FI92404C - Menetelmä seerumin albumiinin puhdistamiseksi - Google Patents

Description

92404

Menetelma seerumin albumiinin puhdistamiseksi Tåmå keksinto liittyy alaan, joka koskee rekombinanttiteknii-kalla valmistettujen proteiinien, erityisesti seerumin albu-miinin puhdistamista ja keksinto kohdistuu menetelmåån puh-distetun rekombinanttisen seerumin albumiinin valmistamiseksi.

Ihmisseerumin albumiini ("HSA") on plasman pååproteiinikom-ponentti ja koostuu 585 aminohapon muodostamasta yhdestå poly-peptidiketjusta, jonka molekyylipaino on noin 66 000 daltonia. Sen 17 molekyylinsisåistå disulfidisiltaa vaikuttavat albu-miinimolekyylin korkeaan stabiiliuteen.

Albumiinin ensisijaisena tehtåvånå plasmassa on yllåpitåå kol-loidin osmoottista painetta verisuonessa. Edelleen proteiini toimii useiden ligandien, esim. bilirubiinin ja rasvahappojen kantajana. (Katso F. Rothsteinin, V.M. Rosenoerin ja W.L. Hughesin selostusta julkaisussa Albumin Struct. Funct. Uses (1977) 7-25; U. Kragh-Hansenin Pharmacol. Rev. (1981) 33:17-53; T. Peters Jr.:n Adv. Prot. Chem. (1985) 37:161-245.

Puhdistettua seerumin albumiinia indikoidaan hypovoleemisen shokin eståmiseen ja hoitamiseen vaikean hypoalbuminemian ta-pauksissa hemodialyysin ja kardiopulmonååristen ohituskåsitte-lyjen apuna ja yhdesså vaihtoverensiirron kanssa neonataalisen hyperbilirubinemian hoidossa.

HSA:n puhdistamiseksi plasmasta tai plasentasta suuressa mit-takaavassa kaytetåån usein sakkautusmenetelmiå, jotka kåyttå-våt etanolia, polyeteeniglykolia, trikloorietikkahappoa tai ammoniumsulfaattia yhdesså RivanolR:n ja/tai nestekromatogra-fiamenetelmien kanssa (Katso viimeksi mainittua: J. Saint-Blancard, J.M. Kirzin, P. Riberon, F. Petit, J. Fourcart, P. Girot ja E. Boschetti, Anal. Chem. Symp. Ser. (1982) 2.:305-312; J.M. Curling Methods of Plasma Protein Fractionation (1980) 77-91; M.J. Harvey Methods of Plasma Protein Fractio- 92404 2 nation (1980) 189-200; N.E. Schultze ja J.F. Heremans, Mol. Biol. Hum. Prot. (1 966) J_:261—270; J. Liautau, J. PI a, A. Debrus, P. Gattel, R. Plan ja L. Peyron, 13th Int. Con^r.

TABS (1973) 21:107-114, Hao, Y-L, Vo,?c, Sans (1 985) M:1-S; ja U.S.-patentti K o. 4,228,15**.)

Laboratoriomittakaavassa affiniteettikromatografi an kaytta-mista seerumin albumiinin puhdistamiseen ovat selittaneet T. Peters Jr., H. Taniuchi ja C.B. Anfinsen Jr. julkaisussa J. Biol. Cher.i. (1973) 248(7):2*147-2451: A. Uichman ja L-O.

Andersson Biochim. Biophvs. Acta (1974) 372:218-224; ja A.

As lam, D.J. Jones ja T.F. Brown Anal. Bioche.T,. (1976) 15:329-335 .

Koska tarvitaan suuria maoric" seerumin albumiinia hoitoa vårten ja seerumin albumiinin lahde (plasma) on rajallinen, on etsitty muita tekniikoita HSA:n valmistamiseksi suuria maa-ria. Onnistumisista on raportoitu HSA:n valmistamisessa fer-mentoirnalla kayttaen transformoituja mikro-organismeja tai solulinjoja, jotka on tehty rekombinantti DMA -tekniikoilla. Katso esimerkiksi EP-A-C073&46.

Kuitenkin yksi paaongelmista transformoituja soluja kayttaen fermentoimalla tuotetun seerumin albumiinin puhdistamisessa on kasvuvaliaineesta (fermentointiliemesta) tai solulysaatis-ta peraisin olevien kontaminoivien komponenttien 1 a s n ao 1 o, jotka komponentit on poistettava puhdistetun, homogeenisen seerumin albumiinin saamiseksi.

