DE69728997T2

DE69728997T2 - Verfahren zur herstellung aufgereinigter dimere des aus knochen entstammenden faktors (bone-derived factor)

Info

Publication number: DE69728997T2
Application number: DE69728997T
Authority: DE
Inventors: Jun Honda; Hidetoshi Andou; Shunjiro Sugimoto
Original assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Current assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Priority date: 1996-12-25
Filing date: 1997-12-24
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2017-12-25
Also published as: DE69728997D1; AP9901539A0; EP0949335A4; ZA9711580B; HUP0002573A2; NO993151D0; EA199900596A1; PL334303A1; SI0949335T1; CA2275464A1; EP0949335B2; EP0949335B1; ATE266095T1; DE69728997T3; NO993151L; AU5339598A; ES2216181T5; PT949335E; EP0949335A1; SI0949335T2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines aufgereinigten dimeren Knochen-morphogenetischen Faktors. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung eines dimeren Knochen-morphogenetischen Faktors, dadurch gekennzeichnet, dass ein aufgereinigter dimerer Knochen-morphogenetischer Faktor aus einem Einschlusskörper eines Knochen-morphogenetischen Faktors erhalten wird, der mit Hilfe eines gentechnologischen Verfahrens hergestellt wurde.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In der Knochenmatrix wurde ein proteinhaltiger Knochen-morphogenetischer Faktor entdeckt und "Knochen-morphogenetisches Protein" genannt (im Folgenden als BMP abgekürzt (bone morphogenetic protein)), siehe Science 150, Seiten 893–899, 1965. Vor kurzem wurde versucht, mehrere BMP-verwandte Gene zu klonieren, und es wurde entdeckt, dass alle zu der Superfamilie der transformierenden Wachstumsfaktoren β gehören (im Folgenden als TGF-β abgekürzt). Mit Hilfe gentechnologischer Verfahren wurden Rekombinanten einiger dieser Faktoren hergestellt, und es wurde bestätigt, dass sie Knochen-morphogenetische Aktivität aufweisen, woraus man eine Anwendung in der Behandlung von Knochenkrankheiten erwarten kann.
Es wurde durch Tierversuche gezeigt, dass unter diesen Faktoren das vor kurzem entdeckte und zu der humanen BMP-Familie (Biochem. Biophys. Res. Commun., 204, Seiten 646–652, 1994) gehörende humane GDF-5 (MP52) als Knochenmorphogenetischer Faktor wirksam ist, und es wurde technisch untersucht, um dessen Produktion in großem Maßstab unter Verwendung von rekombinanten Escherichia coli (E. coli) weiterzuverfolgen.
Wenn das Protein jedoch in großem Maßstab in E. coli und anderen exprimiert wird, beispielsweise wenn das Protein in einer Menge von mehreren Gramm pro Liter Kulturmedium produziert wird, tendiert das gewünschte Protein im Allgemeinen dazu, einen inaktiven und unlöslichen Einschlusskörper zu bilden. Dieser Einschlusskörper ist monomer und, um ein Dimer, das als Knochen-morphogenetischer Faktor aktiv ist, zu erhalten, muss der Einschlusskörper löslich gemacht werden, zu einem Dimer einer ursprünglichen Struktur renaturiert werden (dieses Verfahren wird im Allgemeinen "Faltung" genannt), abgetrennt und aufgereinigt werden, um das gewünschte Protein zu erhalten.
Die aktive Form von MP52 hat die folgenden oder ähnliche Probleme;

1) wegen seiner geringen Löslichkeit in einer wässrigen Lösung sollte es in Gegenwart eines Denaturierungsmittels oder unter sauren Bedingungen gehandhabt werden,
2) das für die Abtrennung verwendete Protein tendiert dazu, unspezifisch auf ein Harz für Flüssigchromatographie zu adsorbieren, und
3) das für die Faltung essenzielle oberflächenaktive Mittel tendiert dazu, die Abtrennung zu stören, und somit war es sehr schwierig, ein Verfahren für die Aufreinigung davon zu entwickeln.

Das vor kurzem entwickelte Aufreinigungsverfahren zur Lösung der oben genannten Probleme (WO 96/33215), das bei dem Erhalten einer einzigen aktiven Form von MP52 erfolgreich war, umfasst die folgenden Schritte:

1. Löslich machen eines Einschlusskörpers durch ein Denaturierungsmittel,
2. Abtrennen durch Ionenaustauschchromatographie,
3. Sulfonieren,
4. Abtrennen durch Gelfiltrationschromatographie,
5. Falten,
6. Gewinnen durch isoelektrische Ausfällung, und
7. Abtrennen durch Umkehrphasenchromatographie.

