WO1998029559A1 - Procede de preparation de dimeres purifies a partir de facteur derive de l'os - Google Patents

Procede de preparation de dimeres purifies a partir de facteur derive de l'os Download PDF

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Jun Honda
Hidetoshi Andou
Shunjiro Sugimoto
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Hoechst Marion Roussel Ltd.
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    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a purified osteoinductive factor dimer. More specifically, the present invention relates to a method for producing an osteoinductive factor dimer, comprising obtaining a purified osteoinductive factor dimer from an inclusion body of an osteoinductive factor produced by a genetic engineering method. .
  • BMP bone morphogenetic protein
  • GDF-5 (MP52) (Biochem. Biophys. Res. Commun. 204, pp. 646-652, 1994), which belongs to the recently discovered human BMP family, was determined by animal experiments. It has been confirmed that it is effective as an osteoinductive factor, and a technique for producing a large amount by expression in genetically modified Escherichia coli has been attempted. However, when expressed in large amounts in E. coli, etc., for example, when several grams of protein are produced in one liter of culture, the target protein generally forms an inactive insoluble inclusion body (granules, inclusion bodies). Tends to be.
  • This inclusion body is a monomer, and in order to obtain a dimer active as an osteoinductive factor, the inclusion body is solubilized and regenerated to a dimer of its original structure (generally, refolding). It is necessary to obtain the target protein by performing separation and purification.
  • the active form of MP52 is
  • An object of the present invention is to solve the above problems, that is,
  • the present inventors can simplify the purification process by solubilizing inclusion bodies extracted from Escherichia coli in the presence of a denaturing agent, directly performing refolding by dilution operation, and then performing ultrafiltration. I made it.
  • This method is similar to the first step of the method for producing human insulin from Escherichia coli (EP 600 372 A1), but in the case of a bone inducing factor, it is used with a water-soluble protein such as human insulin. Because of their different properties, it was difficult to apply the above insulin production method as it is to osteoinductive factors.
  • the dimerized MP52 active form
  • the target protein cannot be purified in the case of mass production by a general aqueous chromatography method.
  • the only available method was reverse-phase chromatography using an organic solvent, so it was necessary to develop a purification method that did not use many columns.
  • the ammonium sulfate fractionation method seemed promising.
  • this method is not used because the purification effect is small, and therefore the yield is unnecessarily reduced, and the ultrafiltration step is performed before the actual operation using the isoelectric point precipitation method by adjusting the pH. Then, the surfactant CHAPS was removed, and isoelectric focusing was performed without increasing the liquid volume.
  • the present invention provides an osteoinductive factor characterized in that a purified osteoinductive factor dimer is obtained by sequentially subjecting an osteoinductive factor inclusion body produced by a genetic engineering method to the following steps a) to e). It consists of a dimer production method.
  • the inclusion body of the osteoinductive factor produced by the genetic engineering method the one expressed in Escherichia coli by the genetic engineering method is preferable.
  • the osteoinductive factor When expressed in Escherichia coli, the cells are suspended in a buffer, crushed with a cell crusher, and the inclusion bodies are collected by centrifugation. Wash the inclusion bodies at least three times with a buffer containing a washing component such as Triton X-100 or urea, and then centrifuge. To obtain a crudely purified inclusion body.
  • a washing component such as Triton X-100 or urea
  • the step of treating the osteoinductive factor inclusion body with a denaturing agent to obtain a solubilized monomer is performed by adding the inclusion body to a solution containing the denaturing agent and stirring to dissolve the inclusion body.
  • a solution containing the denaturing agent a conventionally known solution, for example, 5 OmM glycine sodium hydroxide buffer (pH 10.7) containing 8 M urea or 6 M guanidine hydrochloride, or the like is used.
  • the solution of the protein obtained above is reduced to a protein final concentration of 0.1 to 5.Omg / mU, preferably 2.4 mgZmL. It is carried out after dilution.
  • the denaturing agent was diluted so as to have a final concentration of 1 M or less, but in the present invention, the dilution is preferably performed so that the final concentration of the denaturing agent is 1 to 4 M, particularly 2.4 M. It is preferable because it prevents protein aggregation and precipitation and improves the yield.
