とのために必
要であり、血液透析処置の場合及び心肺側行路処置の場
合の助けとして、及び祈生児期の高ピルビン血症の治療
時の交換輸血と関連して必要である。

血漿又は胎盤からのＩ　Ｓ　Ａの大規模な純化の゛ため
にはりパノール（Ｒｉｖａｎｏｌ　Ｇ　）法及び（又は
）液体クロマトグラフィ法と共に、エタノール、ポリエ
チレングリコール、トリクロロ酢酸又は硫酸アンモニウ
ムを用いる沈殿法が屡々用いられる〔前者の方法につい
ては諸文献：　　Ｊ、　５ａｉｎｔ−Ｂ１ａｎｃａｒｄ
＋　Ｊ、　？Ｌ、　Ｋｉｒｚｉｎ＋　Ｐ、　Ｒｉｂｅｒ
ｏｎ、　Ｆ、　Ｐｅｔｉｔ。

Ｊ、　Ｆｏｕｒｃａｒｔ＋　Ｐ、　Ｇｉｒｏｔ　ａｎｄ
　Ｂ、　Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ、＾ｎａｌ。

Ｃｈｅｗ、　　Ｓｙｍｐ、　　Ｓｅｒ、　　（１９８２
）　　９　　：　　３　０　５　−３１２；Ｊ、　Ｍ、
Ｃｕｒｌｉｎｇ　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｌａ
ｓｍａＰｒｏＬｅｉｎＦｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ　　
（１９８０）　？　７　９１　；Ｍ、　Ｊ。

Ｈａｒｖｅｙ　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｌａｓ
ｍａ　ＰｒｏｔｅｉｎＰｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ　　
（１９８０）　　１８９　２００　ｉＮ、　　Ｅ、　　
５ｃｈｕｌｔｚｅ　ａｎｄ　Ｊ、　　Ｆ、　　Ｈｅｒｅ
ａａｎｓ＋　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ。

１１ｕｍ、Ｐｒｏｔ、（１９６６）ｌ：２６１　　２７
０；Ｊ、Ｌｉａｕｔａｕ、Ｊ、Ｐｌａ＋　　Ａ、Ｄｅｂ
ｒｕｓ＋　　Ｐ、Ｇａｔｔｅｌ、Ｒ。

Ｐｌａｎ　　ａｎｄ　　Ｌ、　　Ｐｅｙｒｏｎ＋　　　
１　３　ｔｈ　　Ｊｎｔ、　　Ｃｏｎｇｒ、　　ＩＡＢ
Ｓ（１９７３）　　２７：１０７−１１４．Ｈａｏ、Ｙ
−Ｌ。

ＶｏｘＳａｎｇ（１９８５）　　４９　　：　　１−８
　　；ａｎｄＵ、Ｓ。

Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　４２２８１５４を参照されたい
〕。

研究室規模の場合については血清アルブミンの純化のた
めの親和クロマトグラフィの適用が文献（Ｔ、　Ｐｅｔ
ｅｒｓ　Ｊｒ、、　Ｈ，Ｔａｎ１ｕｃｈｉ　ａｎｄ　Ｃ
，Ｂ。

Ａｎｆｉｎｓｅｎ　　Ｊｒ、、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、
　　Ｃｈｅｗ、　　（１９７３）　　２４８（７）　　
　：　　２４４７−２４５１　　；Ａ、　　Ｗｉｃｈａ
ａｎａｎｄＬ　−０，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｓ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ（１９７４）　
　３７２：２１８　　　２２４；ａｎｄＡ。

Ａｓ１ａｓｉ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｊｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｔ
、　Ｒ，Ｂｒｏｗｎ、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　（１９７６）　　７５　　：　　
３２９−３３５）　　に記載されている。

血清アルブミンは治療用に大量を必要とするのに、血清
アルブミン（血５！　＞供給源は限られているのでＩＳ
Ａの大量製造のための他の技法が模索されていた。組換
え体ＤＮＡ技法によって作られた形質転換微生物又は細
胞系統を用いる発酵にもとづ＜　ＨＳ　Ａ製造の成功が
報ぜられた。例えばＥＰ−Ａ−００７３６４６号参照の
こと。