Hama kontaminantit ovat esimerkiksi vieraita proteiineja, joiden odotettaisiin muodostavan immunologisen reaktion. Kon-taminoituneen HSA:n antarninen voisi aiheuttaa shokin. Mama kontaminantit ovat taysin erilaisia kuin ne, joita esiintyy seerumin albumiinin fraktionoinnissa plasmasta tai plasentas-ta. Tama merkitsee sita, etta puhdistusmenetelmia, jotka on kehitetty luonnollisten lahteiden HSA:lle, ei voida ekstrapo- 3 9 2 4 ϋ 4 loida rekombinantti seerumin albumiinin puhdistamiseen. Kåy-tånndllisiå menetelmiå ihmisseerumin albumiinin, joka on tuotettu transformoiduilla mikro-organismeilla tai solulin-joilla, puhdistamiseksi ei ole julkaistu toistaiseksi eivåt-kå ne ole vielå saatavilla.

Rekombinoimalla tuotettu seerumin albumiini puhdistetaan keksinnon mukaisesti alkuvaiheessa alkalisella saostuksella, mahdollisesti ioninvaihtokromatografialla happamassa pH:ssa, ja affiniteettikromatografialla kåyttåen liikkumatonta faa-sia, jossa on lipofiilinen pinta, kåyttåen lipidianionia desorbenssinå vesifaasissa. Saadaan suuria saantoja ja puh-tauksia.

Kuvio 1: Ihmisseerumin albumiinin SDS-PAGE pelkiståvisså olosuhteissa (hopeavårjåys). Rasvaton HSA: kaistat 1 (100 ng); 5 (500 ng); 9 (10 ^g). Puhdistettu HSA: kaistat 2, 3 (100 ng); 6, 7 (500 ng); 10, 11 (10 μg) . Molekyylipainomark-kerit: kaistat 4, 8.

Kuvio 2: Ihmisseerumin albumiinin isoelektrofokusointi (CBB R-250 -vårjåys). I: nåytteiden levityskohta kaistoissa 1, 2, 3. II: nåytteiden levityskohta kaistoissa 4, 5, 6. III: nåytteiden levityskohta kaistoissa 7, 8, 9. Rasvaton HSA (10 μg): kaistat 1, 4, 7. Puhdistettu HSA (10 ^g): loput kaistat.

Kuvio 3: Ihmisseerumin albumiinin korkean erotuskyvyn ioninvaihtokromatograf ia Mono QR:lla. Ylempi kromatogrammi: puh-" distettu HSA; alempi kromatogrammi: rasvaton HSA.

Kuvio 4: Ihmisseerumin albumiinin korkean erotuskyvyn koko ekskluusiokromatografia Bio-Sil TSK-250R:llå. Proteiinin de-tektointi kolonnin jålkeisellå derivatisoinnilla proteiini- 4 G O ·', A J i. -t i.; ~t reangenssilla. Ylempi kromatogrammi: rasvaton HSA; alempi kromatograrami: puhdistettu HSA.

Kuvio 5: Alkalisella saostuksella ja affiniteettikromatogra-fialla puhdistetun ihmisseerumin albumiinin korkean erotus-kyvyn ioninvaihtokromatografia Mono QR:llå.

Kuvio 6: Ihmisseerumin albumiinin SDS-PAGE pelkiståvisså olosuhteissa (CBB R-250 -vårjåys). Rasvaton HSA: kaistat 2 (50 /*g) ja 3 (100 μg) . Puhdistettu rekombinantti HSA: kaistat 4 (35 ^g) ja 5 (70 ^g). Molekyylipainomarkkerit: kaistat 1 ja 6 (20 μg) .

Kuvio 7: Ihmisseerumin albumiinin isoelektrofokusointi (Ag-vårjåys). Markkerit: kaistat 1 ja 6. Rasvaton HSA: kaistat 2 (0,25 μg) ja 3 (0,50 μg). Puhdistettu rekombinanttialbumii-ni: kaistat 4 (0,50 μg) ja 5 (0,25 μg).

Kuvio 8: Rekombinantti-HSA:n korkean erotuskyvyn nestekroma-tografia. HPSEC Bio-Sil TSK-250R:llå (A) , HPIEC Mono QR:llå (B) .

Kyseesså olevan keksinnon mukaisesti rekombinanttiteknii-koilla valmistettu seerumin albumiini, erityisesti ihmisseerumin albumiini, puhdistetaan suurella saannolla ja erittåin puhtaaksi kåytettåvåksi farmakologisena tuotteena.