  • a conventionally known solution for example, cholic acid or a derivative thereof, 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -12-hydroquinine-11-propanesulfonate (CHAPS), taurochol Acid or a salt thereof, taurodeoxycholic acid or a salt thereof, preferably a surfactant such as 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] _1-propanesulfonate (CHAPS);
  • EDT A A combination of a reducing agent such as mercaptoethanol or DTT and oxidized glutathione or a buffer containing cysteine or the like is used.
  • the advantage of using only cysteine is that, in general, there is no need to use expensive oxidizing reagents and the amount of oxidizing reagents can be reduced, so that a reduction in reagent cost and simplification of the process can be expected. is there.
  • reagents that are effective in preventing protein aggregation and precipitation and improving yield include compounds having a guanidino group.
  • guanidine hydrochloride and arginine hydrochloride.
  • arginine hydrochloride is added to the refolding solution in advance to a concentration of 0.5 M. Table 1 shows the effect of the added arginine hydrochloride.
  • Protein concentration 0.8 gZL is the same as conventional arginine hydrochloride-free
  • the refolding solution is concentrated using a filter having a molecular fraction of 10,000, for example, PSU 10K (manufactured by Sartorius), and concentrated. Replace with a solution such as 0.2% phosphoric acid solution to lower the CHAPS concentration.
  • the step of isoelectric precipitation of the solvent-substituted dimer is performed by adding an alkaline solvent, such as sodium hydroxide, to the obtained dimer solution, adjusting the pH to 7.4, It is performed by selectively precipitating the inducer. After adjusting the pH, leave the solution for 1 hour or more, centrifuge or filter, remove the supernatant, and dissolve the precipitate in an acid solution such as 5 OmM citric acid, 0.2% phosphoric acid or 0.05% trifluoroacetic acid solution.
  • an alkaline solvent such as sodium hydroxide
  • the step of subjecting the dimer subjected to isoelectric point precipitation to reverse phase chromatography is performed by subjecting the acidic solution obtained above to high-pressure liquid chromatography, and using an organic solvent, for example. For example, it is carried out by eluting with a gradient of 0 to 55% of isopropanol, acetonitril or ethanol and collecting a dimer fraction of the osteoinductive factor.
  • a carrier for high pressure liquid chromatography a polymer carrier, for example, SOURCE 15 RPC (6 cm ⁇ x 20 cm, manufactured by Pharmacia Biotech) is used.
  • an osteoinductive factor having any one single molecular weight selected from the group consisting of MP52, BMP-2, BMP-4, BMP-6 or BMP-7 is preferred.
  • an Escherichia coli strain into which cDNA encoding the human MP52 precursor has been introduced specifically, at the 5-prime end of the MP52 sequence consisting of 119 residues with the N-terminal alanine of mature MP52 deleted.
  • Escherichia coli transfected with a plasmin to which a codon encoding methionine is bound the culture is cultured, and a large amount of mature MP52 monomer is produced as an inclusion body, and the production method of the present invention is carried out from the inclusion body.
  • High purity mature MP52 can be obtained.
  • the preculture solution is inoculated into 100 L of a production medium.
  • Add lmM isopropyl S — D — thiogalactobyranoside (IPTG) during the logarithmic growth phase, induce, and culture at 32 ° C until OD55 () 150.
  • IPTG isopropyl S — D — thiogalactobyranoside
  • cells were collected, the cells were suspended in a buffer containing 25 mM Tris-HCl (pH 7.3), 10 m EDTA and 4 Na, and disrupted with a cell disrupter (Menton Gorlin).
  • the inclusion bodies are recovered by centrifugation. Cleaning buffer containing cleaning components After washing with 1M urea, centrifugation is performed to obtain a roughly purified inclusion body.
  • the wet weight of 100 g of the inclusion body obtained above is added to 30 OmL of 5 OmM glycine monohydroxide buffer (pH 8.9) containing 8 M urea and 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid, and dissolved by stirring.
  • the protein concentration is about 18mgZraL).