けれども形質転換細胞群を用いる発酵によって産生され
た血清アルブミンの純化における主問題のひとつは生育
培地（発酵ブロス）又は細胞分解物からの夾雑成分の存
在であってこれらは純化された均質な血清アルブミンの
収得のために除去されねばならない。

夾雑物は例えば外来タンパク質であってこれは免疫学的
応答を起すことが予期されよう。夾雑されたＨ３Ａの投
与はショックへ導く可能性をもつ。

夾雑物は血漿又は胎盤からの血清アルブミンの分画化の
際に見出される夾雑物とは全く異なる。このことは天然
源由来のＩ−Ｉ　Ｓ　Ａのために開発された純化方法が
組換え体由来の血清アルブミンの純化に外挿（適用）さ
れ得ないことを意味する。形質転換微生物又は細胞系統
により産生されたヒト血清アルブミンの大規模純化の実
用的方法は未だ刊行されず、未だ使用されない。

〔発明の開示〕

組換え技法により産生された血清アルブミンを第一工程
のアルカリ沈殿によって純化し、任意に酸性のｐＨにお
いてイオン交換クロマトグラフィにかけ、水相内での脱
着剤としてのりピドアニオン使用下の親油性表面固定相
を用いる親和クロマトグラフィによって純化する。かよ
うにして高度の回収及び純化が達成される。

本発明に従い、組換え技法により産生された血清アルブ
ミン、特にヒト血清アルブミンは薬理学的製品としての
使用のために高純度において、高度回収性を以て純化さ
れる。純化工程前に発酵液（ブロス）の濾過を行なう。

上澄液に対し、又は分解後の細胞群に対し、純化工程を
施す。工程は一般に夾雑物のアルカリによる沈殿化を含
み；任意に酸性アニオン交換樹脂を用いて処理し、任意
に透析して培地を濃厚化し、続いて親油性固定相の使用
及び溶出液中の脱着剤としての親油性アニオンの使用下
に親和クロマトグラフィを施すことを含む。次いで血清
アルブミンを塩析と濃厚化とによって収穫する。所望に
より血清アルブミンを凍結乾燥して乾燥製品を提供する
。

上記方法により製造された血清アルブミンをイオン交換
クロマトグラフィ、粒径除外（５ｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉ
ｏｎ　）クロマトグラフィ、ＳＯ３−ＰＡＧＥ及びウサ
ギに対する免疫漫作を含む免疫学的試験により測定した
ところ、これは実質的に均質で単量体（七ツメリンク）
である。

本方法は、微生物使用下のＭｉ換え技法により調製され
た血清アルブミン、特にヒト血清アルブミンの製造にそ
の用途を見出すものである。微生物は原核性又は真核性
であってよく、特に真核性であってよく、細菌類例えば
大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）、枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ　）　、Ｂ、　リヘニホルミス（Ｂ、　１ｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｏ＋ｉｓ　）、ストレプトミセス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　）、プソイドモナス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ）等を含む。真核菌には酵母、例えばサ
ツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｓｍｙｃｅｓ　）　、シ
ゾサツカロミセス（５ｃｈｉｚｏ　ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ　）、タルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ　）　、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ　）等、糸
状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　ｆｕｎｇｉ　）　、ノ
イロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　）、アスペルギル
ス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）等が含まれる。

血清アルブミンの発現は微生物体に産生物の分泌又は保
持をもたら。ブロスを発酵器から回分式又は連続式で取
出す。分泌の場合には純化工程で細胞不含有の上澄液を
用いる。細胞不合上澄液は、発酵液の清澄化により、便
宜には遠心分離法又は限外濾過法を用いるブロスの濾過
によるタンパク質の濃厚化により得られる。濾過器は一
般に５００〜２５０００Ｄ、更に通常の場合に少なくと
も約１０００Ｄの部分の切捨て装置（ｃｕｔ−ｏｆｆ　
）を有する。望ましくは最終的濃厚化量生物は少なくと
も０．５　ｍｇ／ｍ　ｌ、好ましくは少なくとも約１ｍ
ｇ／ｍｊｌ’であるべきである。産生物が細胞の細胞質
内に保持されている場合には細胞群を収穫する。細胞分
解物は便宜な技法、細胞群の機械的又は化学的分解操作
を用いる技法、に従って産生され得る。

