KR20000062328A - 정제된 골 유도 인자 이량체의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 정제된 골 유도 인자 이량체의 제조 방법에 관한 것이다. 유전자 공학적 방법에 의해 생성된 골 유도 인자의 봉입체로부터 하기 공정 a) 내지 e)를 순차적으로 수행하여 정제된 골 유도 인자 이량체가 얻어진다.
a) 골 유도 인자의 봉입체를 변성제로 처리하여 가용화 단량체를 얻는 공정,
b) 얻어진 가용화 단량체를 리폴딩 용액으로 처리하여 이량체를 얻는 공정,
c) 리폴딩한 이량체를 한외 여과 및 용매 치환 처리하는 공정,
d) 상기 처리에 의해 얻어진 이량체 용액을 등전점 침전 처리하는 공정, 및
e) 등전점 침전 처리한 이량체를 역상 크로마토그래피 처리하는 공정.
Description
골 기질에 단백질성의 골 유도 인자가 존재한다는 것이 발견되었고(Science 150, pp. 893-899, 1965), 이는 골 유도 단백질(bone morphogenetic protein)(이하, BMP라 함)로 명명되었다. 근래에 복수의 BMP 관련 유전자가 클로닝되어, 모두 형질 전환형 성장 인자-β(이하, TGF-β라 약칭) 상부류(superfamily)에 속한다는 것이 알려져 있다. 이들 중 몇가지는 유전자 공학에 의해 재조합체로서 생성되고, 이것을 이용하여 골 유도 활성이 확인되어, 골 질환 치료에 대한 응용이 기대되고 있다.
이들 인자 중, 최근 발견된 인간 유래의 BMP 부류에 속하는 GDF-5(MP52) (Biochem. Biophys. Res. Commun. 204, pp.646-652, 1994)는 동물 실험에 의해 골 유도 인자로서 유효하다는 것이 확인되고, 또한 유전자 재조합 대장균에 의한 발현으로 대량으로 생산하는 기술이 시도되고 있다. 그러나, 대장균 등에 대량으로 발현시켰을 경우, 예를 들면 1 리터 배양액 중 수 그램의 단백질을 생성시켰을 경우, 목적 단백질은 일반적으로 불활성인 불용성 봉입체(과립체, inclusion body)를 형성하기 쉽다. 이 봉입체는 단량체이며, 골 유도 인자로서 활성이 있는 이량체를 얻기 위해서는 이 봉입체를 가용화하여 본래의 구조인 이량체로 재생(일반적으로 리폴딩(refolding)이라는 조작)시키고, 분리 정제를 행하여 목적으로 하는 단백질을 얻을 필요가 있다.
MP52의 활성형은,
1) 수용액 중의 용해도가 낮아 변성제 존재하 또는 산성 조건하에서 취급해야 한다는 것
2) 분리에 사용되는 단백질이 액체 크로마토그래피용 담체에 비특이적으로 흡착되는 것
3) 리폴딩시에 불가결한 계면 활성제가 분리시의 장해가 되는 것
등의 문제를 안고 있어, 정제법의 확립은 매우 곤란하였다.
상기 문제를 해결하기 위하여 최근 개발된 정제법(국제 특허 공개 제WO 96/33215호)에서는
1. 봉입체를 변성제로 가용화하는 공정,
2. 이온 교환 크로마토그래피에 의한 분리 공정,
3. 술폰화 공정,
4. 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분리 공정,
5. 리폴딩 공정,
6. 등전점 침전에 의한 회수 공정,
7. 역상 크로마토그래피에 의한 분리 공정,
의 각 공정을 거쳐 단일 활성형 MP52를 얻고 있다.
그러나, 이 방법을 공업적 규모로 확대하기 위해서는
1) MP52 봉입체를 가용화하기 위한 변성제를 다량으로 소비하는 것, 또 그것에 의한 단백질의 치환(예를 들면 요소의 경우라면 카르바밀화 반응)을 유발하는 것,
2) 크로마토그래피의 담체, 특히 겔 여과 크로마토그래피에서는 예를 들면 세파크릴(Sephacryl) S-200HR, 수퍼덱스(Superdex) 200pg(모두 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech)사 제품)과 같은 고가의 것을 대량으로 사용하는 것,
3) 리폴딩시에 사용하는 시약, 특히 이량체화 반응에 빼놓을 수 없는 CHAPS와 산화형 글루타치온이 매우 고가라는 것,
4) 등전점 침전을 행할 때, 계면 활성제 농도를 내리기 위한 희석 조작을 행하기 위하여 액량이 커지는 것
등의 문제가 있다.