  • the inclusion body solution was added 6.7 times to Refolding 'buffer [0.5 M arginine monohydroxide (pH 8.9), 4.8 mM cysteine hydrochloride monohydrate, 0.5 M sodium chloride, 20 mM CHAPS]. Dilution (protein concentration 2.4mgZm) and refolding. Leave it at 4 ° C for about 20 hours.
  • the MP52 after the refolding reaction is concentrated 5 times using a filter with a molecular fraction of 10,000-(PSU 10K, manufactured by Sartorius) and diluted 5 times with a 0.2% phosphoric acid solution to replace the solvent. I do. By repeating this operation three times, the CHAPS concentration is theoretically diluted 100 times or more.
  • an osteoinductive factor dimer having a single molecular weight can be produced efficiently, in a large amount, and at a lower cost than the conventional method.

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Description

明 細 書
精製された骨誘導因子二量体の製造方法 技術分野
本発明は、 精製された骨誘導因子二量体の製造方法に関する。 さらに詳し くは、 本発明は遺伝子工学的方法により産生された骨誘導因子の封入体から 精製された骨誘導因子二量体を得ることを特徴とする骨誘導因子二量体の製 造方法に関する。
背景技術
骨基質に蛋白性の骨誘導因子が存在することが発見され （Sc ience 150, PP. 893-899, 1965)、 bone morphogenetic protein (以下 B M Pと略す） と 命名された。 近年、 複数の B M P関連遺伝子がクローニングされ、 いずれも トランスフォーミ ング成長因子一 /3 (以下 T G F— /?と略す） スーパ一ファ ミ リーに属していることが知られている。 これらのうちいくつかは遺伝子ェ 学による組換体が生産され、 それを用いて骨誘導活性が確認され、 骨疾患治 療への応用が期待されている。
それらの内、 最近発見されたヒ ト由来の B M Pファ ミ リーに属する G D F - 5 ( M P 5 2 ) (B iochem. Biophys. Res. Commun. 204, pp. 646 - 652， 1994) は動物実験により骨誘導因子として有効であることが確認され、 また 遺伝子組み換え大腸菌による発現で大量に生産する技術が試みられている。 しかし大腸菌等に大量に発現させた場合、 例えば、 1 リ ッ トル培養液中数グ ラム蛋白質を産生させた場合、 目的蛋白質は一般に不活性な不溶性の封入体 (顆粒体、 inclusion body) を形成しがちである。 この封入体は単量体であ り、 骨誘導因子として活性のある二量体を得るにはこの封入体を可溶化し、 本来の構造である二量体に再生 （一般にリフォールデイ ング （refolding) と呼ばれる操作） し、 分離 ·精製を行ない目的の蛋白質を得る必要がある。
M P 5 2の活性型は、
1 ) 水溶液中の溶解度が低く、 変性剤存在下あるいは酸性条件下で扱わなく てはならないこと、
2) 分離に使われる蛋白質が液体クロマトグラフィ一用担体に非特異的に吸 着すること、
3) リフォールディ ング時に不可欠な界面活性剤が分離の際の障害になるこ と
等の問題を抱えており、 精製法の確立は困難を極めた。
上記を解決するために最近開発された精製法 （W0 96/33215) では、
1. 封入体を変性剤で可溶化する工程、
2. イオン交換クロマトグラフィーによる分離工程、
3. スルホン化工程、
4. ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離工程、
5. リフォールディ ング工程、
6. 等電点沈殿による回収工程、
7. 逆相クロマトグラフィーによる分離工程
の各工程を経て単一の活性型 MP 52を得ている。
しかしこの方法を工業的規模に拡大するには、
1) MP 52封入体を可溶化するための変性剤を多量に消費すること、 ま たそれによる蛋白質の修飾 （たとえば、 尿素の場合であれば力ルバミル化 反応） を誘発すること、