細胞砕片を遠心分離によって除去し得る。

細胞不含上澄液又は細胞分解物のｐＨを約７．５〜９、
更に好ましくは８〜８．５に調節する。ｐＨは便宜な手
段、例えば水酸化ナトリウム、又は他の適宜な塩基、通
常は０．１乃至それ以上の範囲の規定液の添加により修
整される。混合物を適宜に短時間だけ、一般には約５〜
３０分間攪拌してから約２５μ、好ましくは約２０μ以
上、更に好ましくは約５μ以上の粒子群を実質的に保持
する濾過器へ通して濾過する。沈殿物を、適当な緩衝溶
液、通常はｐＨ８以下に緩衝されていて一般には緩衝剤
濃度約２０〜１００ｍＭを有する希釈液を用いて洗浄す
る。望ましくは緩衝液のｐｉは約６．５〜８の範囲内に
ある。洗浄用液の容積は臨界的でなく濾液容積にもとづ
き一般に約０．１−０．５である。緩衝液の導電率は一
般に約０．１＝１００ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約１〜５
０１１３／３である。かように操作した後に濾液と溶液
とを合併する。

必須の次工程は親和クロマトグラフィの工程であってこ
れには親油性固定相を使用する。親和クロマトグラフィ
の工程において血清アルブミン含有溶液を面相、即ち通
常はコラム中の粒子群、と接触させるが該粒子群は、“
炭素原子数的６〜１２、好ましくは約６〜ｌＯ１更に好
ましくは８を有する親油性炭素鎖であって支持体への共
有結合のために官能基へ結合するアルキル基を通常の場
合に有している鉄鎖”によって被覆されるか又は官能性
化されている。該化合物の例はオクタノエート、オクチ
ルサクシネート等であってこれらの化合物においてはエ
ーテル、アミド又はその他の安定な官能性を有するもの
を介して親油基が支持体に結合している。溶出剤の中に
は親油性化合物、即ち便利なものとしてはカルボキシレ
ート、エステノに１及び類似物が含まれ、これらは約５
０〜２５０、更に普通には７５〜１５０ｍＭの濃度で水
性媒体に可溶性である。この技法の詳細については玉揚
文献［１１１ｉｃｈｍａｎ　ａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ
（１９７４））を参照されたい。

親和クロマトグラフィの遂行において培地はおよそ生理
学的ｐＨ１通常は約６．５〜８、更に普通には約７〜７
．５のｐＨ値を有する。緩衝液濃度は約５０〜１５０ｍ
Ｍであることが一般である。

望ましくは親和吸着剤上へ血清アルブミン含有培地を負
荷させるに当り、約０．５〜１．５Ｍの塩（ＮａｌＪ）
を添加された平衡化緩衝液を用いてコラムを洗浄する。

望ましくは親和クロマトグラフィ操作の前又は後に、イ
オン交換をも使用して血清アルブミンの純化を更に増進
させる。前者の場合には緩衝化溶液、即ち通常はｐＨ７
以下で、一般に希釈されて緩衝剤濃度約２０〜１００ｍ
Ｍを有する該溶液を用いて沈殿物を洗浄する。望ましく
は緩衝液のｐ旧よ約４〜５．５の範囲内にある。洗液の
容積は臨界的でなく、濾液容積にもとづき約０．１〜０
．５であることが一般である。緩衝液の導電率は約０．
１〜１００ｍ１ｓ／ｅ１ｍ、好ましくは約１〜５０ｍ５
／ｃｌｌであることが一般である。濾液と洗液とを合併
した後に溶液のｐＨを約３．５〜６、好ましくは４〜５
．５に下げる。後者の場合には親和クロマトグラフィ操
作後の溶出液のｐＨを約３．５〜６、好ましくは４〜５
．５に下げる。

