JP2000178298A - グリコシル化および非グリコシル化タンパク質の分離法 - Google Patents
グリコシル化および非グリコシル化タンパク質の分離法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 グリコシル化および非グリコシル化タンパク
質の分離法。 【解決手段】 グリコシル化および非グリコシル化タン
パク質を部分的または完全に分離する方法を記載し、こ
れは ａ) 基質に固定化したトリアジン色素をグリコシル化お
よび非グリコシル化タンパク質の混合物とインキュベー
トし、 ｂ) 次に基質を洗浄して、未結合のタンパク質を除去
し、そして ｃ) イオン強度もしくはｐＨを段階的もしくは連続的に
増加させることによって、タンパク質を溶出させ、得ら
れた溶出画分において、非グリコシル化タンパク質およ
びグリコシル化の度合いが増加しているタンパク質を互
いに別々に収集する方法である。本発明の方法を使用す
ることによって、例えばグリコシド結合を含まず、酵母
細胞で発現させたヒトアルブミンを調製することができ
る。
質の分離法。 【解決手段】 グリコシル化および非グリコシル化タン
パク質を部分的または完全に分離する方法を記載し、こ
れは ａ) 基質に固定化したトリアジン色素をグリコシル化お
よび非グリコシル化タンパク質の混合物とインキュベー
トし、 ｂ) 次に基質を洗浄して、未結合のタンパク質を除去
し、そして ｃ) イオン強度もしくはｐＨを段階的もしくは連続的に
増加させることによって、タンパク質を溶出させ、得ら
れた溶出画分において、非グリコシル化タンパク質およ
びグリコシル化の度合いが増加しているタンパク質を互
いに別々に収集する方法である。本発明の方法を使用す
ることによって、例えばグリコシド結合を含まず、酵母
細胞で発現させたヒトアルブミンを調製することができ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、グリコシル化およ
び非グリコシル化タンパク質のクロマトグラフィー分離
法に関する。
び非グリコシル化タンパク質のクロマトグラフィー分離
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞内にて生じるタンパク質のグリコシ
ル化は、タンパク質の安定化およびそれらの細胞受容体
への結合に生理的に作用し、細胞活性化過程において役
割を果たし得ることが知られている。タンパク質の非酵
素的グリコシル化は細胞外でも起こりうるものであり、
そのようなものは例えば糖尿病の場合において観察され
る。高い値のグリコシル化アルブミンは、糖尿病の患者
の血漿中においてしばしば検出される。グリコシル化
は、組換えタンパク質において特別な役目を果たす。従
って、例えばヒトのタンパク質のアミノ酸配列と完全に
一致する酵母細胞中で調製されるタンパク質は、適当な
グリコシル化部位を有する場合には、概して顕著に異な
るグリコシル化パターンを有する。これは、例えば血漿
中において、組換えタンパク質の半減期の変更を導きう
るものであり、タンパク質の連続投与においてアレルギ
ー反応を引き起こす可能性がある。組換えタンパク質の
発現において、タンパク質の一部のみグリコシル化され
ることが観察されるのは特別なことではなく、これは検
出され、そしてタンパク質から除去されなければならな
い。しかし、タンパク質のグリコシル化変異体が好まし
い産物である場合もありうることであり、これから非グ
リコシル化タンパク質を除去するべきである。
ル化は、タンパク質の安定化およびそれらの細胞受容体
への結合に生理的に作用し、細胞活性化過程において役
割を果たし得ることが知られている。タンパク質の非酵
素的グリコシル化は細胞外でも起こりうるものであり、
そのようなものは例えば糖尿病の場合において観察され
る。高い値のグリコシル化アルブミンは、糖尿病の患者
の血漿中においてしばしば検出される。グリコシル化
は、組換えタンパク質において特別な役目を果たす。従
って、例えばヒトのタンパク質のアミノ酸配列と完全に
一致する酵母細胞中で調製されるタンパク質は、適当な
グリコシル化部位を有する場合には、概して顕著に異な