Wenn jedoch das obige Verfahren auf einen industriellen Maßstab vergrößert wird, treten die folgenden und ähnliche Probleme auf;

1) um den MP52-Einschlusskörper löslich zu machen, wird eine große Menge an Denaturierungsmittel verwendet, wodurch eine Modifizierung des Proteins (beispielsweise eine Carbamylierungsreaktion im Fall von Harnstoff) induziert werden kann,
2) es wird ein teures Harz für die Chromatographie, insbesondere für die Gelfiltrationschromatographie, wie etwa Sepharcyl S-200HR oder Superdex 200pg (alle erhältlich von Pharmacia Biotech) in einer großen Menge verwendet,
3) das bei der Faltung verwendete Reagenz, unter anderem CHAPS und oxidiertes Glutathion, das für die Dimerisierungsreaktion essenziell ist, ist extrem teuer, und
4) wenn eine isoelektrische Ausfällung durchgeführt wird, ist eine Verdünnung notwendig, um die Konzentration des Detergenzes zu verringern, und somit wird das Volumen der Lösung erhöht.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der Erfindung ist, die oben erwähnten Probleme zu vermeiden, d. h.,

1) ein Denaturierungsmittel in einer so geringen Menge wie möglich zu verwenden;
2) ein Chromatographieharz in einer so geringen Menge wie möglich zu verwenden;
3) das für die Faltung verwendete Reagenz durch andere wenig kostenspielige Reagenzien zu ersetzen und die mit dem Falten einhergehenden Verfahren zu vereinfachen,
4) das Volumen der Lösung zu verringern, indem ein Detergenz selektiv entfernt wird, d. h. die Verfahrenszeit wesentlich zu verkürzen.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine Vereinfachung der Aufreinigungsschritte durch Löslichmachen eines Einschlusskörpers, der in Gegenwart eines Denaturierungsmittels aus E. coli extrahiert wird, möglich gemacht, wobei eine direkte Faltung gemäß einem Verdünnungsverfahren und anschließendem Unterziehen einer Ultrafiltration unter Ersetzen der Faltungslösung durchgeführt wird. Dieses Verfahren scheint dem ersten Schritt eines Verfahrens zur Herstellung von humanen Insulin aus E. coli (EP 600372A1) ähnlich zu sein. Da jedoch ein Knochenmorphogenetischer Faktor in seinen Eigenschaften von einem löslichen Protein wie etwa humanem Insulin verschieden ist, war es schwierig, das Verfahren zur Herstellung von Insulin wie oben beschrieben auf den Fall eines Knochenmorphogenetischen Faktors anzuwenden. Das wie oben beschriebene dimerisierte MP52 (aktive Form) hat eine geringe Löslichkeit und tendiert dazu, auf ein chromatographisches Harz zu adsorbieren, und daher konnte eine Ionenaustauschchromatographie oder hydrophobe Chromatographie, die für humanes Insulin verwendet wird, oder die in der oben erwähnten WO 96/33215 angewandte Gelfiltrationschromatographie nicht für die Herstellung in großem Maßstab angewendet werden. Wenn ein Ionenaustauscher (SP Sepharose FF, Pharmacia Biotech) verwendet wird, wird z. B. MP52 wegen seiner starken Adsorption an das Harz nicht vollständig eluiert, selbst wenn ein Denaturierungsmittel und eine maximale Salzkonzentration verwendet werden. Wenn eine Gelfiltration (Sepharcyl S-200HR, Pharmacia Biotech) verwendet wird, tritt eine starke Adsorption des Proteins an das Harz auf, selbst wenn ein Denaturierungsmittel verwendet wird, was einen übermäßig verbreiterten Fraktionierungsbereich und somit eine sehr schlechte Abtrennung verursacht. Des Weiteren werden die Eigenschaften des Harzes durch den Einfluss eines oberflächenaktiven Mittels, wie etwa CHAPS verändert, was zu einem Verlust der Reproduzierbarkeit führt. Dies betrifft auch die Eluierung mit einer sauren Lösung, in der MP52 löslich ist. Zusammenfassend ist es nicht möglich, die ursprünglichen Eigenschaften des Harzes zu nutzen.
Wie oben erklärt, wurde es deutlich, dass die Aufreinigung des gewünschten Proteins in einer Herstellung im großen Maßstab nicht gemäß allgemeinen chromatographischen Mitteln unter Verwendung eines wässrigen Systems erreicht werden kann. Die Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung organischer Lösungsmittel ist das einzige Mittel, das angewandt werden kann. Unter diesem Umständen war es notwendig, einen Aufreinigungsweg zu entwickeln, bei dem nicht viele Säulen verwendet werden. Als Aufreinigungsmittel, das keine Säulen verwendet, schien eine Fraktionierungsmethode mit Ammoniumsulfat vielversprechend. Da sie jedoch eine niedrige Aufreinigungseffizienz aufwies und zu unnötig niedrigen Ausbeuten führte, wurde diese Anwendung verworfen. Zusätzlich wurde ein isoelektrisches Ausfällungsverfahren durch pH-Regelung angewandt, aber vor dem eigentlichen Verfahren, wurde ein Ultrafiltrationsverfahren angewandt, um ein oberflächenaktives Mittel, CHAPS, zu entfernen, was die Durchführung der isoelektrischen Ausfällung erlaubte, ohne das Volumen der Lösung zu erhöhen. Im Allgemeinen war die Proteinlöslichkeit hoch, und es trat keine Ausfällung auf, wenn die Lösung CHAPS enthielt. Daher war eine Verdünnung notwendig, um die Konzentration von CHAPS zu verringern, aber die resultierende starke Erhöhung des Lösungsvolumens war ein Problem bei der Entwicklung dieses Verfahrens.
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines aufgereinigten dimeren Knochen-morphogenetischen Faktors, gekennzeichnet durch Unterziehen eines Einschlusskörpers eines Knochen-morphogenetischen Faktors, der mit Hilfe eines gentechnologischen Verfahrens erzeugt wurde, den folgenden Schritten a) bis e) in dieser Reihenfolge, wobei ein dimeren Knochen-morphogenetischen Faktor hergestellt wird;