イオン交換工程の目的は核酸、夾雑タンパク質及び色素
類の除去にある。血清アルブミン含有培地は、回分式又
は連続式でのコラム通過時にイオン交換樹脂と結合し、
該接触は約５〜６０分間、好適にはｌＯ〜３０分間保た
れることが常である。

アニオン交換吸着剤例えばＱＡＥ又はＤＥＡＥ（いずれ
も後文参照）を使用し、これらは商業上入手可能な担体
に結合している。血清アルブミン含有培地は酸性培地と
して使用されるが該培地は一般にはｐＨ３，５〜６、更
に普通には約４〜５．５を有するものであり、該ｐＨは
各種の酸又は緩衝剤の添加により容易に達成される。緩
衝剤濃度は一般に約２５〜１００ｍＭの範囲内にある。

イオン交換樹脂対タンパク質の重量比は一般に少なくと
も約ｌ＝１であって約３０：１を越えてはならず、好ま
しくは約５〜１５：１．更に好ましくは約１０：１であ
る。使用前にアニオン交換樹脂を、“血清アルブミン含
有培地に使用される低度ｐＨの緩衝液”を用いて平衡化
させることが一般である。

次に血清アルブミン含有培地を樹脂から便宜の手段、例
えば５分間、２０００Ｘｇの遠心分離、によって単離し
、続いて低度ｐＨの緩衝液を用いてイオン交換樹脂を洗
浄するがこの場合にイオン交換樹脂容積に対する低度ｐ
Ｈの緩衝液の容積は一般に約１〜２０倍、通常は２〜Ｉ
Ｏ倍である。１回又は複数回、通常は２回の洗浄を行な
う。液状培地を合併するとｐＨは通常の場合に上昇して
およそ中性、一般にはｐＨ約６．５〜８、更に普通には
約７〜８となる。およそ中性となった該培地について次
いで例えば、ｐＨ約６〜ＩＯ１好ましくは約６〜８を有
すると共に導電率約０．５〜ｌ　００ｍＳ／ｃｍ、好ま
しくは約０．５〜２０ａ＋Ｓ／ｃｍを有するリン酸塩緩
衝液に対する透析を行なう。いかなる場合にも緩衝液は
、親和クロマトグラフィコラムに対して使用されたもの
と同じである。該培地を濃厚化すると通常は濃度約１〜
２０Ｂタンパク質／　ｔａ　１、更に通常の場合に約２
〜１５ｍｇ／ｓ＃を与える。

固状担体又は支持体として広範囲にわたる支持体又は吸
着剤を使用し得る。かような固状担体には無機担体例え
ばガラス及びシリカゲル、有機担体、合成又は天然源担
体例えばアガロース、セルロース、デキストラン、ポリ
アミド、ポリアクリルアミド、二官能性アクリレートの
ビニルコポリマー及び各種のヒドロキシル化モノマー及
び類似物が含まれる。商業上入手可能な担体は商標名セ
ファデクス（５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｏ）、トリサクリル（
Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｇ　）、ウルトロゲル（Ｕｌｔｒ
ｏｇｅｌ　Ｏ）、ダイノスフィア（Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒ
ｅｓ　＠　）、マクロソルブ（Ｍａｃｒｏｓｏｒｂ　Ｏ
）、ＸＡＤ樹脂類及びその他として販売されている。

上記の各工程における条件は非変性化条件、即ち一般に
は約−１Ｏ℃〜＋３０℃の便宜の温度範囲、更に普通に
はおよそ周辺温度である。クロマトグラフィ工程は便宜
に回分式又は連続式で遂行され得る。分別についてはい
かなる便宜方法例えば遠心分離、濾過、デカンテーショ
ン又は類似法も使用され得る。