Keksinto koskee nåin olien menetelmåå puhdistetun rekombi-nanttisen seerumin albumiinin valmistamiseksi, jolle mene-telmålle on tunnusomaista, ettå se kåsittåå: mikro-organismien kasvattamisen våliaineessa.. jotka mikro-organismit on transformoitu ekspressiorakenteella, joka kå- 924 G 4 5 sittåå seerumin albumiinia koodaavan rakennegeenin, jolloin seerumin albumiini ekspressoituu; tuotevåliaineen eriståmisen selkeytettynå fermentointilieme-nå tai solulysaattina; tuotevåliaineen tekemisen alkaliseksi pH-arvoon 7,5-9,0 ja alkalisen våliaineen erottamisen sakasta; mainitun alkalisen våliaineen pH:n muuttamisen suunnilleen fysiologiseksi pHrksi konsentroidun seerumin albumiinin muo-dostamiseksi ja mainitun konsentroidun våliaineen kromato-grafoinnin lipofiilisellå liikkumattomalla faasilla ja albumiinin eluoinnin lisååmållå desorbenssina vesiliukoista li-pidianionia vesipitoiseen faasiin; ja puhdistetun seerumin albumiinin eriståmisen oleellisesti va-paana mainitusta mikro-organismista peråisin olevista konta-minanteista.

Puhdistusmenetelmåå edeltåå fermentointiliemen suodatus. Menetelmåå voidaan soveltaa nåin saadulle supernatantille tai soluihin liuotuksen jålkeen. Menetelmå kåsittåå konta-minanttien alkalisen saostamisen; mahdollisesti kåsittelyn happamalla anioninvaihtohartsilla ja mahdollisesti dialyysin våliaineen våkevoimiseksi, mitå seuraa affiniteettikromato-grafia, jossa kåytetåån lipofiilistå liikkumatonta faasia ja lipidianionia desorbenssinå eluoinnissa. Seerumin albumiini voidaan sitten ottaa talteen suolanpoistolla ja våkevdinnil-lå. Jos halutaan, seerumin albumiini voidaan lyofilisoida kuivan tuotteen saamiseksi.

Kyseesså olevan keksinnon menetelmållå tuotettu seerumin albumiini on oleellisesti homogeeninen ja monomeerinen måå-ritettynå ioninvaihtokromatografialla, kokoekskluusiokroma- tografialla, SDS-PAGE:lla ja immunologise11a testauksella sisåltåen kaniinien immunisoinnin.

Λ Γ) Α η. Λ 6 y Ζηυ 4

Menetelmålle loytyy kåyttoå seerumin albumiinin, erityisesti ihmisseerumin albumiinin, joka on valmistettu mikro-organisme ja kåyttåvållå rekombinanttitekniikalla, tuotannossa. Mikro- organismit voivat olla prokaryoottisia tai eukaryootti-sia, erityisesti eukaryoottisia, ja sisåltåå esim. sellaisia bakteereja, kuten E. coli. B. subtilis. B. licheniformis. Streotomyces. Pseudomonas. jne. Eukaryoottien joukossa ovat hiivat, kuten esim. Saccharomvces. Schizo-saccharomyces. Kluyveromvces. Candida. jne., rihmasienet, Neurospora. Aspergillus . jne.

Seerumin albumiinin ekspressio vox johtaa tuotteen erittymi-seen tai pidåttymiseen organismissa. Liemi voidaan poistaa panoksittain tai jatkuvasti fermentteristå. Erittymisen ta-pauksessa kåytetåån solutonta supernatanttia puhdistus-prosessissa. Soluton supernatantti saadaan selkeyttåmållå fermentointiliemi, sopivasti sentrifugoimalla tai suodatta-malla liemi kåyttåen ultrasuodatusta proteiinituotteen kon-sentroimiseksi. Suodattimen erotusrajana on yleenså 500-25 000 D, tavallisemmin ainakin noin 1000 D. Suositeltavasti lopputuotteen konsentraation pitåisi olla ainakin noin 0,5 • mg/ml, edullisesti ainakin noin 1 mg/ml. Jos tuote pysyy solun sytoplasmassa, solut otetaan talteen. Lysaatti voidaan valmistaa minkå tahansa sopivan tekniikan mukaisesti kåyttåen mekaanista tai kemiallista solujen rikkomista lysaatin valmistamiseksi. Solujåte voidaan poistaa sentrifugoimalla.