2) クロマトグラフィ一の担体、 特にゲルろ過ク口マトグラフィ一において は例えばセフアクリル S— 200 HR、 スーパ一デックス 200 p g (い ずれもフアルマシアバイオテク製） のような高価なものを大量に使用する こと、
3) リフォールデイ ングの際に使用する試薬、 とりわけ二量体化反応に欠か せない CHA P Sと酸化型グルタチオンが非常に高価であること、
4) 等電点沈殿を行う際、 界面活性剤濃度を下げるための希釈操作を行うた め液量が大きくなること 等の問題がある。
発明の開示
本発明の目的は上記の問題を解決すること、 即ち
1 ) 変性剤の使用を極力抑える、
2 ) クロマトグラフィー担体の使用量を極力抑える、
3 ) リフォールディ ングの際に使用する試薬を他の安価なものに置き換え る、
4 ) 界面活性剤の選択的除去により液量を調整する
こと、 およびこれらに付随する操作の簡略化すなわち、 時間の大幅短縮にあ る。
本発明者らは、 大腸菌から抽出した封入体を変性剤存在下で可溶化させた のち、 希釈操作でリフォ一ルディングを直接行ない、 次いで限外ろ過するこ とにより、 精製工程の簡略化を可能にした。 この手法は大腸菌からヒ 卜イン スリンを製造する方法 （E P 6 0 0 3 7 2 A 1) の最初の工程に類似するが、 骨誘 導因子の場合はヒ 卜インスリンのような水溶性蛋白質とは性質が異なるため、 上記インスリ ン製造方法をそのまま骨誘導因子に応用するのは困難であつ た。 大量に生産する場合には前述のように二量体化した M P 5 2 (活性型） は溶解度が低く、 またクロマトグラフィ一担体に吸着する性質を持っため、 ヒ トインスリ ンで使用するイオン交換や疎水クロマ トグラフィーあるいは 前記 W〇 9 6 / 3 3 2 1 5で使用するゲルろ過クロマトグラフィ一は使用で きない。 例えばイオン交換 （フアルマシアバイオテク、 SP Sepharose FF) を用いた場合、 変性剤を使用して塩濃度を最大にしても担体への吸着が強 く、 M P 5 2は完全に溶出されない。 ゲルろ過 （フアルマシアバイオテク、 Sephacryl S-200HR) を用いた場合、 変性剤を使用しても担体への吸着が強 く、 分画範囲が極端に広くなつてしまい分離が非常に悪い。 また、 C H A P S の影響により担体の性質が変化し、 再現性がなくなる。 M P 5 2が溶解しう る酸性溶液による溶出についても同様で、 結論として担体本来の性質を生か して使用することができない。
以上のように、 一般の水性系クロマトグラフィ一の方法では大量生産の場 合目的蛋白質の精製が行えないことが明らかとなつた。 唯一利用出来たのは 有機溶媒を用いた逆相クロマトグラフィ一のみであったため、 カラムを多用 しない精製法を開発する必要があった。 カラム以外の精製法としては硫酸ァ ンモニゥム分画法が有望と思われた。 しかし、 精製効果が小さいこと、 また それゆえ不必要な収率低下を招くことからその手法は使用せず、 p H調節に よる等電点沈殿法を用い、 実際の操作前に限外ろ過工程を行い、 界面活性剤 の C H A P Sを除去し、 液量を増加させることなく等電点沈殿を行えるよう にした。 従来は、 C H A P Sが存在していると蛋白質の溶解度が大きいため 沈殿が起きず、 希釈操作により C H A P S濃度を下げていたが、 そうすると 液量が大幅に増加し、 それが精製工程上問題となっていた。
本発明は、 遺伝子工学的方法により産生された骨誘導因子の封入体を下記 工程 a ) ~ e ) に順次付して精製された骨誘導因子二量体を得ることを特徴 とする骨誘導因子二量体の製造方法からなる。
a ) 骨誘導因子封入体を変性剤で処理して可溶化単量体を得る工程、 b ) 得られた可溶化単量体をリフォールディ ング溶液で処理して二量体を得 る工程、
c ) リフォールディ ングした二量体を限外ろ過および溶媒置換処理するェ 程、
d ) 上記処理により得られた二量体溶液を等電点沈殿処理する工程、 e ) 等電点沈殿処理した二量体を逆相クロマトグラフィ一処理する工程。 遺伝子工学的方法により産生された骨誘導因子の封入体としては、 遺伝子 工学的方法により大腸菌に発現させたものが好ましい。
骨誘導因子を大腸菌に発現させた場合、 菌体を緩衝液に懸濁し、 菌体破砕 装置で破砕し、 遠心分離により封入体を回収する。 封入体を洗浄成分含有バ ッファー、 例えば Triton X- 100、 または尿素で 3回以上洗浄後、 遠心分離 を行い粗精製された封入体を得る。
骨誘導因子封入体を変性剤で処理して可溶化単量体を得る工程は、 封入体 を変性剤を含む溶液に加え、 撹拌して溶解させることによって実施される。 変性剤を含む溶液としては、 従来公知のもの、 例えば 8 M尿素または 6 M塩 酸グァニジンなどを含む 5 OmMグリシン一水酸化ナトリゥムバッファー （pH 10.7) などが用いられる。