本発明方法の具体化は下記の諸工程即ち：血清アルブミ
ンをコードする構造遺伝子を有する発現性構成体の使用
による形質転換の結果その中に血清アルブミンを発現し
ている酵母細胞群を普通培地中で生育させ； 産生物含有培地を清澄化発酵液又は細胞分解物として単
離し； 産生物含有培地をｐＨ約７．５〜９のアルカリ性として
からこのアルカリ性培地を沈殿物から分別し；該アルカ
リ性培地のｐａｌ値を約４．０〜５．５に酸性化させて
からこの酸性化培地をアニオン交換吸着剤と共に恒温保
持し； 該酸性化培地のｐＨ値を生理学的ｐＨの近似値へ変更さ
せて濃厚化血清アルブミンを生成させ、この濃厚化培地
を親油性固定相の使用下にクロマトグラフィによって処
理し、脱着剤としての水溶性リピドアニオンの添加によ
りアルブミンを溶出させ；そして 微生物由来の夾雑物を実質的に含有しない純化された血
清アルブミンを単離する諸工程を含む。

〔実施例〕

下記の諸例は例示のためのみであって本発明を限定する
ためではない。

例　　１ 清澄化発酵ブロスからのＨ３Ａの純化 イーストエキス０．５％（Ｗ／Ｖ）、コーンスチーブ固
形物２％（Ｗ／Ｖ）、グルコース０．７％（Ｗ／　Ｖ　
）及び無機塩を含む培地中でクルイベロミセスラクチス
（Ｋ、　　１ａａｃｔｉｓ　）菌株ＣＢ　５２３６０を
７０時間、３０℃で生育させた。発酵中にグルコースを
供給した。発酵ブロスを遠心処理（４０００ｒｐｍ、　
５分間）してから上澄液を濾過器（５ｅｉｔｚＫ５００
）によって濾過した。１００ＯＤの切捨て装置を有する
濾過器を用いる限外濾過法によって最終溶液を６倍に濃
厚化した。最終のタンパク質（アルブミン）濃度は１ｍ
ｇ／ｍｊｉ！であった。

アルカリ添加沈殿生成二上記の清澄化濃厚化発酵ブロス
に対して純化Ｈ３Ａの脱脂物（（：ｏｈｎＦｒａｃｔｉ
ｏｎ　Ｖ　）を添加してＨ３Ａの含有率がタンパク質含
有量（１０ｍｇ／ｍ　Ｒ）の９０％（Ｗ／Ｗ）となるよ
うにした。Ｈ３Ａ含有溶液のｐＨは８．１にまで増加し
た。これを１５分間撹拌してから２０μｍ濾過器によっ
て濾過した。フィルターケーキを５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ４，５）で２回洗浄し７、続いて合併した濾液
のｐｎを４．５に調節した。

ＱＡＥ−セファ−゛クス　　のクロマトグラフィ：前記
工程で得られたＨ３Ａ溶液をＱＡＥ−セファデスクＡ　
−５ｏＯと共に回分式で３０分間恒温保持した。ｉｌ　
Ｑ　Ａ　Ｅ−セファデクスは５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ４，５）を用いて平衡化されたものであり、
タンパク質：吸着剤（乾物重量）の比（Ｗ／Ｗ”）は１
：１０である。恒温保持後にゲルサスペンションを遠心
処理によって除去し、続いて５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ４，５）を用いて２回洗浄した。上澄液を集
めて合併してからこの溶液のｐＨを７．４に調節し、次
に透析及び濃厚化によりタンパク質濃度１０ｍｇ／ｓ１
とした。

和クロマトグラフィ：上記工程で得られたＩＳＡ溶液を
、文献［Ａ、　Ｗｉｃｈｍａｎ　ａｎｄ　　Ｌ−０゜＾
ｎｄｅｒｓｓｏｎ　　（１９７４）玉揚書］記載に従っ
て１゜４−ジアミノ−ブタンセファロース４Ｂとカプリ
ングさせたオクチルサクシネート無水物に接触させた。

