ES2276502T3 - Proceso para la separacion de proteinas glicolisadas y no glicolisadas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la separación parcial o total de proteínas glicolisadas y proteínas no glicolisadas, caracterizado porque a) un colorante de triacina inmovilizado en una matriz es incubado con una mezcla de proteínas glicolisadas y proteínas no glicolisadas; b) la matriz es lixiviada para separar las proteínas no enlazadas y c) las proteínas son eludidas mediante el incremento gradual o continuo de la fuerza iónica o del valor del pH. con lo cual, en las fracciones de elusión resultantes se puedan colectar por separado proteínas no glicolisadas y proteínas con un creciente grado de glicólisis.
Description
Proceso para la separación de proteínas
glicolisadas y no glicolisadas.
El objeto de la invención es un procedimiento
para la separación cromatográfica de proteínas glicolisadas y no
glicolisadas.
Se conoce que desde el punto de vista
fisiológico, la glicólisis intracelular de las proteínas sirve para
estabilizar las proteínas y su enlace con los receptores celulares,
los cuales pueden desempañar un papel en los procesos de activación
celular. La glicólisis no enzimática de las proteínas también puede
realizarse de forma extracelular, tal y como se observa en la
diabetes mellitus. Con frecuencia en el plasma de los pacientes
diabéticos aparecen altos valores de albúmina glicolisada.
Las glicólisis por proteínas recombinantes
desempeñan un papel especial. Así tenemos, por ejemplo, que una
proteína sintetizada en células de levadura, cuya secuencia de
aminoácidos se asemeja completamente a la de la proteína humana,
tiene por lo general un modelo de glicólisis claramente diferente si
existen los correspondientes sitios de glicólisis. Esto puede dar
lugar a que la proteína recombinante tenga una vida biológica media
variada, por ejemplo en el plasma, o a que se formen anticuerpos
que podrían provocar reacciones alérgicas si se repitiera la dosis
de proteína.
En la expresión de proteínas recombinantes no es
raro observar que sólo se glicolisa una parte de la proteína, que
tiene que ser detectada y separada de la proteína. Sin embargo,
también pueden existir casos en los que la variante glicolisada de
la proteína sea el producto preferido, del cual se debe separar la
proteína no glicolisada.
Con los métodos convencionales, tales como la
cromatografía o la precipitación, resulta muy difícil separar la
variante glicolisada de una proteína de la no glicolisada. El azúcar
N-glicosídica u O-glicosídica que
está enlazada a los aminoácidos a menudo solo transforma un poco las
propiedades físico-químicas de la proteína, tales
como el punto isoeléctrico, por lo que, por ejemplo, la
cromatografía de intercambio iónico resulta de poca ayuda. En la
solicitud de patente alemana 198 56 433.3 ya se ha descrito que las
lectinas inmovilizadas, que reconocen las estructuras del azúcar,
pueden ser de mucha ayuda en la separación de las glicoproteínas y
pueden ser empleadas como adsorbentes o reactivos detectores en
determinados sistemas de prueba. Sin embargo, siempre se corre el
riesgo de "sangramiento" de la matriz, en el que pueden surgir
muchos inconvenientes debido a la lectina liberada por ejemplo en
las pruebas biológicas, tales como los cultivos de células. Como las
lectinas pueden provocar una inmunorreacción no se recomienda su
empleo en la fabricación de medicamentos para uso humano.
Ahora se ha encontrado un método para la
separación cromatográfica parcial o total de las proteínas
glicolisadas y no glicolisadas, mediante el cual
- a)
- un colorante de triacina inmovilizado en una matriz se incuba con una mezcla de proteínas glicolisadas y proteínas no glicolisadas;
- b)
- se lixivia la matriz para separar las proteínas no enlazadas y
- c)
- se realiza la elusión de las proteínas mediante el incremento gradual o continuo de la fuerza iónica o del valor del pH, o se escogen las condiciones de forma tal que la proteína glicolisada o no glicolisada transiten sin enlace por la matriz y se realice la elusión de la correspondiente proteína enlazada.
en el que en las fracciones de
elusión resultantes se puedan colectar por separado proteínas no
glicolisadas y proteínas con un creciente grado de
glicólisis.