Soluttoman supernatantin tai solulysaatin pH såådetåån ar-voon 7,5-9, edullisemmin 8-8,5. pH:ta voidaan modifioida millå tahansa sopivalla keinolla, kuten esim. natriumhyd-roksidin tai muun sopivan emåksen lisåyksellå tavallises-ti normaalisuusalueessa noin 0,1:stå våkevåmpåån. Seosta 7 92404 sekoitetaan sopivasti lyhyen aikaa, yleenså 5-30 minuuttia, ja suodatetaan suodattimen lapi, joka yleenså pidåttåå par-tikkelit, jotka ovat suurempia kuiri noin 25/tfm, edullisesti suurempia kuin noin 20/m, edullisemmin suurempia kuin noin 5 S akka peståån sopivasti puskuroidulla liuoksella, ta- vallisesti puskuroitu alle pH 8:n, yleenså laimeaksi, misså puskurikonsentraatio on noin 20:stå 100 mH:iin. Sopivasti puskurin pH on alueessa noin 6.5:stå 8:aan. Pesujen tilavuus ei ole kriittinen, olien yleensa noin 0.1:stå 0.5:een perus-tuen suodoksen tilavuuteen. Puskurin johtavuus on yleensa noin 0.1:stå 10G:aan mS/cm, edullisesti vålillå noin 1:stå 50 mS/cm. Jålkeenpåin suodos ja pesut yhdistetaån.

Seuraava oleellinen vaihe on affiniteettikromatografia, jossa kåytetåån lipofiilistå liikkumatonta faasia. Affiniteettikro-matografiavaiheessa seerumin albumiinia sisåltåvå liuos saa-tetaan kosketuksiin kiinteån pinnan kanssa, tavallisesti ko-lonnissa olevien partikkelien kanssa, jotka on pinnoitettu ta i funktionalisoitu noin 6-12 hiiliatomin, edullisesti noin 6-10 hiiliatomin, edullisemmin 8 hiiliatomin muodostamilla lipofiilisillå ketjuilla, misså ryhma normaalisti sisåltåå alkyyliryhman, joka on sidottu funktiona alisuuteen kovalent-tisen sidoksen muodostamiseksi kantajaan. Havainnollisiin yhdisteisiin sisåltyvåt oktanoaatit, oktyylisukkinaatit, jne, misså lipofiilinen ryhma voidaan sitoa kantajaan eetterin, amidin tai muun stabiilin funktionaalisuuden avulla. Eluee-neihin sisåltyy lipofiilinen yhdiste, sopivasti karboksylaat-ti, esteri tai vastaava, joka liukenee vesipitoiseen våliai-neeseen konsentraatiossa, joka on vålillå noin 50:stå 250:een, tavallisemmin 75:stå 150 mM:iin. Tekniikan edelleen selittamiseksi katso VJichman ja Andersson (197^), supra.

Affiniteettikromatografian suorittamiseksi våliaineen pitåå olla suunnilleen fysiologisessa pH:ssa, normaalisti alueessa noin 6.5:stå 8:aan, tavallisemmin alueessa noin 7:stå 7.5:een. Puskurin konsentraation pitåå yleensa olla alueessa 8 92404 noin 50:sta 150 mti:iin.

Toivotusti panostettaessa seerumin albumiinin valiainetta affiniteettiadsorbenttiin kolonni pestaan tasapainotuspusku-rilla, johon on liséitty noin 0.5: sta 1.5 : e e η M suolaa (I! a C1).

Toivotusti joko ennen tai jalkeen affiniteettikromatografian kaytetaan myos ioninvaihtoa seerumin albumiinin puhdistamisen edelleentehostamiseksi. Edeltavassa tapauksessa sakka pestaan puskuroidulla liuoksella, tavallisesti puskuroitu pH:hon, joka on alle 7, yleensa lair.ieaksi, jossa puskurikonsentraatio on noin 20:sta noin 100:aan mM:iin. Toivotusti puskurin pH on alueessa noin 4:sta 5.5:een. Pesujen tilavuus ei ole kriitti-nen olien yleensa noin 0.1:sta 0.5:een, suodoksen tilavuuteen perustuen. Puskurin johtavuus on yleensa noin 0.1-100 mS/cm, edullisesti valilla noin 1:sta 50:een mS/cm. Suodoksen ja pesujen yhdistamisen jalkeen liuoksen pH:ta alennetaan noin 3.5:sta 6:een, edullisesti 4:sta 5.5:een. Viimemainitussa • · tapauksessa affiniteettikromatografian jalkeen eluaatin pH:ta alennetaan noin 3.5:sta 6:een, edullisesti 4:sta 5.5:een.