可溶化単量体をリフォールディング溶液で処理して二量体を得る工程は、 上で得られた蛋白質の溶液を蛋白質終濃度で 0. 1〜5. Omg/mU 好ましく は 2. 4 mgZmLになるように希釈して実施される。 従来、 変性剤の終濃度が 1 M以下となるように希釈されていたが、 本発明においては、 変性剤の終濃 度が 1〜4M、 特に 2. 4 Mとなるように希釈するのが蛋白質の凝集、 沈殿 を防ぎ、 収率を向上させるので好ましい。 リフォ一ルディング溶液としては、 従来公知のもの、 例えばコール酸またはその誘導体、 3— 〔 （3—コールァ ミ ドプロピル） ジメチルアンモニォ〕 一 2—ヒ ドロキン一 1一プロパンスル フォネート （CHAP S) 、 タウロコール酸またはその塩、 タウロデオキシ コール酸またはその塩、 好ましくは 3— 〔 （3—コールアミ ドプロピル） ジ メチルアンモニォ〕 _ 1—プロパンスルフォネー ト （CHAP S) などの界 面活性剤； E DT A ； メルカプトエタノールもしくは DTTなどの還元剤と 酸化型グルタチオンとの組み合わせまたはシスティンなどを含む緩衝液が用 いられる。 システィンのみを用いるメ リ ッ トは、 一般的に高価な酸化試薬を 使う必要がないことおよびその使用量を少なくできること等があり、 従って 試薬コス トの低下と工程の簡略化が期待できるためである。
蛋白質の凝集、 沈殿を防ぎ、 収率を向上させるのに効果を発揮する他の 試薬としてグァニジノ基を有する化合物があげられる。 例えばグァニジン塩 酸塩あるいはアルギニン塩酸塩等があり、 好ましくはアルギニン塩酸塩を 0. 5 Mになるようにあらかじめリフオールディ ング溶液に加える。 表 1に、 添加されたアルギニン塩酸塩の効果を示す。 蛋 白 質濃度 （gZL) MP 52二量体 （gZL)
0.8* アルギニン塩酸塩 0.5M添加 0.37
1.6 〃 0.62
2.4 〃 0.98
3.2 〃 0.95
2.4 アルギニン塩酸塩無添加 蛋白質の凝集が起こる
* 蛋白質濃度 0.8 gZLは従来のアルギニン塩酸塩無添加の
蛋白質濃度上限値。 表 1から、 アルギニン塩酸塩を添加しないとリフォールディ ング溶液中で 蛋白質が凝集し沈殿してしまうカ、 アルギニン塩酸塩の添加によりリフォー ルディ ング溶液あたりの蛋白質量を 2. 7倍に増やせる （すなわち 0.37gZL から 0.98gZUこ増量） ことがわかる。 緩衝液としては、 リン酸、 トリス塩酸 を用いた緩衝液を使用することもできるが、 p H 8〜10、 特に p H8.9 のアルギニン一水酸化ナトリウム緩衝液が好ましい。
リフォールディ ングした二量体を限外ろ過する工程は、 リフォールディン グ終了後、 リフォールデイ ング溶液を分子分画量 1万のフィルター、 例えば PSU 10K (ザルトリウス社製） を用いて濃縮を行うとともに酸溶液例えば 0.2%リン酸溶液で置換して CHAP S濃度を下げる。
溶媒置換された二量体を等電点沈殿処理する工程は、 得られた二量体溶液 にアル力リ例えば水酸化ナ卜リゥムを添加し、 p Hを 7. 4に調節し、 骨誘 導因子を選択的に沈殿させることにより実施される。 p H調節後溶液を 1時 間以上放置し、 遠心分離またはろ過し、 上清を除き、 沈殿を酸溶液例えば 5 OmMクェン酸、 0.2%リン酸または 0.05%トリフルォロ酢酸溶液に溶 解する。
等電点沈殿処理した二量体を逆相クロマトグラフィ一処理する工程は、 上 で得られた酸性溶液を高圧液体クロマトグラフィーにかけ、 有機溶媒、 例え ばイソプロパノール、 ァセ トニ ト リルまたはエタノール 0〜55%のグラジ ェンドで溶出させ、 骨誘導因子の二量体の分画を採取することにより実施 される。 高圧液体クロマトグラフィーの担体としては高分子系担体、 例えば SOURCE 15 RPC ( 6 cm ø x 20cm、 フアルマシアバイオテク社製） が用いられ る。
本発明における骨誘導因子としては、 MP 52、 BMP— 2、 BMP— 4、 BMP— 6、 あるいは BMP— 7からなる群から選ばれるいずれか一つの単 一な分子量からなる骨誘導因子が好適に使用される。 例えばヒ ト MP 52前 駆体をコードする c DNAを導入した大腸菌株 （具体的には成熟型 MP 52 の N末端のァラニンを削除した 1 19残基よりなる MP 52配列の 5プライ ム末端にメチォニンをコードするコ ドンを結合させたブラスミ ドを導入した 大腸菌） を用い、 それを培養し、 成熟型 MP 52単量体を封入体として多量 に生産させ、 その封入体より本発明の製法を用い高純度の成熟型 MP 52を 得ることができる。
実 施 例
次に、 実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明は 以下の実施例により限定されるものではない。 操作はタンパク質の安定性を 考慮し（2)から（4)までは 4 °Cの低温室で行う。 それぞれの工程の内容を以 下に記す。