るグリコシル化パターンを有する。これは、例えば血漿
中において、組換えタンパク質の半減期の変更を導きう
るものであり、タンパク質の連続投与においてアレルギ
ー反応を引き起こす可能性がある。組換えタンパク質の
発現において、タンパク質の一部のみグリコシル化され
ることが観察されるのは特別なことではなく、これは検
出され、そしてタンパク質から除去されなければならな
い。しかし、タンパク質のグリコシル化変異体が好まし
い産物である場合もありうることであり、これから非グ
リコシル化タンパク質を除去するべきである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】タンパク質の非グリコ
シル化変異体からグリコシル化変異体を分離すること
は、クロマトグラフィーまたは沈殿法など慣用の方法を
用いて達成するのはしばしば非常に困難であり得る。ア
ミノ酸にＮ−またはＯ−グリコシル化結合した糖は、し
ばしば等電点などのタンパク質の物理化学的特性をごく
わずかに変化させるだけであり、例えばイオン交換クロ
マトグラフィーはほとんど役に立たない。しかし、ドイ
ツ国特許出願第１９８５６４３３.３号には、特異的糖
構造を認識する固定化したレクチンが糖タンパク質の分
離に有用であり、特定の試験系において吸着または検出
試薬として用いることができると記載されている。しか
し、基質のにじみ出しの危険性がたえずあり、その結果
として放出されたレクチンが原因で、顕著な干渉が例え
ば細胞培養におけるような生物試験において生じうる。
レクチンが免疫反応を引き起こすため、ヒトにおいて使
用することができる薬剤の製造にこれらを用いることは
提案されていない。
シル化変異体からグリコシル化変異体を分離すること
は、クロマトグラフィーまたは沈殿法など慣用の方法を
用いて達成するのはしばしば非常に困難であり得る。ア
ミノ酸にＮ−またはＯ−グリコシル化結合した糖は、し
ばしば等電点などのタンパク質の物理化学的特性をごく
わずかに変化させるだけであり、例えばイオン交換クロ
マトグラフィーはほとんど役に立たない。しかし、ドイ
ツ国特許出願第１９８５６４３３.３号には、特異的糖
構造を認識する固定化したレクチンが糖タンパク質の分
離に有用であり、特定の試験系において吸着または検出
試薬として用いることができると記載されている。しか
し、基質のにじみ出しの危険性がたえずあり、その結果
として放出されたレクチンが原因で、顕著な干渉が例え
ば細胞培養におけるような生物試験において生じうる。
レクチンが免疫反応を引き起こすため、ヒトにおいて使
用することができる薬剤の製造にこれらを用いることは
提案されていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】グリコシル化および非グ
リコシル化タンパク質を部分的または完全にクロマトグ
ラフィー分離する方法を見出し、これは ａ) 基質（matrix）に固定化したトリアジン色素をグリ
コシル化および非グリコシル化タンパク質の混合物とイ
ンキュベートし、 ｂ) 次に基質を洗浄して、未結合のタンパク質を除去
し、そして ｃ) イオン強度もしくはｐＨを段階的もしくは連続的に
増加させることによって、またはグリコシル化もしくは
非グリコシル化タンパク質が結合していない基質中を通
し、対応する結合タンパク質が溶出されるような条件を
選択することによってタンパク質を溶出させ、得られた
溶出画分において、非グリコシル化タンパク質およびグ
リコシル化の度合いが増加しているタンパク質を互いに
別々に収集する方法である。
リコシル化タンパク質を部分的または完全にクロマトグ
ラフィー分離する方法を見出し、これは ａ) 基質（matrix）に固定化したトリアジン色素をグリ
コシル化および非グリコシル化タンパク質の混合物とイ
ンキュベートし、 ｂ) 次に基質を洗浄して、未結合のタンパク質を除去
し、そして ｃ) イオン強度もしくはｐＨを段階的もしくは連続的に
増加させることによって、またはグリコシル化もしくは
非グリコシル化タンパク質が結合していない基質中を通
し、対応する結合タンパク質が溶出されるような条件を
選択することによってタンパク質を溶出させ、得られた
