KR20000048181A - 글리코실화된 단백질과 비글리코실화된 단백질을 분리하는방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 매트릭스상에 고정시킨 트리아진 염료를 글리코실화된 단백질과 비글리코실화된 단백질의 혼합물과 함께 항온처리하는 단계;

(b) 매트릭스를 세척하여 결합하지 않은 단백질을 제거시키는 단계; 및

(c) 이온 세기 또는 pH를 단계적 또는 연속적으로 증가시켜 단백질을 용출시키는 단계를 포함하고, 이때 비글리코실화된 단백질 및 증가된 글리코실화도를 갖는 단백질이 수득된 용출물 분획에서 서로 별도로 수집되는, 글리코실화된 단백질 과 비글리코실화된 단백질의 부분적 또는 완전한 분리 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 사용함으로써, 예를들어 글리코사이드 결합을 포함하지 않는 효모 세포에서 발현되는 사람 알부민을 제조할 수 있다.

Description

글리코실화된 단백질과 비글리코실화된 단백질을 분리하는 방법{Process for the separation of glycosylated and non-glycosylated proteins}

본 발명은 글리코실화된 단백질과 비-글리코실화된 단백질을 크로마토그래피로 분리하는 방법에 관한 것이다.

세포내에서 진행되는 단백질의 글리코실화는 세포 활성화 과정에서 중요한 역할을 담당할 수 있는 단백질의 안정화 및 세포 수용체에의 결합을 위해 생리학적으로 기여한다는 것이 공지되어 있다. 또한, 단백질의 비효소적 글리코실화는 예를 들어 진성 당뇨병의 경우에서 관찰되는 바와 같이 세포외에서 발생할 수 있다. 글리코실화된 알부민의 수치 상승이 종종 당뇨병 환자의 혈장에서 검출된다.

글리코실화는 재조합 단백질에서 특정한 역할을 담당한다. 따라서, 예를 들어 사람 단백질의 아미노산 서열과 완전히 동일한 효모 세포에서 제조된 단백질은 적절한 글리코실화 부위가 존재하는 경우에 원칙적으로 뚜렷하게 상이한 글리코실화 패턴을 갖는다. 이것은 예를 들어 혈장에서 재조합 단백질 반감기의 변형, 또는 단백질의 반복 투여에 따라 알레르기성 반응을 유발할 수 있는 항체의 형성을 유도한다.

재조합 단백질의 발현에 있어서는, 단백질로부터 검출 및 제거되어야 하는 일부의 단백질만이 글리코실화되는 것으로 통상 관찰된다. 그러나, 글리코실화된 단백질 변이체는 제거되어야 하는 비글리코실화된 단백질과는 달리 바람직한 생성물인 경우도 있다.

비글리코실화된 단백질 변이체로부터 글리코실화된 단백질의 분리는 종종 크로마토그래피 또는 침전과 같은 통상적인 방법을 사용하여 매우 어렵게 달성될 수 있다. N- 또는 O-글리코사이드에 의해 아미노산에 결합된 당은 종종 단백질의 물리화학적 특성(예: 등전점)을 단지 약간만 변화시켜 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피에 거의 도움을 주지 않는다. 그러나, 독일 특허원 제198 56 433.3호에는 특정한 당 구조를 인지하는 고정화 렉틴이 당단백질의 분리에 도움을 줄 수 있고 특정한 시험계에서 흡착제 또는 검출제로서 사용될 수 있음이 기술되어 있다. 그러나, 방출된 렉틴에 기인하여, 매트릭스의 출액("bleeding") 위험이 언제나 존재함으로써 생물학적 시험물(예: 세포 배양물)에서 상당한 간섭이 발생할 수 있다. 렉틴은 면역 반응을 유발할 수 있기 때문에, 사람에서 사용될 수 있는 의약 제조시의 사용은 권장되지 않는다.

본 발명에 이르러, (a) 매트릭스상에 고정시킨 트리아진 염료를 글리코실화된 단백질과 비글리코실화된 단백질의 혼합물과 함께 항온처리하는 단계;

(b) 매트릭스를 세척하여 결합하지 않은 단백질을 제거시키는 단계; 및

(c) 이온 세기 또는 pH를 단계적 또는 연속적으로 증가시키거나, 글리코실화된 단백질 또는 비글리코실화된 단백질이 비결합된 매트릭스에 통과되어 결합된 각 단백질이 용출되도록 선택된 조건에 의해 단백질을 용출시키는 단계를 포함하고, 이때 비글리코실화된 단백질 및 증가된 글리코실화도를 갖는 단백질이 수득된 용출물 분획에서 서로 별도로 수집되는, 글리코실화된 단백질과 비글리코실화된 단백질의 크로마토그래피에 의한 부분적 또는 완전한 분리 방법을 발견하였다.