(1) ヒ ト MP 52の培養と封入体の粗精製
W096/332 15の実施例 2と同様にして得られた MP 52産生大腸 菌を改変 S〇 C培地で前培養した後、 生産用培地 100 Lに前培養液を植菌 する。 対数増殖前期に lmMのイソプロピル _ S— D—チォガラク トビラノシ ド （IPTG) を添加し誘導をかけ、 OD 55()= 150まで 32°Cで培養を行う。 その後集菌を行い、 菌体を 25mMトリス塩酸 （pH 7.3)、 1 0 m EDTA. 4 N aを含む緩衝液に懸濁し菌体破砕装置 （マン ト ン . ゴーリ ン社製） で破 砕し、 遠心分離によって封入体を回収する。 封入体を洗浄成分含有バッファ 一 1M尿素で洗浄した後、 遠心分離を行い粗精製された封入体を得る。
(2) 封入体の可溶化とリフォールデイ ング
上記により得られた封入体の湿重量 100 gを、 8M尿素および 5mMェチ レンジアミ ン四酢酸を含む 5 OmMグリシン一水酸化ナ卜リゥムバッファ一 (pH8.9) 30 OmLに加えて攪拌溶解する （蛋白質濃度は約 18mgZraL)。 この 封入体溶解液をリフオールディ ング 'バッファー 〔0.5Mアルギニン一水酸 化ナトリウム （pH 8.9)、 4.8mMシスティン塩酸塩一水和物、 0.5M塩化ナト リ ウム、 20mM CHAPS] に 6. 7倍希釈 （蛋白質濃度 2.4mgZmいこなるよう に） してリフォールデイ ングを行なう。 このまま 4 °Cで 20時間程度放置す る。
(3) リフォールディ ング後の MP 5 2の精製 （限外ろ過）
リフォールディ ング反応が終了した MP 52を分子分画量 1万のフィルタ - (PSU 10K, ザルトリウス社製） を用いて 5倍濃縮を行うとともに、 0.2 %リン酸溶液で 5倍希釈を行い溶媒置換する。 この操作を 3回繰り返すこと により理論的には CHAP S濃度が 100倍以上に希釈される。
(4) リフォールデイ ング後の MP 5 2の精製 （等電点沈殿）
溶媒置換されたリフォールディ ング溶液に水酸化ナトリウム溶液を添加す ることにより p Hを 7. 4に調節し、 等電点沈殿を行なう。 溶液が白濁後 1 時間以上放置し、 ついで遠心分離 （10，000 g X15分） を行い、 沈殿を回収す る。 沈殿を 0. 2%リン酸溶液に溶解する。
(5) リフォールディ ング後の MP 5 2の精製（逆相クロマトグラフィ一） リン酸溶液に溶解した MP 5 2を逆相クロマトグラフィ一にて二量体以外 の成分の分離をおこなう。 担体として SOURCE 15 RPC (6cm0 x2Ocm、 フ アルマシアバイオテク社製） を用い、 高速液体クロマトグラフィー装置で運 転し、 エタノール 0〜 5 0%のグラジヱン卜で溶出させ、 MP 5 2の二量体 の分画を回収する。
以上の精製法により、 表 2に示す高収率で活性型 MP 52を回収するこ とに成功した。 精製の各工程の MP 52量は、 電気泳動ゲルの C B B染色画 像走査定量法により求めた。
表 2
ェ 程 MP 52量 （g) 収率 （％) 溶 解 5.4 100 リフォ一ルディ ング 2.2 41 限外 ろ 過 1.6 30
¾ 沈 1.5 29 逆相ク口マトグラフィ一 1.1 21 本工程のメ リ ッ 卜の一つとして、 精製にかかるコス卜の削減効果があげら れる。 試算によると、 W096Z33215と比較して蛋白質当たりの製造 単位が約半分になるため、 工業化するにあたり、 非常に有益な精製法であ る。
本発明の製造方法によれば、 単一な分子量からなる骨誘導因子二量体が効 率よく、 大量に、 しかも従来法と比較して安価に産生することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 遺伝子工学的方法により産生された骨誘導因子の封入体を下記工程 a) 〜e)に順次付して骨誘導因子二量体を得ることを特徴とする精製された 骨誘導因子二量体の製造方法。
a ) 骨誘導因子封入体を変性剤で処理して可溶化単量体を得る工程、 b) 得られた可溶化単量体をリフォールディ ング溶液で処理して二量体を 得る工程、
c ) リフォールディングした二量体を限外ろ過および溶媒置換処理するェ 程、
d) 上記処理により得られた二量体溶液を等電点沈殿処理する工程、 e) 等電点沈殿処理した二量体を逆相ク口マ トグラフィ一処理するェ 程。
2. 前記封入体が、 遺伝子工学的方法により大腸菌に発現させた骨誘導因子 の封入体である請求項 1に記載の製造方法。
3. 変性剤終濃度が 1〜4Mである請求項 1または 2に記載の製造方法。
4. リフォールデイング溶液が、 システィンまたはその塩が蛋白質 1 mgあた り 0.1〜1. OmgZmLの濃度、 塩化ナ ト リウムが 0. 1〜1.5Mの濃度、 コール酸またはその誘導体が 5〜10 OmMの濃度からなる緩衝液であり、 その p Hが 8〜 10の範囲である請求項 1から請求項 3のいずれかの項に 記載の製造方法。