〈발명의 개시〉
본 발명의 목적은 상기 문제를 해결하는 것, 즉
1) 활성제의 사용을 극력 억제하고,
2) 크로마토그래피 담체의 사용량을 극력 억제하고,
3) 리폴딩시에 사용하는 시약을 다른 값싼 것으로 대체하고,
4) 계면 활성제의 선택적 제거에 의해 액량을 조정하는
것 및 이들에 부수되는 조작의 간략화, 즉 시간의 대폭 단축에 있다.
본 발명자들은 대장균에서 추출한 봉입체를 변성제 존재하에 가용화시킨 후, 희석 조작으로 리폴딩을 직접 행하고, 이어서 한외 여과함으로써 정제 공정의 간략화를 가능하게 하였다. 이 방법은 대장균에서 인간 인슐린을 제조하는 방법(유럽 특허 공개 제600372A1호)의 최초 공정과 유사한데, 골 유도 인자의 경우는 인간 인슐린과 같은 수용성 단백질과는 성질이 다르기 때문에 상기 인슐린 제조 방법을 그대로 골 유도 인자에 응용하기는 곤란하였다. 대량으로 생산하는 경우에는 상술한 바와 같이 이량체화된 MP52(활성형)는 용해성이 낮으며, 크로마토그래피 담체에 흡착되는 성질을 갖기 때문에, 인간 인슐린에서 사용하는 이온 교환 또는 소수 크로마토그패피 또는 상기 국제 특허 공개 제WO96/33215호에서 사용하는 겔 여과 크로마토그래피는 사용할 수 없다. 예를 들면, 이온 교환(파마시아 바이오테크, SP 세파로즈 (Sepharose) FF)을 사용했을 경우, 변성제를 사용하여 염 농도를 최대로 하여도 담체에 대한 흡착이 강하여 MP52는 완전히 용출되지 않는다. 겔 여과(파마시아 바이오테크, 세파크릴 S-200HR)를 사용했을 경우, 변성제를 사용하여도 담체에 대한 흡착이 강하고, 분획 범위가 극단적으로 확대되어버려 분리가 매우 나쁘다. 또한, CHAPS의 영향에 의해 담체의 성질이 변화되어 재현성이 없어진다. MP52가 용해될 수 있는 산성 용액에 의한 용출에 대해서도 마찬가지로, 결론적으로 담체 본래의 성질을 활용하여 사용할 수가 없다.
이상과 같이, 일반적인 수성계 크로마토그래피의 방법에서는 대량 생산의 경우, 목적 단백질의 정제를 할 수 없다는 것이 밝혀졌다. 유일하게 이용할 수 있는 것은 유기 용매를 사용한 역상 크로마토그래피뿐이었기 때문에, 칼럼을 많이 사용하지 않는 정제법을 개발할 필요가 있었다. 칼럼 이외의 정제법으로서는 황산 암모늄 분획법이 유망하다고 생각되었다. 그러나, 정제 효과가 작다는 것, 또한 그런 까닭에 불필요한 수율 저하를 초래하므로 그 방법은 사용하지 않고, pH 조절에 의한 등전점 침전법을 사용하여 실제 조작전에 한외 여과 공정을 행하고, 계면 활성제의 CHAPS를 제거하여, 액량을 증가시키지 않고 등전점 침전을 행할 수 있도록 하였다. 종래는 CHAPS가 존재하고 있으면 단백질의 용해도가 크기 때문에 침전이 일어나지 않아 희석 조작에 의해 CHAPS 농도를 저하시켰으나, 그렇게 하면 액량이 대폭적으로 증가되고 그것이 정제 공정상 문제가 되고 있었다.
본 발명은 유전자 공학적 방법에 의해 생성된 골 유도 인자의 봉입체로부터 하기 공정 a) 내지 e)를 순차적으로 수행하여 정제된 골 유도 인자 이량체를 얻는 것을 특징으로 하는 골 유도 인자 이량체의 제조 방법으로 이루어진다.
a) 골 유도 인자 봉입체를 변성제로 처리하여 가용화 단량체를 얻는 공정,
b) 얻어진 가용화 단량체를 리폴딩 용액으로 처리하여 이량체를 얻는 공정,
c) 리폴딩한 이량체를 한외 여과 및 용매 치환 처리하는 공정,
d) 상기 처리에 의해 얻어진 이량체 용액을 등전점 침전 처리하는 공정, 및
e) 등전점 침전 처리한 이량체를 역상 크로마토그래피 처리하는 공정.