Ioninvaihtovaihe auttaa poistamaan nukleiinihappoja, kontami-noivia proteiineja ja pigmenttejå. Seerumin albumiinin vali-aine voidaan yhdistaa ioninvaihtohartsiin joko panoksittain tai jatkuvasti kolonnin lapi, jossa kontaktia pidetaan ylla normaalisti noin 5-60 min, edullisesti 10-30 min. Anionin-vaihtoadsorbenttia, kuten esimerkiksi QAE:ta tai DEAE:ta, kaytetaan sidottuna kaupallisesti saatavissa olevaan kanta-jaan. Seerumin albumiinin valiainetta kaytetaan happovaliai- \ neena, jonka pH on yleensa valilla 3.5-6, tavallisemmin alu eessa noin 4:sta 5.5:een, mika voidaan helposti saavuttaa lissamalla joukko puskurien happoja. Puskurin konsentraatio on yleensa alueessa noin 25:sta 100:aan mM:a. Ioninvaihto-hartsin ja proteiinin valinen painosuhde on yleensa ainakin noin 1:1 eika ylita 30:1, ja on edullisesti noin 5-15:1, edullisemmin noin 10:1. Ennen kayttca anioninvaihtohartsi 92404 9 normaalisti tasapainotetaan alhaisen pH:n puskurilla, jota kaytetaan seerumin albumiinin våiliaineen kanssa.

Seerumin albumiinin valiaine eristetaån sen jalkeen milla tahansa sopivalla keinolla, esimerkiksi sentrifugoimalla 5 minuuttia, 2000 x g, mitå seuraa ioninvaihtohartsin pesu alhaisen pH:n puskurilla, missa alhaisen pH:n puskurin tilavuu-den suhde ioninvaihtohartsin tilavuuteen on yleensa noin 1-20 kertainen, tavallisesti 2-10 kertainen. Voidaan kayttaa yhts ta i useampaa pesua, tavallisesti kahta. Nestemaiset valiai-neet yhdistetaan ja pH nostetaan normaalisti suunnilleen neutraaliksi, yleensa alueeseen noin 6.5: sta 6:aan, tavalli-semmin noin 7: sta 8: aan. Suunnilleen neutraali valiaine dia-lysoidaan sen jalkeen esimerkiksi fosfaattipuskuria vastaan, jonka pH on noin 6:sta 10:een, edullisesti noin 6:sta 8:aan, johtavuuden ollessa noin 0.5:sta 100 :aan mS/cm, edullisesti noin 0.5:sta 20:een mS/cm. Joka tapauksessa puskuriliuos on sama kuin af f in i tee ttikolonnissa kay te t tav i;. Val iaineen kon-sentrointi tuottaa tavallisesti konsentraatin, joka on noin 1:sta 20:een mg proteiinia/ml, tavallisemmin noin 2:sta 15:een mg/ml.

Laajaa valikoimaa kantajia ja adsorbentteja voidaan kayttaa kiinteina kantajina. Tållaisiin kiinteisiin kantajiin sisal-tyvat epaorgaaniset kantajat, kuten esimerkiksi lasi ja sili-kageeli, orgaaniset, synteettiset tai luonnossa esiintyvat kantajat, kuten esimerkiksi agaroosi, selluloosa, dekstraani, polyamidi, polyakryyliamidit, bifunktionaalisten akrylaattien vinyylikopolymeerit, ja erilaiset hydroksyloidut monomeerit, ja vastaavat. Kaupallisesti saatavia kantajia myydåan nimillå Sephadex^, TrisacrylR, UltrogelR, DynospheresR, HacrosorbR, XAD-hartsit ja rnuut.

Olosuhteet suoritettaville toimenpiteille ovat denaturoimat-tomat olosuhteet, yleensa sopivien lampotilojen ollessa va-lilla -10°C:sta +30°C:een, tavallisemmin suunnilleen ymparis- 92404 10 t5n låmpdtila. Kromatografiset vaiheet voidaan suorittaa panoksittain tai jatkuvasti kuten halutaan. Mitå tahansa sopivaa erotusmenetelmåå voidaan kåyttåå, kuten esim. sent-rifugointia, suodattamista, dekantointia tai vastaavaa.

Keksinnon eras edullinen suoritusmuoto kåsittåå: hiivasolujen, jotka on transformoitu ekspressiorakenteella, joka kåsittåå seerumin albumiinia koodaavan rakennegeenin, jossa seerumin albumiini ekspressoituu, kasvattamisen ela-tusaineessa; tuotevåliaineen eriståmisen selkeytettynå fermentointilieme-nå tai solulysaattina; tuotevåliaineen tekemisen alkaliseksi pH:hon, joka on vålil-lå 7,5-9, ja alkalisen våliaineen erottamisen sakasta; mainitun alkalisen våliaineen hapottamisen pH:hon, joka on vålillå 4,0-5,5, ja mainitun hapotetun våliaineen inkuboimi-sen anioninvaihtoadsorbentin kanssa; mainitun hapotetun våliaineen pH:n muuttamisen suunnilleen fysiologiseksi pH:ksi konsentroidun seerumin albumiinin muo-dostamiseksi ja mainitun konsentroidun våliaineen kromato-grafoinnin lipofiilisellå liikkumattomalla faasilla ja albumiinin eluoinnin lisååmållå desorbenssinå vesiliukoista li-pidianionia; ja puhdistetun seerumin albumiinin eriståmisen oleellisesti vapaana mainitusta mikro-organismista peråisin olevista kon-·. taminanteista.