5. リフォールデイ ング溶液が、 さらにグァニジノ基を有する化合物または その塩を含む緩衝液である請求項 4に記載の製造方法。
6. 骨誘導因子が、 MP 52、 BMP _ 2、 BMP— 4、 BMP— 6、 BMP— 7からなる群から選択されたいずれか 1つの骨誘導因子である請 求項 1から請求項 5のいずれかの項に記載の製造方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001075095A1 (fr) * 2000-03-30 2001-10-11 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de production de proteine de recombinaison
JP2007114049A (ja) * 2005-10-20 2007-05-10 Denka Seiken Co Ltd アッセイ用媒体及びアッセイ方法
US7811793B2 (en) * 1996-12-25 2010-10-12 Biopharma Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh Process for preparing purified active monomer of bone-derived factor

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040019185A1 (en) * 1996-12-25 2004-01-29 Hidetoshi Andou Process for preparing purified active monomer of bone-derived factor
AU2003209071B2 (en) * 2002-02-08 2008-08-14 The University Of Erlangen-Nuremberg Formulation comprising bioactive agents and method of using same
CN1735426A (zh) * 2002-08-13 2006-02-15 惠氏公司 用作转化生长因子β蛋白质的溶解赋形剂的肽
ES2764222T3 (es) * 2006-09-08 2020-06-02 Wyeth Llc Lavado con arginina en la purificación de proteínas mediante el uso de cromatografía de afinidad
AU2007234612B2 (en) 2006-12-14 2013-06-27 Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc Protein stabilization formulations
US7678764B2 (en) 2007-06-29 2010-03-16 Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc Protein formulations for use at elevated temperatures
EP2187932B1 (en) 2007-08-07 2015-01-28 DePuy Synthes Products, LLC Protein formulations comprising gdf-5 in aqueous acidic solution
CN102026619A (zh) * 2008-04-14 2011-04-20 先进科技及再生医学有限责任公司 液体缓冲的gdf-5制剂
US8398611B2 (en) 2010-12-28 2013-03-19 Depuy Mitek, Inc. Compositions and methods for treating joints
US8524662B2 (en) 2010-12-28 2013-09-03 Depuy Mitek, Llc Compositions and methods for treating joints
US8455436B2 (en) 2010-12-28 2013-06-04 Depuy Mitek, Llc Compositions and methods for treating joints
US8623839B2 (en) 2011-06-30 2014-01-07 Depuy Mitek, Llc Compositions and methods for stabilized polysaccharide formulations
US9682099B2 (en) 2015-01-20 2017-06-20 DePuy Synthes Products, Inc. Compositions and methods for treating joints