유전자 공학적 방법에 의해 생성된 골 유도 인자의 봉입체로서는 유전자 공학적 방법으로 대장균에 발현시킨 것이 바람직하다.
골 유도 인자를 대장균에 발현시킨 경우, 균체를 완충액으로 현탁하여 균체 파쇄 장치로 분쇄하고, 원심 분리에 의해 봉입체를 회수한다. 봉입체를 세정 성분 함유 완충액, 예를 들면 트리톤(Triton) X-100, 또는 요소로 3회 이상 세정한 후, 원심 분리를 하여 1차로 정제된 봉입체를 얻는다.
골 유도 인자 봉입체를 변성제로 처리하여 가용화 단량체를 얻는 공정은 변성제를 포함하는 용액에 봉입체를 첨가하고, 교반하여 용해시킴으로써 실시된다. 변성제를 포함하는 용액으로서는 종래 공지된 것, 예를 들면 8 M 요소 또는 6 M 염산 구아니딘 등을 포함하는 50 mM 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 10.7)등이 사용된다.
가용화 단량체를 리폴딩 용액으로 처리하여 이량체를 얻는 공정은, 위에서 얻어진 단백질 용액을 단백질 최종 농도로 0.1 내지 5.0 ㎎/mL, 바람직하게는 2.4 ㎎/mL가 되도록 희석하여 실시된다. 종래 변성제의 최종 농도가 1 M 이하가 되도록 희석되어 있었으나, 본 발명에서는 변성제의 최종 농도가 1 내지 4 M, 특히 2.4 M이 되도록 희석하는 것이 단백질의 응집, 침전을 방지하여 효율을 향상시키므로 바람직하다. 리폴딩 용액으로서는 종래 공지된 것, 예를 들면 콜산 또는 그의 유도체, 3-[(3-콜아미드프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술포네이트 (CHAPS), 타우로콜산 또는 그의 염, 타우로데옥시콜산 또는 그의 염, 바람직하게는 3-[(3-콜아미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트(CHAPS) 등의 계면 활성제; EDTA; 머캅토에탄올 또는 DTT 등의 환원제와 산화형 글루타티온과의 조합 또는 시스테인 등을 포함하는 완충액이 사용된다. 시스테인만을 사용하는 장점은 일반적으로 고가인 산화 시약을 사용할 필요가 없다는 것과 사용량을 적게 할 수 있다는 것 등이며, 따라서 시약 비용의 저하와 공정의 간략화를 기대할 수 있기 때문이다.
단백질의 응집, 침전을 방지하여 수율을 향상시키는데 효과를 발휘하는 다른 시약으로서 구아니디노기를 갖는 화합물을 들 수 있다. 예를 들면 구아니딘 염산염 또는 아르기닌 염산염 등이 있으며, 바람직하게는 아르기닌 염산염을 0.5 M이 되도록 미리 리폴딩 용액에 첨가한다. 표 1에는 첨가된 아르기닌 염산염의 효과를 나타낸다.
| 단백질 농도(g/L) | MP52 이량체(g/L) |
| 0.8*아르기닌 염산염 0.5 M 첨가 | 0.37 |
| 1.6 아르기닌 염산염 0.5 M 첨가 | 0.62 |
| 2.4 아르기닌 염산염 0.5 M 첨가 | 0.98 |
| 3.2 아르기닌 염산염 0.5 M 첨가 | 0.95 |
| 2.4 아르기닌 염산염 무첨가 | 단백질 응집이 일어남 |
| * 단백질 농도 0.8 g/L은 종래의 아르기닌 염산염 무첨가의 단백질 농도 상한치임. |
표 1에서, 아르기닌 염산염을 첨가하지 않으면 리폴딩 용액 중에서 단백질이 응집되어 침전되어 버리는데, 아르기닌 염산염의 첨가에 의해 리폴딩 용액당의 단백질량을 2.7배로 증가(즉, 0.37 g/L에서 0.98 g/L로 증량)시킨다는 것을 알 수 있었다. 완충액으로서는 인산, 트리스 염산을 사용한 완충액을 사용할 수도 있는데, pH 8 내지 10, 특히 pH 8.9의 아르기닌-수산화나트륨 완충액이 바람직하다.
