PT1038881E - Processo para a preparação de proteínas glicosiladas e não glicosiladas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Processo para a separação de proteínas glicosiladas e não glicosiladas" A invenção refere-se a um método para a separação cromatográfica de proteínas glicosiladas e não glicosiladas.

Sabe-se que a glicosilação intracelular de proteínas é utilizada fisiologicamente para a estabilização de proteínas e sua ligação a receptores celulares, que podem desempenhar um papel em processos de activação celular. A glicosilação não enzimática de proteínas pode também ocorrer extracelularmente, como se observa, por exemplo, na diabetes mellitus. Valores elevados de albumina glicosilada são frequentemente demonstrados no plasma de pacientes de diabetes.

As glicosilações desempenham um papel particular em proteínas recombinantes. Assim, uma proteína produzida em células de levedura, por exemplo, que iguala completamente a sequência de aminoácidos da proteína humana, geralmente possui um padrão de glicosilação claramente diferente quando estão presentes posições de glicosilação correspondentes. Isto pode conduzir a uma semivida alterada da proteína recombinante, por exemplo no plasma, ou a uma formação de anticorpos, que pode provocar reacções alérgicas com administração repetida da proteína.

Na expressão de proteínas recombinantes não é infrequente observar que apenas uma porção da proteína está glicosilada, que tem que ser detectada e removida da proteína. Contudo, também podem haver casos em que a variante glicosilada da proteína é o produto preferido, do qual se tem que remover a proteína não glicosilada. A separação das variantes glicosiladas de uma proteína das não glicosiladas frequentemente apenas pode ser conseguida com grande dificuldade por métodos convencionais tais como cromatografias ou precipitações. Os açúcares ligados aos aminoácidos, de forma N-glicosídica ou O-glicosídica, frequentemente alteram apenas ligeiramente as propriedades físico-químicas da proteína, tais como o ponto isoeléctrico, 2

ΕΡ 1 038 881 /PT pelo que a cromatografia de permuta iónica dificilmente ajuda, por exemplo. Contudo, foi já descrito na patente alemã 198 56 433.3 que lectinas imobilizadas, que reconhecem estruturas de açúcar especificas, podem ser úteis na separação de glicoproteinas e podem ser utilizadas como agentes de adsorção ou reagentes de detecção em certos sistemas de teste. Contudo, existe sempre o risco da matriz "sangrar", pelo que podem ocorrer perturbações consideráveis devido à lectina libertada, por exemplo, em teste biológicos, tal como em culturas celulares. Como as lectinas podem causar uma reacção imunitária, a sua utilização para a produção de agentes farmacêuticos, que podem ser utilizados em seres humanos, não é recomendável.

Determinou-se agora um método para a separação cromatográfica parcial ou completa de proteínas glicosiladas e não glicosiladas, no qual a) um corante de triazina imobilizado numa matriz é incubado com uma mistura de proteínas glicosiladas e não glicosiladas, b) a matriz é depois lavada para remover as proteínas não ligadas e c) as proteínas são eluídas através de um aumento, contínuo ou por passos, do valor da força iónica ou do pH, ou as condições são seleccionadas de modo a que a proteína glicosilada ou a não glicosilada passe através da matriz não ligada e, respectivamente, a proteína ligada seja eluída, em que as proteínas não glicosiladas e as proteínas possuindo um grau crescente de glicosilação são recolhidas separadamente umas das outras nas resultantes fracções eluídas.