溶出画分において、非グリコシル化タンパク質およびグ
リコシル化の度合いが増加しているタンパク質を互いに
別々に収集する方法である。
【０００５】事実、一連のトリアジン色素を混合物から
タンパク質を分離するのに使用できることは既に知られ
ている(1)。これらはまた、アルブミンのような血漿タ
ンパク質または酵母抽出物から得られる特異的酵母タン
パク質を包含する。しかし、タンパク質のグリコシル化
および非グリコシル化成分を分離する方法は新規であ
り、驚くべきものである。例えば、酵母または他の真核
細胞において発現したアルブミンは部分的にグリコシル
化されているため、非グリコシル化アルブミンからグリ
コシル化アルブミンを分離する方法を利用可能にする必
要性がある。更に、組換えタンパク質の製造において、
宿主細胞抽出物に含まれる細胞タンパク質もまた汚染物
として得られるが、そのグリコシル化成分も同様に本発
明による方法を用いて除去することができる。故に、酵
母タンパク質の場合には、グリコシル化タンパク質、特
にしばしばより大きいかまたはより小さい程度で複合す
るマンノース構造を有するものは、低濃度でもヒトにお
いて免疫原効果を有していることが知られている。従っ
て、ヒトに使用されることを意図するタンパク質からグ
リコシル化タンパク質を十分に除去することが必要であ
る。
タンパク質を分離するのに使用できることは既に知られ
ている(1)。これらはまた、アルブミンのような血漿タ
ンパク質または酵母抽出物から得られる特異的酵母タン
パク質を包含する。しかし、タンパク質のグリコシル化
および非グリコシル化成分を分離する方法は新規であ
り、驚くべきものである。例えば、酵母または他の真核
細胞において発現したアルブミンは部分的にグリコシル
化されているため、非グリコシル化アルブミンからグリ
コシル化アルブミンを分離する方法を利用可能にする必
要性がある。更に、組換えタンパク質の製造において、
宿主細胞抽出物に含まれる細胞タンパク質もまた汚染物
として得られるが、そのグリコシル化成分も同様に本発
明による方法を用いて除去することができる。故に、酵
母タンパク質の場合には、グリコシル化タンパク質、特
にしばしばより大きいかまたはより小さい程度で複合す
るマンノース構造を有するものは、低濃度でもヒトにお
いて免疫原効果を有していることが知られている。従っ
て、ヒトに使用されることを意図するタンパク質からグ
リコシル化タンパク質を十分に除去することが必要であ
る。
【０００６】本発明に従って使用されるべきトリアジン
色素は、特にシバクロンおよびプロシオン色素よりなる
群からの化合物である。トリアジン色素を、アガロー
ス、架橋もしくは非架橋デキストラン、ポリアクリルア
ミドまたはセルロースのような担体基質に共有カップリ
ングさせる方法もまた当業者に公知である(2,3,4)。カ
ップリング方法は普通、単純で、迅速、且つ毒性化学物
質を全く包含しない。トリアジン色素は高い化学的安定
性によって特徴付けられ、適切な基質に使用されて、長
期保存することができる。このタイプの色素基質は、タ
ンパク質分解活性および他の潜在的干渉作用に対して高
い安定性を示す。更に、上述の物質は比較的安価であ
る。
色素は、特にシバクロンおよびプロシオン色素よりなる
群からの化合物である。トリアジン色素を、アガロー
ス、架橋もしくは非架橋デキストラン、ポリアクリルア
ミドまたはセルロースのような担体基質に共有カップリ
ングさせる方法もまた当業者に公知である(2,3,4)。カ
ップリング方法は普通、単純で、迅速、且つ毒性化学物
質を全く包含しない。トリアジン色素は高い化学的安定
性によって特徴付けられ、適切な基質に使用されて、長
期保存することができる。このタイプの色素基質は、タ
ンパク質分解活性および他の潜在的干渉作用に対して高
い安定性を示す。更に、上述の物質は比較的安価であ
る。
【０００７】本発明による方法において、１つまたはそ
れ以上のタンパク質のグリコシル化および非グリコシル
化変異体を含有する、１つまたはそれ以上のタンパク質
の混合物をトリアジン色素基質と接触させ、基質を洗浄
し、次いでタンパク質を溶出させる。増加する塩濃度の
勾配を溶出に用いる。低下または上昇するｐＨ勾配もま