Seuraavat esimerkit tarjotaan havainnollistamiseksi eikå raj oittaviksi.

” 92404 KQkeet

Eaimerkki—1 HSA:n puhdistaminen selkevtetvsta fermentointiliemesta

Kluvveromvces lactis CBS 2360 kasvatettiin 70 tuntia 30°C:ssa valiaineessa, joka sisalsi hiivauutetta 0.5¾ (w/v), maissin liuoksessa syntyvia kiinteita aineita 2% (w/v), glukoosia 0.1% (w/v) ja mineraalisuoloja. Glukoosi lisattiin ferraen-toinnin aikana. Fernentointiliemi sentrifugoitiin (5 min.

*1000 rpm) ja supernatantti suodatettiin Seitz K 500 -suodat-timen lapi. Lopullinen liuos konsentroiti in 6 kertaa ultra-suodatuksella kayttaen suodatinta, jonka erotusraja oli 1000D. Lopullinen proteiinikonsentraatio oli 1 mg/ml.

Alkalinen saostus: Tahan selkeytettyyn konsentroituun fermen-tointiliemeen lisattiin rasvatonta puhdistettua HSA:ta (Cohn Fraction V) niin, etta HSA-pitoisuus oli 90¾ (w/w) proteiini-pitoisuudesta (10 mg/ml). HSA:ta sisåltåvån liuoksen pH:ta lisottiin 8.1:een, sekoitettiin 15 min. ja suodatettiin 20 /um suodattimen lapi. Suodoskakku pestiin kaksi kertaa 50 mM nat-riumasetaatilla pH 4.5, ja sen jalkeen yhdistettyjen suodos-kakkujen pH saadettiin 4.5:een.

QAE-Sephadex-kromatografia: Edellisessa vaiheessa saatua HSA-liuosta inkuboitiin panoksittain 30 minuuttia QAE-Sephadex A-

O

50r,:n kanssa, joka oli tasapainotettu 50 mM natriumasetaatti-puskurilla pH 4.5, proteiini:adsorbenttisuhteella (w/w) (kui-. ! vapaino) 1:10. Inkuboinnin jalkeen geelisuspensio poistettiin sentrifugoimalla ja pestiin sen jalkeen kahdesti 50 mM natri-umasetaattipuskurilla pH 4.5. Keratyt supernatantit yhdistet-tiin ja taman liuoksen pH saadettiin 7.4:aan ja sen jalkeen dialysoitiin ja konsentroitiin proteiinikonsentraatioon 10 mg/ml.

^2414 12

Affiniteettikromatografia; Aiemmassa vaiheessa saatu HSA-liuos saatettiin kosketukseen oktyylisukkiriaattianhydridin kanssa, joka oli kytketty 1,4-diamino-butaani Sepharose 4B:hen A. Wichmanin ja L-0. Anderssonin (1974) supra mukaan. Tfma affiniteettiadsorbentti tasapainotettiin 100 rnM natrium-fosfaattipuskurilla pH 7.4. Sen jålkeen kun HSA:ta sissltava li uos oli pakattu affiniteettiadsorbentin paaile ja pesty tasapainotuspuskurilla, johon oli lisatty 1 M NaCl:a, HSA:n eluointi suoritettiin 100 mM natriumfosfaattipuskurilla (pH 7.4), johon oli lisatty 100 mM natriumoktanoaattia. Puhdiste-tusta HSArsta poistettiin suola ja konsentroitiin proteiini-pitoisuuteen 10 mg/ml.

Tassa esimerkissa selitettya menettelya seuraten HSA:n saanto oli 75% eika SDS-PAGE (kuvio 1), IEF (kuvio 2), HPIEC (kuvio 3) ja HPSEC (kuvio 4) voinut esittaa yhtaån kontaminanttia, jotka tulokset osoittavat saadun HSA:n suurta puhtautta.

Puhdistetun seerurnin albumiinin karakterisointia suoritettiin edelleen myos immunologisilla menetelmilla: kaniinit immuni-soitiin puhdistetulla HSA:lla ja antiseerumeista tutkittiin vasta-ainevaste rasvatonta HSA:ta tai fermentointiliernesta peraisin olevia Kluvveromvces lactis proteiineja vastaan G.

: Ouchterlonyn kaksoisdiffuusiomenetelman mukaisesti, Acta

Path. Microbiol. Scand. (1948) £8:186-191. Tata tekniikkaa kayttaen havaittiin ainoastaan kohti HSA:ta suunnattuja vas-ta-aineita.