該親和吸着剤を１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）の使用で平衡化させた。ＨＳ＾−含有溶液を
親和吸着剤上へ負荷してから“ＩＭＮａＣ１が添加され
た平衡化用緩衝液”でそれを洗浄した後に“１００ｍＭ
オクタン酸ナトリウムが添加された１００ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，４）　　”を用いてＩＳＡを
溶出させた。純化ＩＳＡを塩析してタンパク質濃度をｌ
Ｏ＋ｇ／ｍ１にまで濃厚化した。

本例記載の操作に従うとＩＳＡ回収率は７５％であり、
５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（第１図）、ＩＥＦ（第２図）　、
ＨＰＩＥＣ（第３図）及びＨＰＳＥＣ（第４図）に示さ
れる通り夾雑物は含まれていない。これらの成績はＩＳ
Ａ収得製品の高純度を証明するものである。

更に純化血清アルブミンの特性化を免疫学的方法によっ
ても又遂行した：即ちウサギを純化１１５Ａによって免
疫処置し、二重拡散法（１３゜０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ
　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃ
ａｎｄ。

（１９４８）２８：１８６−１９１）に従って、脱脂さ
れたＩＳＡ又は発酵ブロスからのに、ラクチスのタンパ
ク質に対する抗体応答に関して抗血清をスクリーニング
した。この技法の使用によるとＩＳＡに対する抗体のみ
が検出された。

イオン交換工程不使用の下で例１の操作を繰返した。本
例でのＨ３Ａ３％率（９０％）は例１での該回収率より
も高かった。けれどもアルブミン対タンパク賞（ｗ　／
　ｗ　）の比はｌであったし、純化血清アルブミンのＨ
ＰＩＥＣクロマトグラム（第５図）はＩＳＡピークの前
部における小さいピークの存在を示した。のみならず脱
脂ＩＳＡ及び例１で得られたＩＳＡとは対照的に、最終
製品は微黄色を呈し、これは発酵ブロスから由来する色
素の存在を示す。

クルイベロミセス　ラクチス（ＣＢＳ２３６０；例１記
載のようにして培養されたもの）の細胞ペーストを水を
用いてｌ：ｌに希釈し、播潰器（Ｄｙｎｏｍｉｌｌ　ａ
ｐｐａｒａｔｕｓ　）中でガラス球によって分裂させた
。分解細胞群を遠心分離器（Ｓｏｒｖａｌｌｃｅｎｔｒ
ｉｆｕｇｅ、　　Ｓ　Ａ　６００　）中で１５０００．
ｒｐｍに２０分間遠心処理し、上澄液を次工程で使用し
た。

アルカリによる゛　！ヒ：清澄化細胞分解物に対して脱
脂純化Ｉ　Ｓ　Ａ　（Ｃｏｈｎ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ
　）を添加し、かようにして全タンパク質含有量：　１
０ｍｇ／ｌ１１１の５％（Ｗ／Ｗ）をＨＳＡ含有量に相
当させた。ｌ５Ａ−含有溶液のρ■は８．１に上昇した
。これを１５分間攪拌してから２０μｍ及び５μｍ濾過
器へ通して濾過した。フィルターケーキを５０ｍＭ酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，５）で２回洗浄し、続いて
合併した濾液のｐＨを４．５に調節した。

ＱＡＥ−セファデクス　クロマトグーフィロ上記工程で
得られたＩＳＡ溶液を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５，０）で平衡化され、０．２５ＭＮａＣｊ！を
含有しているＱＡＥ−セファデクスＡ−５０＠（吸着剤
：タンパク質の比（ｗ／ｗ）−１０：１）と共に回分式
で恒温保持した。恒温保持後にゲルサスペンションを遠
心処理によって除去し、平衡化緩衝液の使用下に吸着剤
を２回洗浄した。

集められた上澄液を合併し、この溶液のｐＨを７．４に
調節してからｌ５Ａ−含有溶液を透析し、タンパク質濃
度を１０ｍｇ／ｍＡ’にまで濃厚化した。

ＨＳ　Ａを含有する不純溶液を更に処理するために例１
記載のようにして親和クロマトグラフィを行なった。ｌ
３Ａ回収率は５０％であり、最終製品の純度はこれをア
ルブミン１１ｇ／タンパクＩｔｍｇとして特性化すると
０．８５であった。