た連続的または段階的溶出に適する。この過程におい
て、タンパク質は、そのグリコシル化成分から分離され
て、そして分画される。
れ以上のタンパク質のグリコシル化および非グリコシル
化変異体を含有する、１つまたはそれ以上のタンパク質
の混合物をトリアジン色素基質と接触させ、基質を洗浄
し、次いでタンパク質を溶出させる。増加する塩濃度の
勾配を溶出に用いる。低下または上昇するｐＨ勾配もま
た連続的または段階的溶出に適する。この過程におい
て、タンパク質は、そのグリコシル化成分から分離され
て、そして分画される。
【０００８】本発明による方法の好ましい態様におい
て、アルブミンをｐＨ３.５〜１０の範囲で色素基質と
接触させ、洗浄し、そして塩濃度を増加させるかまたは
ｐＨ勾配を増大させることによって段階的にまたは連続
的に溶出させる。条件は、各グリコシル化または非グリ
コシル化タンパク質が未結合の基質中を流れる条件下に
おいて選択されるが、状況に従って個々の場合において
決定され、そして例えばｐＨによって影響を受けうる。
方法は、アルブミンを、好ましくはｐＨ６〜１０の範囲
において、特に好ましくはリン酸緩衝液中で“Reactive
Green 5(R)”として知られる固定化した色素と接触さ
せるのが特に好ましい。基質を洗浄後、グリコシル化タ
ンパク質が除かれたアルブミンは、塩濃度を上昇させる
ことによって溶出される。次いでグリコシル化タンパク
質は、イオン強度を更に増加させることによって回収す
ることができる。
て、アルブミンをｐＨ３.５〜１０の範囲で色素基質と
接触させ、洗浄し、そして塩濃度を増加させるかまたは
ｐＨ勾配を増大させることによって段階的にまたは連続
的に溶出させる。条件は、各グリコシル化または非グリ
コシル化タンパク質が未結合の基質中を流れる条件下に
おいて選択されるが、状況に従って個々の場合において
決定され、そして例えばｐＨによって影響を受けうる。
方法は、アルブミンを、好ましくはｐＨ６〜１０の範囲
において、特に好ましくはリン酸緩衝液中で“Reactive
Green 5(R)”として知られる固定化した色素と接触さ
せるのが特に好ましい。基質を洗浄後、グリコシル化タ
ンパク質が除かれたアルブミンは、塩濃度を上昇させる
ことによって溶出される。次いでグリコシル化タンパク
質は、イオン強度を更に増加させることによって回収す
ることができる。
【０００９】ｐＨ３.５〜６.５の範囲においてアルブミ
ン溶液と接触させるのが好ましい“Reactive Yellow 3
(R)”の使用が特に好ましい。ここでもまた、グリコシ
ル化アルブミンと非グリコシル化アルブミンの別々の溶
出はイオン強度を増加させることおよび／またはｐＨを
上昇させることによって実施することができる。更に、
エチレングリコールまたはヌクレオチドのような添加剤
を溶出に使用することができる。シバクロン・ブルー
(R)のような他の色素基質も同様に使用することができ
る。本発明を下記の実施例によって説明する。
ン溶液と接触させるのが好ましい“Reactive Yellow 3
(R)”の使用が特に好ましい。ここでもまた、グリコシ
ル化アルブミンと非グリコシル化アルブミンの別々の溶
出はイオン強度を増加させることおよび／またはｐＨを
上昇させることによって実施することができる。更に、
エチレングリコールまたはヌクレオチドのような添加剤
を溶出に使用することができる。シバクロン・ブルー
(R)のような他の色素基質も同様に使用することができ
る。本発明を下記の実施例によって説明する。
【００１０】
【実施例】特定の発酵条件下において、トランスフェク
ションしたパン酵母において発現させたヒトアルブミン
には少量のマンノシル化アルブミンが含有されうる。こ
れはドイツ国特許出願第198 56 433.3号に記載されるよ
うに定量することができる。この方法において、レクチ
ン コンカナバリンＡは、マイクロタイタープレート上
に固定化されて、マンノースを有するグリコシル化分子
のスカベンジャーとして作用する。未結合の非グリコシ
ル化アルブミンは洗浄にって除去され、結合したアルブ
ミンを標識したモノクローナル抗体断片によって測定し
た。標準曲線を定量に用いた。
ションしたパン酵母において発現させたヒトアルブミン