Conhece-se já, de facto, que os corantes da série das triazinas podem ser utilizados para separar proteínas de misturas (1). Isto inclui também proteínas plasmáticas tais como albumina ou proteínas de levedura especiais obtidas de extractos de levedura. Um método para a separação de constituintes glicosilados e não glicosilados de uma proteína é, contudo, novo e surpreendente. Como a albumina expressa, por exemplo, em leveduras ou outras células eucarióticas, é parcialmente glicosilada, existe uma necessidade de ter 3

ΕΡ 1 038 881 /PT disponível um método para a separação da albumina glicosilada da albumina não glicosilada. Em adição, guando se obtêm proteínas recombinantes, as proteínas celulares contidas no extracto da células hospedeira ocorrem também como impurezas, podendo os seus componentes glicosilados ser também removidos quando se utiliza o método de acordo com a invenção. Assim, sabe-se que, no caso de proteínas de levedura, as proteínas glicosiladas, em particular, que frequentemente possuem estruturas de manose mais ou menos complexas, podem já ter uma acção imunogénica nos seres humanos em pequenas concentrações. A remoção adequada das proteínas glicosiladas da proteína proporcionada para utilização humana é portanto necessária.

Os corantes de triazina a utilizar de acordo com a invenção são, em particular, compostos do grupo dos corantes Cibacron ou Procion. Os métodos para acoplamento covalente de corantes de triazina a materiais transportadores, tais como agarose, dextrano reticulado ou não reticulado, poliacrilamida ou celulose, são conhecidos dos peritos na especialidade (2, 3, 4) . Os métodos de acoplamento geralmente não são complicados, são rápidos e não incluem quaisquer químicos tóxicos. Os corantes de triazina distinguem-se por uma elevada estabilidade química, pelo as matrizes correspondentes podem ser utilizadas e armazenadas durante muito tempo. Estas matrizes de corante exibem também elevada estabilidade em comparação com actividades proteolíticas e outras potenciais influências perturbadoras. Em adição, as referidas substâncias são comparativamente económicas.

No método de acordo com a invenção, a mistura de uma ou mais proteínas, que contém variantes glicosiladas e não glicosiladas de uma ou mais proteínas, é colocada em contacto com uma matriz de corante de triazina, a matriz é lavada e as proteínas são então eluídas. Utilizam-se para a eluição gradientes de concentrações salinas crescentes. Gradientes de pH, crescentes ou decrescentes, são também adequados para eluição contínua ou por passos. As proteínas são, neste caso, separadas e fraccionadas dos seus componentes glicosilados.

Numa concretização preferida do método de acordo com a invenção, albumina a um pH na gama entre 3,5 e 10 é colocada em contacto com uma matriz de corante, é lavada e eluída, por 4

ΕΡ 1 038 881 /PT passos ou continuamente, por meio de gradientes crescentes de concentração salina ou de pH. Podem também ser seleccionadas condições sob as quais as respectivas proteínas glicosiladas e não glicosiladas passam através da matriz não ligadas, o que pode ser decidido consoante as circunstâncias no caso individual, e podem ser influenciadas pelo pH, por exemplo. É particularmente preferido um método em que a albumina é colocada em contacto com um corante imobilizado conhecido por "Reactive Green 5®", preferivelmente na gama de pH de 6 a 10, particularmente, de preferência num tampão de fosfato. Após lavagem da matriz, a albumina, que foi liberta da proteína glicosilada, é eluída através de um aumento na concentração salina. A proteína glicosilada pode então ser obtida através de um aumento adicional da força iónica. A utilização de "Reactive Yellow 3®", que é preferivelmente colocado em contacto com uma solução de albumina na gama de pH de 3,5 a 6,5, é também, em particular, preferida. A eluição separada das albuminas glicosiladas e não glicosiladas pode também ocorrer aqui por aumento da força iónica e/ou aumento do pH.

Adicionalmente, aditivos tais como etilenoglicol ou nucleótidos, podem ser utilizados para a eluição. Podem também utilizar-se outras matrizes de corante tais como Cibacron-Blue®. A invenção é elucidada pelo exemplo seguinte.