a) Behandeln eines Einschlusskörpers eines Knochen-morphogenetischen Faktors mit einem Denaturierungsmittel, um ein löslich gemachtes Monomer zu erhalten,
b) Behandeln des löslich gemachten Monomers mit einer Faltungslösung und in Gegenwart einer Verbindung mit einer Guanidinogruppe oder dem Salz davon, um einen dimeren Knochen-morphogenetischen Faktor zu erhalten,
c) Behandeln des dimeren Knochen-morphogenetischen Faktors mit Ultrafiltration unter Verwendung einer Säurelösung,
d) Unterziehen des dimeren Knochen-morphogenetischen Faktors im so substituierten Lösungsmittel einer isoelektrischen Ausfällung, und
e) Unterziehen des so ausgefällten dimeren Knochen-morphogenetischen Faktors einer Umkehrphasenchromatographie.

Der mit Hilfe gentechnologischer Verfahren hergestellte Einschlusskörper eines Knochen-morphogenetischen Faktors ist vorzugsweise ein mit Hilfe eines gentechnologischen Verfahrens in E. coli exprimierter.
Wenn ein Knochen-morphogenetischen Faktor in E. coli exprimiert wird, werden die Zellen in einem Puffer suspendiert, mit Hilfe eines Homogenisators homogenisiert und zentrifugiert, um einen Einschlusskörper zu gewinnen. Der Einschlusskörper wird mit einem Detergenz enthaltenden Puffer gewaschen, beispielsweise Triton X-100, oder Harnstoff, für mehr als dreimal und zentrifugiert, um einen Einschlusskörper der ersten Aufreinigung zu erhalten.
Der Schritt, in dem ein Einschlusskörper eines Knochen-morphogenetischen Faktors mit einem Denaturierungsmittel behandelt wird, um ein löslich gemachtes Monomer zu erhalten, kann durch Zugabe des Einschlusskörpers zu einer das Denaturierungsmittel enthaltenden Lösung und Auflösen durch Rühren durchgeführt werden. Für die ein Denaturierungsmittel enthaltende Lösung können alle öffentlich bekannten Denaturierungsmittel wie etwa 8 M Harnstoff oder 6 M Guanidin-HCl oder andere in 50 mM GlyCln-NaOH-Puffer (pH 10,7) verwendet werden.
Der Schritt, in dem ein löslich gemachtes Monomer mit einer Faltungslösung behandelt wird, um ein Dimer zu ergeben, wird durch Verdünnen der oben erhaltenen Proteinlösung mit einer Faltungslösung durchgeführt, um eine endgültige Proteinkonzentration von 0,1 bis 5,0 mg/ml zu ergeben, vorzugsweise 2,4 mg/ml. Obwohl eine Verdünnung bisher so durchgeführt wurde, um eine endgültige Konzentration eines Denaturierungsmittels von 1 M oder weniger zu ergeben, ist es bevorzugt in dieser Erfindung, dass die Verdünnung so durchgeführt wird, um eine endgültige Konzentration eines Denaturierungsmittels von 1 bis 4 M, insbesondere 2,4 M zu ergeben, sodass ein Aggregieren und Ausfällen von Proteinen verhindert werden kann und eine verbesserte Ausbeute erzielt werden kann. Für die Faltungslösung können alle im Stand der Technik öffentlich bekannten verwendet werden, wie etwa oberflächenaktive Mittel, z. B. Cholsäure oder dessen Derivate wie etwa 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO), Taurocholsäure oder ein Salz davon, Taurodeoxy-cholsäure oder ein Salz davon, und vorzugsweise 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS); EDTA; eine Kombination eines reduzierenden Mittels wie etwa Mercaptoethanol oder Dithiothreitol (DTT) und oxidiertem Glutathion oder ein Cystein enthaltender Puffer oder dgl. Der Vorteil bei der Verwendung von Cystein allein ist, dass es nicht notwendig ist, im Allgemeinen teure oxidierende Reagenzien zu verwenden und dass es die verwendete Menge reduzieren kann. Daher ist zu erwarten, dass dies die Verfahrensschritte vereinfacht und die Kosten für die Reagenzien senkt.