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996033251A1 (en) * 1995-04-19 1996-10-24 Minnesota Mining And Manufacturing Company Liquid crystal compounds having a chiral fluorinated terminal portion

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1338663C (en) * 1988-04-08 1996-10-22 Hermann Oppermann Biosynthetic osteogenic proteins and osteogenic devices containing them
CA2141555C (en) * 1992-07-31 2007-03-27 William K. Jones Morphogenic protein soluble complex and composition thereof
JP3570558B2 (ja) * 1993-05-01 2004-09-29 持田製薬株式会社 Ｄｎａ断片およびそれを含むベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体、該ベクターを用いる蛋白質の産生方法
US5385887A (en) * 1993-09-10 1995-01-31 Genetics Institute, Inc. Formulations for delivery of osteogenic proteins
US5399677A (en) * 1993-12-07 1995-03-21 Genetics Institute, Inc. Mutants of bone morphogenetic proteins
BR9608019A (pt) * 1995-04-19 1999-11-30 Hoechst Japan Uma nova proteína e um processo para a preparação da mesma'

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996033251A1 (en) * 1995-04-19 1996-10-24 Minnesota Mining And Manufacturing Company Liquid crystal compounds having a chiral fluorinated terminal portion

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., Vol. 204, No. 2, (1994), GERTRUD HOTTEN et al., "Cloning and Expression of Recombinant Human Growth/Differentiation Factor 5", p. 646-652. *
FEBS LETTERS, Vol. 345, (1994), MILTON H. WERNER et al., "Refolding Proteins by Gel Filtration Chromatography", p. 125-130. *
MOLECULAR IMMUNOLOGY, Vol. 32, No. 12, (1995), JUNGBAO YANG et al., "A Genetically Engineered Single-Chain FV/TNF Molecule Possesses the Anti-Tumor Immunoreactivity of FV as Well as the Cytotoxic Activity of Tumor Necrosis Factor", p. 873-881. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7811793B2 (en) * 1996-12-25 2010-10-12 Biopharma Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh Process for preparing purified active monomer of bone-derived factor
WO2001075095A1 (fr) * 2000-03-30 2001-10-11 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de production de proteine de recombinaison
JP2007114049A (ja) * 2005-10-20 2007-05-10 Denka Seiken Co Ltd アッセイ用媒体及びアッセイ方法

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