未刊行のＥＰ−Ａ−８８２０１６３２・２（１９８８年
７月２８日出願）明細書中の例１０記載の通りのｌ３Ａ
発現性遺伝子を有するプラスミドを用いて形質転換させ
たクルイベロミセスラクチス菌株ＣＢ５２３６０を本明
細書例・１記載の培地中で３０℃に１１０時間生育させ
た。発酵過程でグルコースを供給した。発酵ブロスを遠
心処理（４０００ｒｐＨ，５分間）してから上澄液を、
１０００Ｄ部分の切捨て装置を具える濾過器を用いる視
外濾過法によって２０倍に濃厚化した。最終のタンパク
質濃度は１０ｍｇ／ｌｌＩ４！であってそのうちの０．
４５Ｂ／ｍｊ！は組換え技法により産生された単量体の
（モノメリックな）ｌ３Ａから成っていた。

組換え体由来Ｈ３Ａ−含有溶液のｐＨを８．１に上昇さ
せた。この溶液を１５分間攪拌してから２０μｍ濾過器
へ通した。フィルターケーキを５０＋＋＋Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ４，５）で２回洗ってから合併した濾液のｐ
Ｈを４．５に調節した。組換え体由来ＩＳＡを更に純化
するためにＱＡＥ−セファデクスクロマトグラフィ及び
親和クロマトグラフィを例１記載のようにして遂行した
。

本例記載の操作によると純化されたモノメリックな組換
え体由来アルブミンは微黄色を呈していてその回収率は
７０％であった。５ＤＳ−ＰＡＧＥ（第６図）、ＩＥＦ
（第７図”）　、ＨＰＳＥＣ（第８Ａ図及びＨＰＴＥＣ
（第８Ｂ図）によって上記アルブミン中の僅少な夾雑物
（全部で〈８％）の存在が示されている。

〔発明の効果〕

前記諸成績から本発明は組換え技法を用いた迅速で効率
良好な血清アルブミン純化を達成する。

即ち本発明は血清アルブミン及び類似タンパク質精製の
ための迅速で有効な方法を提供すると共に発現用宿主と
して使用された微生物から由来する夾雑物を実質上含有
しない製品を提供する。かようにして製薬学的に有用で
、大量生産に効果を奏し、高度の回収率を達成する製品
を与えることが可能である。

本明細書中に言及されたすべての刊行物及び特許出願明
細書は本発明が関係する技術分野の熟練技術者の技術レ
ベルを示すものである。該すべての刊行物及び特許出願
明細書は特別に個々に参考として示されている。