には少量のマンノシル化アルブミンが含有されうる。こ
れはドイツ国特許出願第198 56 433.3号に記載されるよ
うに定量することができる。この方法において、レクチ
ン コンカナバリンＡは、マイクロタイタープレート上
に固定化されて、マンノースを有するグリコシル化分子
のスカベンジャーとして作用する。未結合の非グリコシ
ル化アルブミンは洗浄にって除去され、結合したアルブ
ミンを標識したモノクローナル抗体断片によって測定し
た。標準曲線を定量に用いた。
【００１１】この方法で調整した試料は、ゲル濾過によ
って２０mＭ Ｎａ2ＨＰＯ4，pＨ７.０の溶液中にもたら
され、７０mgのアルブミンを次いで“Reactive Green 5
(R)"アガロースカラム（Sigma；直径1.6cm，高さ10cm）
に加えた。カラムを上述の緩衝液で洗浄した後、ＮａＣ
ｌ勾配（0.1Ｍ；0.2％／mlの勾配）を適用し、各々７.
５mlの画分を収集した。各試料中のアルブミン濃度は、
ピーク面積を積分して標準曲線における量を読みとるこ
とでＳＥＣ−ＨＰＬＣによって定量した。グリコシル化
アルブミンの量を上述のように決定した。全タンパク質
に対するグリコシル化タンパク質の比率をパーセントで
表した。
って２０mＭ Ｎａ2ＨＰＯ4，pＨ７.０の溶液中にもたら
され、７０mgのアルブミンを次いで“Reactive Green 5
(R)"アガロースカラム（Sigma；直径1.6cm，高さ10cm）
に加えた。カラムを上述の緩衝液で洗浄した後、ＮａＣ
ｌ勾配（0.1Ｍ；0.2％／mlの勾配）を適用し、各々７.
５mlの画分を収集した。各試料中のアルブミン濃度は、
ピーク面積を積分して標準曲線における量を読みとるこ
とでＳＥＣ−ＨＰＬＣによって定量した。グリコシル化
アルブミンの量を上述のように決定した。全タンパク質
に対するグリコシル化タンパク質の比率をパーセントで
表した。
【００１２】結果は、図１として添付するクロマトグラ
ムから見出すことができる。これは２８０nmにおける吸
収、即ち特に光度計を通過するタンパク質の進路を示
す。また、連続的塩勾配はイオン強度を測定することに
よって記録した。画分（破線）において検出可能なアル
ブミンのグリコシル化アルブミンの算出されたパーセン
ト割合を続けて記録した。画分１３〜２２は、出発材料
（0.52％）と比較して顕著に減少したグリコシル化タン
パク質の量を含有すると理解されるのは明らかである。
他方、明らかに増加した量のグリコシル化アルブミンは
画分３０（約 0.8％）および画分５０〜５３（1.34％）
において見出された。
ムから見出すことができる。これは２８０nmにおける吸
収、即ち特に光度計を通過するタンパク質の進路を示
す。また、連続的塩勾配はイオン強度を測定することに
よって記録した。画分（破線）において検出可能なアル
ブミンのグリコシル化アルブミンの算出されたパーセン
ト割合を続けて記録した。画分１３〜２２は、出発材料
（0.52％）と比較して顕著に減少したグリコシル化タン
パク質の量を含有すると理解されるのは明らかである。
他方、明らかに増加した量のグリコシル化アルブミンは
画分３０（約 0.8％）および画分５０〜５３（1.34％）
において見出された。
【００１３】全体的に、グリコシル化アルブミンと非グ
リコシル化アルブミンの分離の明らかな効果が示されて
おり、例えばより緩やかな勾配を用いることによって更
に至適化することができる。
リコシル化アルブミンの分離の明らかな効果が示されて
おり、例えばより緩やかな勾配を用いることによって更
に至適化することができる。
【００１４】参考文献一覧： (1) Dean P.D.G., Watson D.H., J. Chromatogr. 197
9; 165: 302-319. (2) Lowe C.R. et.al., Int. J. Biochem. 1981; 13:
33-40. (3) Atkinson T. et.al., Biochem. Soc. Trans., 198
1; 9: 290-293. (4) Easterday R.L. et.al., Adv. Exp. Med. Biol. 1
974; 42: 123-133.