Esimerkki 2 HSA:n puhdistaminen selkevtetvsta fermentointiliernesta ilnian ioninvaihtokromatografiaa

Esimerkki 1 toistettiin mutta ilman ioninvaihtovaihetta. Ta-må:n prosessin HSA-saanto (90£) oli korkeampi kuin esimerkissa ' 1 saatu. Vaikka albumiinin ja proteiinin valinen suhde (w/w) 92404 13 oli 1, puhdistetun seerumin albumiinin HPIEC-kromatogrammi (kuvio 5) paljasti pienen piikin HSA-piikin edesså. Sita paitsi, rasvattoman HSA:n ja esimerkissa 1 saadun HSA:n vas-takohtana lopullinen tuote oli heikosti kellanvårinen, mika osoitti fermentointiliemesta peråisin olevan pigmentin las-naoloa.

Esinerkki 1 HSA; n puhdistaninen selkevtetvsta solulysaatista

Kluvveronivces lactis solupastaa (CBS 2360; viljelty esimerkissa 1 selitetylla tavalla) laimennettiin 1:1 vedella ja rikottiin lasihelmilla Dynomill-laitteessa. Lyscituja soluja sentrifugoitiin 20 minuuttia 15,000 kierroksella minuutissa Sorvall-sentrifugissa, SA 600 -roottori, ja supernatattia kaytettiin sellaisenaan.

Alkalinen saostus: Selkeytettyyn solulysaattiin lisattiin rasvatonta, puhdistettua HSA:ta (Cohn Fraction V) niin, etta HSA-pitoisuus oli 5% (v;/w) kokonaisproteiinipitoisuudesta: 10 mg/rr.l. HSA-ta sisaltavan liuoksen pH:ta lisattiin 8.1:een, sekoitettiin 15 minuuttia ja suodatettiin 20/ur,i ja 5/wm suo-dattimen lapi. Suodoskakku pestiin kaksi kertaa 50 mH natri-urnasetaattipuskurilla pH 4.5 ja sen jalkeen yhdistettyjen suodosten pH saadettiin 4.5:een.

QAE-Sephadex-kromatografia: Aiemmassa vaiheessa saatu HSA-liuos inkuboitiin panoksittain QAE-Sephadex A-50^:n kanssa • · (suhde (w/w) adsorbenttirproteiini = 10:1), joka oli tasapai- notettu 50 raM natriumasetaattipuskurilla pH 5.0, sisaltaen 0.25 M MaCl. Inkuboinnin jalkeen geelisuspensio poistettiin sentrifugoimalla ja adsorbentti pestiin kahdesti tasapaino-tuspuskurilla.

Keratyt supernatantit yhdistettiin, tarnan liuoksen pH saadet-

O Ο A 0 A

14 s ti in 7.4: ε an ja sen jalkeen HSA:ta sisal tave liuos dialysoi-tiin ja konsentroitiin proteiinipitoisuuteen 10 mg/ml. HSArta sisaltsvan, epapuhtaan liuksen edelleenkasittely suoritettiin affiniteettikromatcgrafialla, kuten on selitetty esimerkissa 1. HSA-saanto oli 502 ja lopputuotteen puhtaus, esitettyna mg albumiinia/mg prcteiinia, oli 0.85.

Esimerkki 4

Rekombinantti HSA:n puhdistaminen selkevtetvsts fermentoin-tiliemesta

Kluvveromvces lactis CBS 2360, transformoitu plasmidin kanssa sisaltåien HSA:n geenin kuten on selitetty salaisen julkaisun EP-A-88201632.2 (jatetty heinakuun 26. 1988) esimerkissa 10, kasvatettiin 110 tuntia 30°C:ssa tarnan selityksen esimerkissa 1 selitetyssa valiaineessa. Glukoosi lisattiin fermentoinnin aiksna. Fermentointiliemi sentrif ugoiti in (5 niin. 4000 rmp) ja supernatantti konsentroitiin 20 kertaa ultrasuodatuksella kayttaen suodatinta, jonka erotusraja oli 1000D. Lopullinen proteiinikonsentraatio oli 10 mg/ml, josta 0.45 mg/ml koostui monomeerisesta HSA:sta, joka oli tuotettu rekombinantti tek-niikalla .

Rekombinantti HSA:ta siseltavan liuoksen pH:ta lisattiin 8.1:een. Liuosta sekoitettiin 15 minuuttia ja suodatettiin 20 /mm suodattimen låipi. Suodoskakku pestiin kahdesti 50 raM natriumasetaatilla pH 4.5 ja sen jalkeen yhdistettyjen suo-dosten pH saadettiin 4.5:een. Rekombinantti HSA:n edelleen-• puhdistaminen kayttaen QAE-Sephadex -kromatografiaa ja affi- niteettikromatografiaa suoritettiin kuten esimerkissa 1 on selitetty.