Das in der Faltungslösung enthaltende Reagenz abgesehen von den oben beschriebenen, ist jenes mit einer Guanidinogruppe, welches auch ein Aggregieren und Ausfällen des Proteins verhindert und die Ausbeute erhöht.
Insbesondere wird Guanidinhydrochlorid oder Argininhydrochlorid (Arg·HCl), vorzugsweise 0,5 M Arg·HCl zu der Faltungslösung im Voraus hinzugegeben. Die Wirkung der Zugabe von Arg·HCl ist in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 gezeigt, trat ohne Arg·HCl ein Aggregieren und Ausfällen des Proteins in der Faltungslösung auf. Durch Zugabe von Arg·HCl kann jedoch die Menge an Protein, die pro Faltungslösung ohne Aggregieren behandelt werden kann, um das 2,7-fache erhöht werden (z. B. 0,98 g/l im Gegensatz zu 0,37 g/l). Als Puffer können solche Puffer, die Phosphat oder Tris-HCl verwenden, verwendet werden, aber ein Arg-NaOH-Puffer mit einem pH-Wert von 8 bis 10, insbesondere 8,9, ist bevorzugt.
Der Ultrafiltrationsschritt, in dem das gefaltete Dimer konzentriert wird, wird unter Verwendung eines Membranfilters mit einer Molekulargewichtsgrenze von 10.000 durchgeführt, wie etwa PSU 10K (Sartorius), und die CHAPS-Konzentration wird durch Ersetzen durch eine Säurelösung, wie etwa 0,2%ige Phosphorsäurelösung, verringert.
Der Schritt, in dem die Lösung des substituierten Dimers isoelektrisch ausgefällt wird, wird durch Hinzufügen einer alkalischen Lösung, wie etwa NaOH zu der Dimerlösung durchgeführt, wobei der pH-Wert auf 7,4 eingestellt wird, um selektiv einen Knochenmorphogenetischen Faktor auszufällen. Nach dem Einstellen des pH-Wertes lässt man die Lösung für 1 Stunde oder mehr stehen, zentrifugiert oder filtriert sie, um den Überstand zu entfernen, und löst das Präzipitat in einer Säurelösung, wie etwa 50 mM Zitronensäure, 0,2%iger Phosphorsäure oder 0,05%iger Trifluoressigsäurelösung.
Der Schritt, in dem das isoelektrisch ausgefällte Dimer einer Umkehrphasenchromatographie unterzogen wird, wird durchgeführt, indem die oben erhaltene Säurelösung einer Hochleistungsflüssigchromatographie und einem Eluieren mit 0 bis 50% Gradienten eines organischen Lösungsmittels, wie etwa Isopropanol, Acetonitril oder Ethanol unterzogen wird, um die Fraktionen eines dimeren Knochenmorphogenetischen Faktors zu gewinnen. Als Harz für die Hochleistungsflüssigchromatographie wird ein Polymerharz, wie etwa SOURCE 15 RPC (6 cm ⌀ × 20 cm, hergestellt von PharmaCla Biotech) verwendet.
Der in dieser Erfindung zu verwendende Knochen-morphogenetische Faktor ist vorzugsweise ein Knochen-morphogenetischer Faktor mit einem einzigen Molekulargewicht ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus MP52, BMP-2, BMP-4, BMP-6 und BMP-7. Als Beispiel wird der E. coli-Stamm, der eine darin eingeführte cDNA, die für einen humanen MP52-Vorläufer codiert (insbesondere das E. coli, das ein Plasmid enthält, das mit einem Codon ligiert ist, das am 5-Primer-Terminus in der MP52-Sequenz von 119 Resten für ein Methionin codiert, wobei das N-terminale Alanin des reifen humanen MP52 deletiert ist) enthält, inkubiert, um ein reifes monomeres MP52 als Einschlusskörper in großen Mengen herzustellen, und es wird das vorliegende Verfahren verwendet, um reifes MP52 von hoher Reinheit aus diesem Einschlusskörper zu erhalten.
Beispiel
Diese Erfindung wird im Folgenden genauer mit Hilfe von Beispielen erklärt werden, welche nicht so ausgelegt werden sollen, dass sie die Endung beschränken. Die Verfahren von (2) bis (4) wurden in einer Niedrigtemperaturkammer bei 4°C durchgeführt, unter Berücksichtigung der Stabilität des Proteins. Jeder Schritt wird unten vollständig erklärt.