9; 165: 302-319. (2) Lowe C.R. et.al., Int. J. Biochem. 1981; 13:
33-40. (3) Atkinson T. et.al., Biochem. Soc. Trans., 198
1; 9: 290-293. (4) Easterday R.L. et.al., Adv. Exp. Med. Biol. 1
974; 42: 123-133.
【図１】全タンパク質に対するグリコシル化アルブミン
の比率を表すクロマトグラムを示す。
の比率を表すクロマトグラムを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イェルク・ヴァイセ ドイツ連邦共和国デー−35085エーブスド ルファーグルント．ヴィルヘルムスヘーエ ２ (72)発明者 ハーラルト・シュタウス ドイツ連邦共和国デー−35232ダウトフェ タール．ピツアカー６ (72)発明者 アネッテ・フォイスナー ドイツ連邦共和国デー−35043マルブルク. ランゲヴィーゼンヴェーク10
Claims (7)
- 【請求項１】 ａ) 基質に固定化したトリアジン色素を
グリコシル化および非グリコシル化タンパク質とインキ
ュベートし、 ｂ) 次いで基質を洗浄して未結合のタンパク質を除去
し、そして ｃ) イオン強度またはｐＨを段階的にまたは連続的に増
加させることによってタンパク質を溶出させることから
なる、得られた溶出画分における、非グリコシル化タン
パク質およびグリコシル化の度合いが増加しているタン
パク質を互いに別々に収集する、グリコシル化および非
グリコシル化タンパク質の部分的または完全分離法。 - 【請求項２】 基質がアガロース、架橋もしくは非架橋
デキストラン、ポリアクリルアミドまたはセルロースよ
りなる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 シバクロン色素またはプロシオン色素よ
りなる群からの化合物をトリアジン色素として用いる、
請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 タンパク質混合物をｐＨ３.５〜１０の
範囲でトリアジン色素基質とインキュベートする、請求
項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載の方
法を使用することにより、グリコシド結合含有タンパク
質を含まないタンパク質。 - 【請求項６】 真核細胞またはトランスジェニック微生
物中において組換え的に調製されたタンパク質である、
請求項５に記載のタンパク質。 - 【請求項７】 酵母細胞中で発現させたヒトアルブミン
である、請求項５または６に記載のタンパク質。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19858777A DE19858777B4 (de) | 1998-12-18 | 1998-12-18 | Verfahren zur teilweisen oder vollständigen Trennung von glykosilierten und nicht-glykosilierten Proteinen |
| DE19858777:5 | 1998-12-18 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000178298A true JP2000178298A (ja) | 2000-06-27 |
| JP2000178298A5 JP2000178298A5 (ja) | 2007-01-25 |
| JP4565230B2 JP4565230B2 (ja) | 2010-10-20 |
Family
ID=7891776
Family Applications (1)
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