Tcissa esimerkissa selitettye menettelys seuraten puhdistetun, monomeerisen rekombinan tti albumiinin, joka oli heikosti kellanvårinen, saanto oli 70¾. SDS-PAGE (kuvio 6), IEF (kuvio ,5 924ϋ4 7), HPSEC (kuvio 8A) ja HPIEC (kuvio 8B) voivat esittaå va-haisia kontaminantteja (kokonaisuudessaan < 8¾).

On ilmeista edella olevista tuloksista, etta kyseessa oleval-la keksinnolla saadaan aikaan rekombinantti tekniikoilla teh-dyn seerumin albumiinin nopea ja tehokas puhdistaminen. Main olien saadaan aikaan nopea ja tehokas menetelma seerumin albumiinin ja samanlaisten proteiinien puhdistamiseksi tuotteen valn.istamiseksi, joka on oleellisen vapaa kontaminoi vista mikro-organismeista, joita kaytetaan ekspressioisantina. Tolls tavoin voidaan saada tuotteita, jotka ovat kayttokelpoisia farmaseuttisina aineina, voidaan tuottaa tehokkaasti suurina maarins ja saada suurisaantoisina.

Kaikki julkaisut ja patenttihakemukset, jotka on mainittu tassa selityksessa, osoittavat alan ammattimiesten, joita tama koskee, taidon tasoa. Kaikki julkaisut ja patenttihake-mukset on liitetty tahSn viittauksena samassa laajudessa kuin jos kukin yksittåinen julkaisu tai patenttihakemus olisi eri-tyisesti ja yksilcllisesti osoitettu liitetyn viittauksena.

Vaikka edellS olevaa keksintoa on selitetty jossain maarin yksityiskohtaisesti havainnollistamalla ja esimerkkien avulla ymmartamisen helpottamiseksi, on ilmeista, etta tiettyja muu-toksia ja modifikaatioita voidaan tehda oheisten patenttivaa-timusten piirissa.

Claims (9)

1. Menetelmå puhdistetun rekombinanttisen seerumin albu-miinin valmistamiseksi, tunnettu siitå, ettå se kåsittåå: mikro-organismien kasvattamisen våliaineessa, jotka mikro-organismit on transformoitu ekspressiorakenteella, joka kåsittåå seerumin albumiinia koodaavan rakennegeenin, jolloin seerumin albumiini ekspressoituu; tuotevåliaineen eriståmisen selkeytettynå fermentointilieme-nå tai solulysaattina; tuotevåliaineen tekemisen alkaliseksi pH-arvoon 7,5-9,0 ja alkalisen våliaineen erottamisen sakasta; mainitun alkalisen våliaineen pH:n muuttamisen suunnilleen fysiologiseksi pH:ksi konsentroidun seerumin albumiinin muo-dostamiseksi ja mainitun konsentroidun våliaineen kromato-grafoinnin lipofiilisellå liikkumattomalla faasilla ja albumiinin eluoinnin lisååmållå desorbenssina vesiliukoista li-pidianionia vesipitoiseen faasiin; ja puhdistetun seerumin albumiinin eriståmisen oleellisesti vapaana mainitusta mikro-organismista peråisin olevista kon-taminanteista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå se kåsittåå edelleen ennen mainittua kromatogra-fointia mainitun alkalisen våliaineen hapottamisen ja tulok-sena olevan hapotetun våliaineen inkuboimisen anioninvaihto-hartsin kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå mainitun hapotetun våliaineen pH on 4,0-5,5.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmå, tunnet-tu siitå, ettå se sisåltåå lisåksi vaiheen mainitun hapote- 92404 17 tun våliaineen dialysoimiseksi mainitun inkuboimisen jal-keen.

5. Minkå tahansa edellå olevan patenttivaatimuksen mukai-nen menetelmå, tunnettu siitå, ettå mainitussa desorbenssis-sa on noin 6-12 hiiliatomia sisåltåvå alkyyliryhmå.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå mainittu desorbenssi on noin 6-12 hiiliatomia sisåltåvå karboksylaatti.

7. Minkå tahansa edellå olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå lisåvaiheen mainitun puhdistetun seerumin albumiinin dialysoimiseksi.

8. Minkå tahansa edellå olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå mainittu mikro-organismi on hiiva.

9. Minkå tahansa edellå olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå mainittu seerumin albu-miini on ihmisseerumin albumiini. Patentkravet