도 1은 본 발명의 방법으로 용출된 분획의 크로마토그램이다.

사실, 트리아진 부류의 염료를 사용하여 혼합물로부터 단백질을 분리하는 것은 이미 알려져 있다(1). 또한, 이들은 알부민과 같은 혈장 단백질 또는 효모 추출물로부터 수득된 특정한 효모 단백질을 포함한다. 그러나, 단백질의 글리코실화된 성분과 비글리코실화된 성분을 분리하는 방법은 신규하고 놀라운 것이다. 예를 들면, 효모 또는 다른 진핵 세포에서 발현된 알부민은 부분적으로 글리코실화되기 때문에, 비글리코실화된 알부민으로부터 글리코실화된 알부민을 분리하는 방법을 이용하여야 한다. 더욱이, 숙주 세포 추출물에 함유된 세포 단백질이 오염물로서 수득되는 재조합 단백질의 제조에 있어서, 이의 글리코실화된 성분을 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제거할 수 있다. 따라서, 효모 단백질의 경우에는 특히 어느 정도 복잡한 만노즈 구조를 종종 갖는 글리코실화된 단백질이 저농도에서도 사람에서 면역원성 작용을 가질 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 사람에 사용하기 위한 단백질로부터 글리코실화된 단백질을 적절히 제거하는 것이 요구된다.

본 발명에 따라 사용되는 트리아진 염료는 특히 시바크론(Cibacron) 또는 프로시온(Procion) 염료로 이루어진 그룹중에서 선택된 화합물이다. 트리아진 염료를 지지체 물질(예: 아가로즈, 가교결합되거나 비-가교결합된 덱스트란, 폴리아크릴아미드 또는 셀룰로즈)에 공유 커플링시키는 방법은 본 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다(2, 3, 4). 커플링 방법은 통상적으로 복잡하지 않고, 신속하며, 어떠한 독성 화학물질도 포함하지 않는다. 트리아진 염료의 특징은 화학적 안정성이 높기 때문에, 적절한 매트릭스를 사용할 수 있고 장시간 동안 저장할 수 있다는 것이다. 또한, 이러한 유형의 염료 매트릭스는 단백질분해 활성 및 다른 강력한 간섭 효과에 대한 고도의 안정성을 나타낸다. 더욱이, 언급된 물질은 비교적 값이 싸다.

본 발명에 따른 방법에서는, 하나 이상의 단백질의 글리코실화된 변이체와 비글리코실화된 변이체를 함유하는 하나 이상의 단백질 혼합물을 트리아진 염료 매트릭스와 접촉시키고, 매트릭스를 세척한 다음 단백질을 용출시킨다. 용출에는 염 농도를 증가시킨 구배가 사용된다. 또한, pH 구배의 감소 또는 증가가 연속적 또는 단계적 용출에 적합하다. 이러한 과정에 있어서, 단백질을 이들의 글리코실화된 성분으로부터 분리하여 분별시킨다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 양태에 있어서는 알부민을 3.5 내지 10 범위의 pH에서 염료 매트릭스와 접촉시키고, 세척하며, 염 농도를 증가시키거나 pH 구배를 증가시켜 단계적 또는 연속적으로 용출시킨다. 또한, 각각의 글리코실화된 단백질 또는 비글리코실화된 단백질을 비결합된 매트릭스를 통해 유동시키는 조건을 선택할 수 있는데, 이는 당해 상황에 따른 각각의 경우에서 결정될 수 있고 예를 들어 pH에 의해 영향을 받을 수 있다. 알부민을 바람직하게는 6 내지 10의 pH 범위에서 특히 바람직하게는 인산염 완충액에서 "Reactive Green 5^R"로서 공지된 고정화된 염료와 접촉시키는 방법이 특히 바람직하다. 매트릭스를 세척한 후, 염 농도를 증가시켜 글리코실화된 단백질을 포함하지 않는 알부민을 용출시킨다. 이어서, 이온 세기를 추가로 증가시켜 글리코실화된 단백질을 회수할 수 있다.

3.5 내지 6.5의 pH 범위에서 알부민 용액과 접촉시키는데에는 "Reactive Yellow 3"을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 글리코실화된 알부민과 비글리코실화된 알부민의 개별적인 용출은 이온 세기 및/또는 pH를 증가시켜 수행할 수 있다.

또한, 에틸렌 글리콜 또는 뉴클레오타이드와 같은 첨가제를 용출에 사용할 수 있다. 또한, 시바크론 블루(Cibacron Blue^R)과 같은 다른 염료 매트릭스를 사용할 수도 있다. 본 발명은 하기 실시예에 의해 설명된다.