Ya es conocido, que los colorantes de la serie
triacina pueden emplearse para separar las proteínas obtenidas a
partir de mezclas (1). Entre estas proteínas se encuentran también
las proteínas plasmáticas tales como la albúmina o las proteínas
especiales de levadura obtenidas a partir de extractos de levadura.
Sin embargo, un procedimiento para separar los componentes
glicolisados y los componentes no glicolisados de una proteína, es
nuevo y sorprendente. Por ejemplo, como la albúmina extraída en la
levadura o en otras células eucariotas está parcialmente
glicolisada, es necesario disponer de un procedimiento para separar
la albúmina glicolisada de la no glicolisada. A esto hay que
agregar también, al obtener proteínas recombinantes, las proteínas
celulares contenidas en el extracto de la célula hospedera como
impurezas, cuyos componentes glicolisados también pueden separarse
empleando procedimientos acordes con la invención. En el caso de las
proteínas de levadura se conoce que especialmente las proteínas
glicolisadas, la cuales a menudo muestran estructuras de manosa más
o menos complejas, ya pueden tener, en pequeñas concentraciones, un
efecto inmunogenético para el ser humano. También es necesario
separar adecuadamente las proteínas glicolisadas de las proteínas
previstas para el uso en humanos.
En el caso de los colorantes de triacina a ser
empleados de acuerdo con la invención se trata fundamentalmente de
enlaces del grupo de los colorantes Cibacron y Procion. El
especialista también conoce los métodos para el acoplamiento
covalente de los colorantes de triacina a materiales portadores como
agarosa, dextrana reticulada y no reticulada, poliacrilamida o
celulosa (2, 3, 4). La mayoría de las veces, los procedimientos de
acoplamiento son rápidos, poco complicados, y no incluyen productos
químicos tóxicos. Los colorantes de triacina se caracterizan por
tener una elevada estabilidad química, de modo que las matrices
correspondientes pueden ser utilizadas y almacenadas durante un
largo período. Tales matrices de colorantes muestran gran
estabilidad incluso ante actividades proteolíticas y otras
influencias negativas potenciales. Además, las sustancias
mencionadas resultan comparativamente más rentables.
En el procedimiento de acuerdo con la invención,
las mezcla de una o varias proteínas que contiene variantes
glicolisadas y no glicolisadas de una o varias proteínas se pone en
contacto con una matriz de colorante de triacina, se lava la matriz
y luego se eluyen las proteínas. Para realizar la elusión se emplean
gradientes de concentraciones ascendentes de sal. Los gradientes de
pH, ascendentes o descendentes, también son adecuados para la
elusión continua o gradual. Para ello, las proteínas son separadas
de sus componentes glicolisados y se fraccionan.
En una realización preferida del procedimiento
de acuerdo con la invención, albúmina con un valor de pH de 3.5 a
10 se pone en contacto con una matriz de colorante, se lava y se
eluye de manera gradual o continua por medio de gradientes de
concentraciones ascendentes de sal o gradientes de pH ascendente.
También se pueden escoger condiciones que permitan que la
correspondiente proteína glicolisada y/o no glicolisada transite
por la matriz sin enlazarse, lo que en cada caso particular puede
decidirse según las circunstancias y, por ejemplo, puede ser
influido por el pH. Se prefiere sobre todo un procedimiento en el
cual la albúmina entra en contacto con un colorante inmovilizado
conocido como "Reactive Green 5®", preferiblemente con un valor
de pH de 6 a 10, preferiblemente con un tampón de fosfato. Después
de lavar la matriz, se eluye la albúmina liberada por la proteína
glicolisada aumentando la concentración de sal. La proteína
glicolisada puede obtenerse entonces volviendo a incrementar la
fuerza iónica.
También se prefiere particularmente el empleo de
"Reactive Yellow 3®" que preferiblemente se pondrá en contacto
con una solución de albúmina con un valor de pH de 3.5 a 6.5. Aquí
también puede lograr la elusión separada de las albúminas
glicolisadas y no glicolisadas aumentando la fuerza iónica y/o el
valor del pH.
Además, para realizar la elusión se pueden
emplear aditivos tales como etilenglicol o nucleótidos. También
pueden emplearse otras matrices de colorantes como Cibacron Blue®.
La invención será explicada a partir del siguiente ejemplo.