(1) Fermentieren von humanem MP52 und erste Aufreinigung des Einschlusskörpers Das wie in Beispiel 2 von WO 96/33215 erhaltene MP52 herstellende E. coli wurde in einem modifizierten SOC-Medium vorkultiviert, und anschließend wurde das vorkultivierte Medium in 100 l Produktionsmedium geimpft. Für die Einleitung wurde 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) in einer frühen logarithmischen Wachstumsphase hinzugefügt, und das Fermentieren wurde bei 32°C weitergeführt, bis OD₅₅₀ = 150. Danach wurden die Zellen geerntet, die Zellen wurden in einem Puffer enthaltend 25 mM Tris-HCl (pH 7,3) und 10 mM EDTA-4Na suspendiert, mit Hilfe eines Homogenisators homogenisiert (hergestellt von Manton Gaulin) und zentrifugiert; um einen Einschlusskörper zu gewinnen. Der Einschlusskörper wurde mit einem 1 M Harnstoff als Detergenz enthaltenden Puffer gewaschen und zentrifugiert, um einen Einschlusskörper mit der angewandten ersten Aufreinigung zu erhalten.
(2) Löslich-machen des Einschlusskörpers und Falten Einhundert Gramm (Feuchtgewicht) eines oben erhaltenen Einschlusskörpers wurde durch Rühren in 300 ml 50 mM Glycin-NaOH-Puffer enthaltend 8 mM Harnstoff und 5 mM Ethylendiamin-tetraacetat (pH 8,9) löslich gemacht (wobei die Proteinkonzentration etwa 18 mg/ml betrug). Das Falten wurde durchgeführt durch Verdünnen der Einschlusskörperlösung mit einem Faltungspuffer [0,5 M Arg-NaOH (pH 8,9), 4,8 mM Cysteinhydrochloridmonohydrat, 0,5 M Natriumchlorid, 20 mM CHAPS] auf das 6,7-fache Volumen (wobei die Proteinkonzentration etwa 2,4 mg/ml betrug). Das Gemisch wurde so bei 4°C für etwa 20 Stunden stehengelassen.
(3) Aufreinigung von MP52 nach dem Falten (Ultrafiltration) Nach dem Abschluss der Faltungsreaktion wurde MP52 fünffach konzentriert unter Verwendung eines Membranfilters mit einer Molekulargewichtsgrenze von 10.000 (PSU 10K, Sartorius), und die Lösung wurde verdünnt und durch das 5-fache Volumen 0,2%iger Phosphorsäurelösung substituiert. Durch dreimaliges Wiederholen des Verfahrens wurde die CHAPS-Konzentration theoretisch 100-fach oder mehr verdünnt.
(4) Aufreinigung von MP52 nach dem Falten (isoelektrisches Ausfällen) Das isoelektrische Ausfällen wurde durch Zugabe einer NaOH-Lösung zu der substituierten Faltungslösung durchgeführt, wobei der pN-Wert auf 7,4 eingestellt wurde. Die Lösung wurde trüb, und wurde dann für 1 Stunde oder mehr stehengelassen. Anschließend wurde sie zentrifugiert (10.000 g × 10 15 min) und das Präzipitat gewonnen. Das Präzipitat wurde in 0,2%iger Phosphorsäurelösung verdünnt.
(5) Aufreinigung von MP52 nach dem Falten (Umkehrphasenchromatographie) Das in der Phosphorsäurelösung gelöste MP52 wurde mit Hilfe einer Umkehrphasenchromatographie abgetrennt. Ein Hochleistungsflüssigchromatographiesystem unter Verwendung von SOURCE 15 RPC (6 cm ⌀ × 20 cm, PharmaCla Biotech) als Harz wurde mit einem 0 bis 50%-igen Ethanolgradienten durchgeführt und eluiert, um die dimeres MP52 enthaltenden Fraktionen zu gewinnen.