Exemplo A albumina humana expressa em levedura de padeiro transfectada pode conter, sob certas condições de fermentação, uma pequena fracção de albumina manosilada. Isto pode ser quantificado, como mostrado no pedido de patente alemã 198 56 433.3. Neste caso, a lectina concanavalina A é imobilizada numa placa de microtítulo e é utilizada como ratoeira para moléculas glicosiladas portadoras de manose. A albumina não glicosilada, não ligada, é removida por lavagem e a albumina ligada é determinada por meio de um fragmento de anticorpo monoclonal marcado. Utiliza-se uma curva padrão para a quantificação. 5

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Uma amostra assim produzida foi introduzida numa solução de Na2HP04 20 mM, pH 7,0, por filtração em gel e aplicaram-se então 70 mg de albumina a uma coluna de agarose "Reactive Green 5®" (Sigma; diâmetro: 1,6 cm, altura 10 cm). Depois de a coluna ter sido lavado com o tampão atrás mencionado, aplicou-se um gradiente de NaCl (0,1 M; gradiente de 0,2%/ml) e recolheram-se fracções de 7,5 ml cada uma. Quantificou-se a concentração de albumina em cada amostra por meio de SEC-HPLC, em que as áreas dos picos foram integradas e o teor foi lido utilizando uma curva padrão. Os teores de albumina glicosilada foram determinados como descrito atrás. A razão entre proteína glicosilada e a proteína total foi expressa na forma de percentagem. O resultado pode ser observado no cromatograma da Fig. 1. Este mostra o decorrer da absorção a 280 nm, por outras palavras, principalmente a proteína que passa através do fotómetro. Em adição, o gradiente contínuo de sal é documentado por medição da força iónica. A percentagem calculada do teor de albumina glicosilada da albumina que era demonstrável na fracção foi subsequentemente representada (linha tracejada). Pode-se observar claramente que as fracções 13 a 22 continham um teor significativamente reduzido de proteína glicosilada em comparação com o material de partida (0,52%). Por outro lado, encontraram-se teores significativamente aumentados de albumina glicosilada na fracção 30 (cerca de 0,8%) e no conjunto das fracções 50 a 53 (1,34%). No global, mostrou-se um claro efeito de separação da albumina glicosilada e não glicosilada, que pode ser adicionalmente optimizada, por exemplo, por aplicação de um gradiente salino mais suave.

Bibliografia (1) Dean P.D.G., Watson D.H., J. Chromatogr. 1979; 165:302-319; (2) Lowe C.R. et al., Int. J. Biochem. 1981, 13:33-40; (3) Atkinson T. et al., 9:290-293;

Biochem. Soc. Trans., 1981; 6

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Biol. 1974; (4) Easterday R.L. et al.r Adv. Exp. Med. 42 :123-133.

Lisboa,

Claims (6)

1. ΕΡ 1 038 881 /PT 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a separação parcial ou completa de proteínas glicosiladas e não glicosiladas, caracterizado por a) um corante de triazina imobilizado numa matriz ser incubado com uma mistura de proteínas glicosiladas e não glicosiladas, b) a matriz ser então lavada para remover as proteínas não ligadas e c) as proteínas serem eluídas por um aumento contínuo ou por passos na força iónica ou por um aumento ou uma diminuição, contínuos ou por passos, no pH, pelo que as proteínas não glicosiladas e as proteínas possuindo graus crescentes de glicosilação são recolhidas separadamente umas das outras nas fracções eluídas resultantes.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a matriz compreender agarose, dextrano reticulado ou não reticulado, poliacrilamida ou celulose.
3. 3. Método de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por serem utilizados compostos do grupo dos corantes Cibracron ou Procion, como corantes de triazina.
4. 4. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por a mistura de proteínas ser incubada com a matriz de corante de triazina a um pH entre 3,5 e 10.
5. 5. Método de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por a mistura de proteínas glicosiladas e não glicosiladas ser produzida por tecnologia recombinante em células eucarióticas ou em microorganismos transgénicos.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a mistura de proteínas glicosiladas e não glicosiladas ser uma mistura de albumina glicosilada e não glicosilada obtida a partir de células de levedura. Lisboa, ΕΡ 1 038 881 /PT 1/1