리폴딩된 이량체를 한외 여과하는 공정은 리폴딩 종료 후 리폴딩 용액을 분자 분획량 1만인 필터, 예를 들면 PSU 10K(사르토리우스(Sartorius)사 제품)를 사용하여 농축시킴과 동시에 산 용액, 예를 들면 0.2 % 인산 용액으로 치환하여 CHAPS 농도를 저하시킨다.
용매 치환된 이량체를 등전점 침전 처리하는 공정은 얻어진 이량체 용액에 알칼리, 예를 들면 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 7.4로 조절하고, 골 유도 인자를 선택적으로 침전시킴으로써 실시된다. pH 조절 후 용액을 1시간 이상 방치하고, 원심 분리 또는 여과하여 상등액을 제거하고, 침전물을 산 용액, 예를 들면 50 mM 시트르산, 0.2 % 인산 또는 0.05 % 트리플루오로아세트산 용액에 용해한다.
등전점 침전 처리한 이량체를 역상 크로마토그래피 처리하는 공정은, 위에서 얻어진 산성 용액을 고압 액체 크로마토그래피에 걸어 유기 용매, 예를 들면 이소프로판올, 아세토니트릴 또는 에탄올 0 내지 55 %의 구배액으로 용출시키고, 골 유도 인자 이량체의 분획을 채취함으로써 실시된다. 고압 액체 크로마토그래피의 담체로서는 고분자계 담체, 예를 들면 소스(SOURCE) 15 RPC(6 ㎝ψ×20 ㎝, 파마시아 바이오텍사 제품)가 사용된다.
본 발명에서의 골 유도 인자로서는 MP52, BMP-2, BMP-4, BMP-6 또는 BMP-7로 이루어지는 군에서 선택되는 것 중 어느 하나의 단일한 분자량으로 구성되는 골 유도 인자가 적합하게 사용된다. 예를 들면, 인간 MP52 전구체를 코딩하는 cDNA를 도입한 대장균주(구체적으로는 성숙형 MP52의 N 말단의 알라닌을 제거한 119 잔기로 이루어지는 MP52 배열의 5' 말단에 메티오닌을 코딩하는 코돈을 결합시킨 플라스미드를 도입한 대장균)를 사용하고, 이것을 배양하여 성숙형 MP52 단량체를 봉입체로 하여 다량으로 생성시키고, 그 봉입체로부터 본 발명의 제법을 사용하여 고순도의 성숙형 MP52를 얻을 수가 있다.
본 발명은 정제된 골 유도 인자 이량체의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 유전자 공학적 방법에 의해 생성된 골 유도 인자의 봉입체로부터 정제된 골 유도 인자 이량체를 얻는 것을 특징으로 하는 골 유도 인자 이량체의 제조 방법에 관한 것이다.
이어서, 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 조작은 단백질의 안정성을 고려하여 (2) 내지 (4)까지는 4 ℃의 저온실에서 행한다. 각각의 공정 내용을 이하에 기재한다.
(1) 인간 MP52의 배양과 봉입체의 예비 정제
국제 특허 공개 제WO96/33215호의 실시예 2와 마찬가지로 하여 얻어진 MP52-생성 대장균을 변성 SOC 배지에서 전배양한 후, 생성용 배지 100 L에 전배양액을 접종하였다. 대수 증식 초기에 1 mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 유도를 하고, OD550=150까지 32 ℃에서 배양하였다. 그 후, 집균하고, 균체를 25 mM 트리스-염산(pH 7.3), 10 mM EDTA-4Na를 포함하는 완충액에 현탁하여 균체 파쇄 장치(만톤 골린(Manton Gaulin)사 제품)로 파쇄하고, 원심 분리에 의해 봉입체를 회수하였다. 봉입체를 세정 성분 함유 완충액으로서 1 M 요소로 세정한 후, 원심 분리를 하여 예비 정제된 봉입체를 얻었다.
(2) 봉입체의 가용화 및 리폴딩
상기에 의해 얻어진 봉입체의 습중량 100 g을 8 M 요소 및 5 mM 에틸렌디아민-테트라아세테이트를 포함하는 50 mM 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 8.9) 300 mL에 첨가하여 교반 용해하였다(단백질 농도는 약 18 ㎎/mL). 이 봉입체 용해액을 리폴딩 완충액 [0.5 M 아르기닌-수산화나트륨(pH 8.9), 4.8 mM 시스테인 염산염-수화물, 0.5 M 염화나트륨, 20 mM CHAPS]로 6.7배 희석(단백질 농도 2.4 ㎎/mL가 되도록)하여 리폴딩을 행하였다. 그대로 4 ℃에서 20시간 정도 방치하였다.