本明細書中の諸例の記載は本発明の解明と理解とに資す
ることを目的としており、本発明の範囲内で或種の変更
及び修正が施され得ることは自明であろう。

【図面の簡単な説明】

添付図面の第１図は還元条件下のヒト血清アルブミンの
５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動）（銀染色）の結果を示す。 脱脂ＨＳＡ　：尿路１（１００ｎｇ）　　；５　（５０
０ｎｇ）　　；９　（１０μｇ）、純化ＨＳＡ　：尿路
２．　３　（１００ｎｇ）　　；　６．　７　（５００
ｎｇ）ｉｌｏ、１１　　（１０μｇ）。分子量マーカー
：尿路４．８゜ 第２図はヒト血清アルブミンの等電点分画電気泳動（Ｃ
ＢＢ　　Ｒ−２５０染色）の結果を示す。 ■二尿路１，２．３による試料の通用個所。■：泳絡路
４，５．６おける試料の適用個所。■：泳絡路７，８．
９おける試料の適用個所。脱脂ｌ５Ａ（１０μｇ）：尿
路１．　４．　７゜純化Ｈ３Ａ（１０μｇ）：その他の
尿路。 第３図はＭｏｎｏ　ＱＯ上のヒト血清アルブミンの高性
能イオン交換クロマトグラフィの結果を示す。 上方のクロマトグラム：純化）（ＳＡ　、下方のクロマ
トグラム：脱脂ＩＳＡ。 第４図は旧ｏ−３ｉｌ　　ＴＳＫ　　２５００上のヒト
血清アルブミンの高性能粒径除外クロマトグラフィの結
果を示す。タンパク質試薬を用いるタンパク質検出（Ｐ
ｏｓｔ−ｃｏｌｕｍｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ
による）。 上方のクロマトグラム：脱脂Ｈ３Ａ；下方のクロマトグ
ラム：純化ＩＳＡ。 第５図はアルカリ沈殿法及び親和クロマトグラフィによ
る純化されたヒト血清アルブミンのＭｏｎｏ　ＱＯ上の
高性能イオン交換クロマトグラフィの結果を示す。 第６図は還元条件下のヒト血清アルブミンの５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ　（ＣＢＢ　　Ｒ−２５０染色）の結果を示す。 脱脂ＩＳＡ：泳路２尿路０μｇ）及び３（１００μｇ）
。純化組換え体由来Ｈ３Ａ：泳路４（３５μｇ）及び５
（７０μｇ）。分子量マーカー：旅路ｌ及び６　（２０
μｇ）。 第７図はヒト血清アルブミンの等電集束法（銀染色）に
よる結果を示す。マーカー：旅路ｌ及び６゜脱脂ＨＳ　
Ａ　：旅路２（０，２５μｇ）及び３（０，５０μｇ）
。純化組換え体由来アルブミン：尿路４（０，５０μｇ
）及び５（０，２５μｇ）。 第８図は組換え体由来Ｈ３Ａの高性能液体クロマトグラ
フィの結果を示す。 Ａ：Ｂｌｏ−５ｉｌ　　ＴＳＫ２５０（Ｄ上のＨＰＳＥ
Ｃ。 Ｂ　：　Ｍｏｎｏ　ＱＯ上のＨＰＩＥＣ。 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 第３図 ０　ｍｉｎ 第４図 ｉｎ 第５図 ０　ｍｉｎ 第６図 第７図

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）純化された組換え体由来血清アルブミンの製造方
   法において、 血清アルブミンをコードする構造遺伝子を有する発現性
   構成体の使用による形質転換の結果その中に血清アルブ
   ミンを発現している微生物細胞群を培地中で生育させ； 産生物含有培地を清澄化発酵液として、又は細胞分解物
   として単離し； 産生物含有培地をアルカリ性としてからこのアルカリ性
   培地を沈殿物から分別し； 該アルカリ性培地のｐＨ値を生理学的ｐＨの近似値へ変
   更させて濃厚化血清アルブミンを生成させ、この濃厚化
   培地を親油性固定相の使用下にクロマトグラフィによっ
   て処理し、脱着剤としての水溶性リピドアニオンの水相
   に対する添加により、アルブミンを溶出させ；そして 微生物由来の夾雑物を実質的に含有しない純化された血
   清アルブミンを単離する諸工程を含むことを特徴とする
   前記の方法。
2. （２）クロマトグラフィ処理の前に、アルカリ性培地を
   酸性化し、この酸性化培地をアニオン交換樹脂の使用下
   に恒温保持する工程を更に含む請求項１記載の方法。
3. （３）酸性化培地のｐＨが４．０〜５．５である請求項
   ２記載の方法。
4. （４）恒温保持後の酸性化培地を透析する追加の工程を
   含む請求項２又は３記載の方法。
5. （５）アルカリ性培地のｐＨが約７．５〜９．０である
   請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. （６）脱着剤が炭素原子数約６〜１２のアルキル基を有
   する請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. （７）脱着剤が炭素原子数約６〜１２のカルボキシレー
   トである請求項６記載の方法。
8. （８）純化血清アルブミンを透析する追加工程を含む請
   求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
9. （９）微生物が酵母である請求項１〜８のいずれか１項
   記載の方法。
10. （１０）血清アルブミンがヒト血清アルブミンである請
    求項１〜９のいずれか１項記載の方法。