실시예

특정한 발효 조건하에, 소량의 만노실화된 알부민을 형질감염된 빵 효모에서 발현된 사람 알부민에 포함시킬 수 있다. 이것을 독일 특허원 제198 56 433.3호에 기술된 바와 같이 정량할 수 있다. 이 방법에 있어서는 렉틴 콘카나발린 A를 미세 플레이트상에 고정시키고, 만노즈를 포함하는 글리코실화된 분자의 스캐빈저로서 사용한다. 비결합된, 비글리코실화된 알부민은 세척에 의해 회수하고, 결합된 알부민은 표지된 모노클로날 항체 단편에 의해 측정한다. 표준 곡선을 정량화에 사용한다.

이러한 방식으로 제조된 샘플을 겔 여과에 의해 20mM Na₂HPO₄(pH 7.0)의 용액으로 제조하고, 이어서 알부민 70mg을 "Reactive Green 5^R" 아가로즈 컬럼(Sigma; 직경 1.6cm, 높이 10cm)에 적용시킨다. 컬럼을 상술된 완충액으로 세척한 후, NaCl 구배(0.1M; 구배 0.2%/ml)를 적용하고, 각각 7.5ml의 분획을 수집한다. 각 샘플중의 알부민 농도는 피크 면적을 적분하여 표준 곡선상의 함량을 판독함으로써 SEC-HPLC에 의해 정량한다. 글리코실화된 알부민의 함량은 상기 기재된 바와 같이 측정한다. 전체 단백질에 대한 글리코실화된 단백질의 비율은 %로 표시된다.

상기 결과는 도 1로서 부착된 크로마토그램으로부터 확인할 수 있다. 이것은 280nm에서의 흡광 과정, 즉 특히 광도계를 통과하는 단백질의 흡광 과정을 나타낸다. 또한, 연속적인 염 구배를 이온 세기의 측정에 의해 기록한다. 분획에서 검출할 수 있는 알부민의 글리코실화된 알부민의 계산된 비율(점선)을 후속적으로 기록한다. 분획 13 내지 22는 출발 물질(0.52%)와 비교하여 현저히 감소된 함량의 글리코실화된 단백질을 함유한다는 것을 명백히 볼 수 있다. 한편, 명백히 증가된 함량의 글리코실화된 알부민은 분획 30(약 0.8%) 및 분획 50 내지 53(1.34%)의 풀(pool)에서 발견되었다.

결국, 글리코실화된 알부민과 비글리코실화된 알부민의 명백한 분리 효과가 관찰되었으며, 이는 예를 들어 더욱 편평한 염 구배를 적용시켜 추가로 최적화시킬 수 있다.

참고 목록

(1) Dean P.D.G., Watson D.H., J. Chromatogr. 1979; 165: 302-319;

(2) Lowe C.R. et al., Int. J. Biochem. 1981; 13: 33-40;

(3) Atkinson T. et al., Biochem. Soc. Trans., 1981; 9: 290-293;

(4) Easterday R.L. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 1974; 42: 123-133.

본 발명의 방법을 사용함으로써, 글리코사이드 결합을 포함하지 않는 효모 세포에서 발현되는 사람 알부민을 제조할 수 있다.

Claims (7)

1. (a) 매트릭스상에 고정시킨 트리아진 염료를 글리코실화된 단백질과 비글리코실화된 단백질의 혼합물과 함께 항온처리하는 단계;

   (b) 매트릭스를 세척하여 결합하지 않은 단백질을 제거시키는 단계; 및

   (c) 이온 세기 또는 pH를 단계적 또는 연속적으로 증가시켜 단백질을 용출시키는 단계를 포함하고, 이때 비글리코실화된 단백질 및 증가된 글리코실화도를 갖는 단백질이 수득된 용출물 분획에서 서로 별도로 수집되는, 글리코실화된 단백질 과 비글리코실화된 단백질의 부분적 또는 완전한 분리 방법.
2. 제1항에 있어서, 매트릭스가 아가로즈, 가교결합되거나 비가교결합된 덱스트란, 폴리아크릴아미드 또는 셀룰로즈로 이루어지는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시바크론(Cibacron) 또는 프로시온(Procion) 염료로 이루어진 그룹중에서 선택된 화합물이 트리아진 염료로서 사용되는 방법.
4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 단백질 혼합물이 3.5 내지 10의 pH에서 트리아진 염료 매트릭스와 함께 항온처리되는 방법.
5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 글리코사이드 결합을 함유하는 단백질을 제거시킨 단백질.
6. 제5항에 있어서, 진핵 세포 또는 유전자전이(transgenic) 미생물에서 재조합에 의해 제조된 단백질.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 효모 세포에서 발현된 사람 알부민인 단백질.