(3) 리폴딩 후의 MP52의 정제(한외 여과)
리폴딩 반응이 종료된 MP52를 분자 분획량 1만인 필터(PSU 10K, 잘토리우스사 제품)를 사용하여 5배로 농축시킴과 동시에 0.2 % 인산 용액으로 5배 희석하여 용매 치환하였다. 이 조작을 3회 반복함으로써 논리적으로는 CHAPS 농도가 100배 이상으로 희석되었다.
(4) 리폴딩 후의 MP52의 정제(등전점 침전)
용매 치환된 리폴딩 용액에 수산화나트륨 용액을 첨가함으로써 pH를 7.4로 조정하여 등전점 침전을 행하였다. 용액이 백탁된 후 1시간 이상 방치하고, 이어서, 원심 분리(10,000 g×15분)를 행하여 침전물을 회수하였다. 침전물을 0.2 % 인산 용액에 용해하였다.
(5) 리폴딩 후의 MP52의 정제(역상 크로마토그래피)
인산 용액에 용해한 MP52를 역상 크로마토그래피로 이량체 이외의 성분 분리를 행하였다. 담체로서 소스 15 RPC(6 ㎝ψ×20 ㎝, 파마시아 바이오테크사 제품)를 사용하여 고속 액체 크로마토그래피 장치로 운전하고, 에탄올 0 내지 50 %의 구배액으로 용출시켜 MP52 이량체의 분획을 회수하였다.
이상의 정제법에 의해 표 2에 나타내는 고수율로 활성형 MP52를 회수하는데 성공하였다. 정제한 각 공정의 MP52의 양은 전기 영동 겔의 CBB 염색 화상 주사 정량법으로 구하였다.
| 공정 | MP52(g) | 수율(%) |
| 용해 | 5.4 | 100 |
| 리폴딩 | 2.2 | 41 |
| 한외 여과 | 1.6 | 30 |
| 등전점 침전 | 1.5 | 29 |
| 역상 크로마토그래피 | 1.1 | 21 |
각 공정의 장점의 하나로서 정제에 따른 비용의 절감 효과를 들 수 있다. 시산에 의하면, 국제 특허 공개 제WO96/33215호와 비교하여 단백질 당 제조 단위가 약 절반이 되기 때문에 공업화에서 매우 유익한 정제법이다.
본 발명의 제조 방법에 따르면, 단일한 분자량으로 이루어지는 골 유도 인자 이량체를 효율좋게 대량으로 또한 종래법에 비해 저렴하게 생성할 수 있다.
Claims (6)
- 유전자 공학적 방법에 의해 생성된 골 유도 인자의 봉입체로부터 하기 공정 a) 내지 e)를 순차적으로 수행하여 골 유도 인자 이량체를 얻는 것을 특징으로 하는 정제된 골 유도 인자 이량체의 제조 방법.a) 골 유도 인자의 봉입체를 변성제로 처리하여 가용화 단량체를 얻는 공정,b) 얻어진 가용화 단량체를 리폴딩 용액으로 처리하여 이량체를 얻는 공정,c) 리폴딩한 이량체를 한외 여과 및 용매 치환 처리하는 공정,d) 상기 처리에 의해 얻어진 이량체 용액을 등전점 침전 처리하는 공정, 및e) 등전점 침전 처리한 이량체를 역상 크로마토그래피 처리하는 공정.
- 제1항에 있어서, 상기 봉입체가 유전자 공학적 방법에 의해 대장균에 발현시킨 골 유도 인자의 봉입체인 제조 방법.
- 제1 또는 2항에 있어서, 변성제의 최종 농도가 1 내지 4M인 제조 방법.
- 제1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 리폴딩 용액이 단백질 1 ㎎ 당 0.1 내지 1.0 ㎎/mL 농도의 시스테인 또는 그의 염, 0.1 내지 1.5 M 농도의 염화나트륨, 5 내지 100 mM 농도의 콜산 또는 그의 유전체로 이루어지는 완충액이며, 그의 pH가 8 내지 10의 범위인 제조 방법.
- 제4항에 있어서, 리폴딩 용액이 구아니디노기를 갖는 화합물 또는 그의 염을 더 포함하는 완충액인 제조 방법.
- 제1 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 골 유도 인자가 MP52, BMP-2, BMP-4, BMP-6 및 BMP-7로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 골 유도 인자인 제조 방법.
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