Ejemplo
En exprimidos de levadura panadera transferida,
la albúmina humana puede tener, en determinadas condiciones de
fermentación, un pobre contenido de albúmina con sal de manosa. Esta
se puede cuantificar como se describe en la solicitud de patente
alemana 198 58433.3. Para ello, la lectina Concanavalina A se
inmoviliza en una placa de microtítulo y sirve como colector de las
moléculas glicolisadas portadoras de la manosa. La albúmina no
glicolisada ni enlazada es separada mediante lavado, y se determina
la albúmina enlazada a través de un fragmento de anticuerpo
monoclonal marcado. Para la cuantificación sirve una curva
estándar.
Una muestra así obtenida se colocó mediante
filtración de gel en una solución de 20 mM de Na_{2}HPO_{2},
con pH 7.0 y a continuación se añadieron 70 mg de albúmina en una
columna de agarosa con "Reactive Green 5®" (de la firma Sigma;
diámetro: 1.6 cm; altura: 10 cm). Después de lavar la columna con la
solución tampón antes mencionada se aplicó un gradiente de NaCl
(0.1 M; elevación: 0.2%/ml) y se colectaron fracciones de 7.5 ml
cada una. La concentración de albúmina de cada muestra se cuantificó
mediante SEC-HPLC, en el que se integraron las
superficies de picos y el contenido se leyó en una curva estándar.
Los contenidos de albúmina glicolisada se determinaron de la forma
descrita anteriormente. La relación entre la proteína glicolisada y
el total de proteína fue expresada en porcentaje.
El resultado se puede ver en el cromatograma que
aparece como Figura 1. El mismo muestra el desarrollo de la
absorción a 280 nm, o sea, sobre todo la proteína que pasa por el
fotómetro. Al mismo tiempo, midiendo la fuerza iónica se documenta
el gradiente de sal continuo. Posteriormente se registró el
porcentaje calculado para la albúmina glicolisada en la albúmina
determinada en la fracción (línea discontinua). Se ve claramente,
que las fracciones desde la 13 hasta la 22 tenían una cantidad de
proteína glicolisada significativamente inferior que la que
mostraba el material de partida (0.52%). Por el contrario, en la
fracción 30 (aproximadamente 0.8%) y en el grupo de las fracciones
desde la 50 hasta la 53 (1.34%) el contenido de albúmina glicolisada
era evidentemente más elevado.
En conjunto se aprecia un claro efecto de
separación entre la albúmina glicolisada y la albúmina no
glicolisada. Esto se puede seguir optimizando si se emplea, por
ejemplo, un gradiente de sal lineal.
(1) Dean P.D.G., Watson D.H.,
J. Chromatogr. 1979; 165:302-319;
(2) Lowe C.R. y otros, Int. J.
Biochem. 1981, 13: 33-40;
(3) Atkinson J. y otros, Biochem. Soc.
Trans. 1981; 9: 290-292;
(4) Easterday R. I., y otros, Adv.
Exp. Med. Biol. 1974; 42: 123-133.
Claims (6)
1. Procedimiento para la separación parcial o
total de proteínas glicolisadas y proteínas no glicolisadas,
caracterizado porque
- a)
- un colorante de triacina inmovilizado en una matriz es incubado con una mezcla de proteínas glicolisadas y proteínas no glicolisadas;
- b)
- la matriz es lixiviada para separar las proteínas no enlazadas y
- c)
- las proteínas son eludidas mediante el incremento gradual o continuo de la fuerza iónica o del valor del pH.
con lo cual, en las fracciones de
elusión resultantes se puedan colectar por separado proteínas no
glicolisadas y proteínas con un creciente grado de
glicólisis.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la matriz consiste en
agarosa, dextrana reticulada o no reticulada, poliacrilamida o
celulosa.
3. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque se emplean
compuestos del grupo de los colorantes Cibacron o Procion como
colorantes de triacina.
4. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a la 3 caracterizado porque la mezcla de
proteínas es incubada con la matriz de colorante de triacina con
valores de pH de 3.5 a 10.
5. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a la 4, caracterizado porque la mezcla de
proteínas glicolisadas y proteínas no glicolisadas se produce de
modo recombinante en células eucariotas o en microorganismos
transgénicos.
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, caracterizado porque la mezcla de proteínas
glicolisadas y proteínas no glicolisadas es una mezcla de albúmina
glicolisada y albúmina no glicolisada, obtenida a partir de células
de levadura.
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