Gemäß dem oben erwähnten Aufreinigungsverfahren ist es gelungen, eine aktive Form von MP52 in hoher Ausbeute zu gewinnen, wie in Tabelle 2 gezeigt. Eine Menge von MP52 in dem Aufreinigungsschritt wurde durch Quantifizierung des gescannten CBB-gefärbten Elektrophoresegelbilds bestimmt.
Tabelle 2
Einer der Vorteile des Aufreinigungsverfahrens dieser Erfindung ist eine wirksame Reduzierung der Aufreinigungskosten. Gemäß einer vorläufigen Berechnung können die Gesamtverfahrenskosten auf etwa die Hälfte pro Protein reduziert werden im Vergleich mit den in WO 96/33215 offenbarten. Daher kann das vorliegende Aufreinigungsverfahren bei der Industrialisierung sehr nützlich sein.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren kann ein dimerer Knochen-morphogenetischer Faktor mit einem einzigen Molekulargewicht effizient in großer Menge und weniger kostspielig hergestellt werden als mit einem Verfahren aus dem Stand der Technik.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines aufgereinigten dimeren Knochenmorphogenetischen Faktors, umfassend, Unterziehen eines Einschlusskörpers eines Knochen-morphogenetischen Faktors, der mittels eines gentechnologischen Verfahrens hergestellt wurde, den folgenden Schritten a) bis e) in dieser Reihenfolge, wobei der dimere Knochen-morphogenetische Faktor erzeugt wird; a) Behandeln eines Einschlusskörpers eines Knochen-morphogenetischen Faktors mit einem denaturierenden Mittel, um ein löslich gemachtes Monomer zu erhalten, b) Behandeln des löslich gemachten Monomers mit einer Faltungslösung und in Gegenwart einer Verbindung mit einer Guanidinogruppe oder des Salzes davon, um einen dimeren Knochen-morphogenetischen Faktor zu erhalten, c) Behandeln des dimeren Knochen-morphogenetischen Faktors durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Säurelösung, d) Unterziehen des dimeren Knochen-morphogenetischen Faktors einer isoelektrischen Ausfällung in so substituiertem Lösungsmittel, und e) Unterziehen des so ausgefällten dimeren Knochen-morphogenetischen Faktors einer Umkehrphasen-Chromatographie.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Einschlusskörper ein Einschlusskörper eines Knochen-morphogenetischen Faktors ist, der mittels eines gentechnologischen Verfahrens in Escherichia coli exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die endgültige Konzentration des Denaturierungsmittels während der Faltung gemäß Schritt (b) 1 M bis 4 M beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Faltungslösung ein Puffer umfassend Cystein oder ein Salz davon in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 mg/ml Protein, Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,1 bis 1,5 M, und Cholsäure oder dessen Derivate in einer Konzentration von 5 bis 100 mM und mit einem pH-Wert im Bereich von 8 bis 10 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verbindung, die eine Guanidinogruppe aufweist, Guanidinhydrochlorid oder/und Argininhydrochlorid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Knochenmorphogenetische Faktor ein Knochen-morphogenetischer Faktor ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus MP52, BMP-2, BMP-4, BMP-6 und BMP-7 ist.