JP2023018534A

JP2023018534A - 接着性タンパク質を調製する方法、接着性タンパク質及び接着剤組成物

Info

Publication number: JP2023018534A
Application number: JP2021122735A
Authority: JP
Inventors: 淳小倉; Atsushi Ogura; 悠太郎河上; Yutaro Kawakami
Original assignee: Novelgen Co Ltd; Kansai Bunri Sogo Gakuen
Current assignee: Novelgen Co Ltd; Kansai Bunri Sogo Gakuen
Priority date: 2021-07-27
Filing date: 2021-07-27
Publication date: 2023-02-08

Abstract

【課題】接着性タンパク質の効率的な調製方法を提供する。【解決手段】ＤＯＰＡ含有接着性タンパク質を調製する方法であって、前記タンパク質をコードする遺伝子を含む形質転換大腸菌の高密度培養物に、０．１～１ｍＭの濃度のＩＰＴＧを用いて前記遺伝子の発現を誘導する誘導工程と、前記発現誘導された菌体を、タンパク質変性剤を含有する溶液を用いて可溶化する可溶化工程と、前記可溶化された菌体溶液中の前記遺伝子産物を、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ担体に吸着させ、競合剤により溶出させる精製工程と、前記溶出液を、５％未満の酢酸を含有する溶液に対して透析する透析工程と、を含む方法。【選択図】なし

Description

本発明は、接着性タンパク質の調製方法に関する。より詳しくは、本発明は、医療用接着剤等として有用な接着性タンパク質の調製方法に関する。

イガイ類（Ｍｙｔｉｌｕｓｅｄｕｌｉｓ、Ｍ．ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ、Ｍ．ｃｏｒｕｓｃｕｓ等）は、水中で接着能を有する特殊な接着性タンパク質（ＭＡＰｓ）を分泌することにより、海洋で基材に固着することができる。イガイ由来の接着性タンパク質は、高レベルの３，４－ジヒドロキシフェニル－Ｌ－アラニン（ＤＯＰＡ）残基を含み、ＤＯＰＡの含有量は、ＭＡＰｓの接着強度と直線状に相関することが報告されている。さらに、ＤＯＰＡ残基に由来するカテコール基がその接着能に極めて重要であることが明らかにされている。

この接着性タンパク質は、耐水性、生体適合性であること等から、医療用バイオ接着剤等として利用されることが期待され、研究及び応用が進められている。いくつかの発現系により機能的組換え体ＭＡＰｓが作製されてきた。しかし、生産収率及び精製収率が低く、その実用性は限定的であった。

特表２００８－５０４０１６号公報

Ｈｗａｎｇ，ｅｔａｌ．，"Ｐｒａｃｔｉｃａｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｙｂｒｉｄｍｕｓｓｅｌｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅｆｐ－１５１"，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．２４，ｐｐ．３５６０－３５６８，２００７Ｈｗａｎｇ，ｅｔａｌ．，"ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭｕｓｓｅｌＡｄｈｅｓｉｖｅＰｒｏｔｅｉｎＴｙｐｅ３ＡｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ"，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２００５，２１，９６５－９７０

本発明は、効率的な接着性タンパク質の調製方法を提供することを目的とする。

本発明者らは前記課題について鋭意研究した結果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の第一の態様によれば、
ＤＯＰＡ含有接着性タンパク質を調製する方法であって、
前記タンパク質をコードする遺伝子を含む形質転換大腸菌の高密度培養物に、０．１～１ｍＭの濃度のＩＰＴＧを用いて前記遺伝子の発現を誘導する誘導工程と、
前記発現誘導された菌体を、タンパク質変性剤を含有する溶液を用いて可溶化する可溶化工程と、
前記可溶化された菌体溶液中の前記遺伝子産物を、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ担体に吸着させ、競合剤により溶出させる精製工程と、
前記溶出液を、５％未満の酢酸を含有する溶液に対して透析する透析工程と、
を含む方法が提供される。

本発明の第二の態様によれば、
ＤＯＰＡ含有接着性タンパク質を調製する方法であって、
前記タンパク質をコードする遺伝子を含む形質転換大腸菌の高密度培養物に、０．１～１ｍＭの濃度のＩＰＴＧを用いて前記遺伝子の発現を誘導する誘導工程と、
前記発現誘導された菌体を、タンパク質変性剤を含有する溶液を用いて可溶化する可溶化工程と、
前記可溶化された菌体溶液中の前記遺伝子産物を、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ担体に吸着させ、競合剤により溶出させる精製工程と、
前記溶出液を、５％未満の酢酸を含有する溶液に対して透析する透析工程と、
前記透析後の前記遺伝子産物中のチロシン残基をＤＯＰＡに置換するＤＯＰＡ置換工程と
を含む方法が提供される。

前記第一の態様及び第二の態様において、前記大腸菌の高密度培養物は、ＯＤ６００＝０．６～２．０、１．０～２．０、又は１．５～２．０であることができる。

前記第一の態様及び第二の態様において、前記タンパク質変性剤は、６～８Ｍの尿素であることができる。

前記第一の態様及び第二の態様において、前記競合剤は、イミダゾールであることができる。

前記第一の態様及び第二の態様において、前記透析工程は、前記可溶化工程において使用したタンパク質変性剤を含む酢酸溶液に対して透析する第一の透析と、その後に前記タンパク質変性剤を含まない酢酸溶液に対して透析する第二の透析とを含むことができる。

上述した第一の態様及び第二の態様の調製方法によって、ＤＯＰＡ含有接着性タンパク質が提供される。さらに、ＤＯＰＡ含有接着性タンパク質を含む接着剤組成物が提供される。

本発明によれば、医療用接着剤・美容用接着剤等として有用な接着性タンパク質を簡便な工程で効率的に調製することが可能となる。

図１は、ＦＰ１５１発現量に対する発現誘導時間及びＩＰＴＧ濃度の影響を表す図である。図２は、ＦＰ１５１発現量に対するＩＰＴＧ濃度（１．０ｍＭ）の影響を表すＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの写真の図である。パネルＡ、Ｂ、Ｃはそれぞれ独立した実験の結果である。図３は、ＦＰ１５１発現量に対するＩＰＴＧ濃度（０．１ｍＭ）の影響を表すＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの写真の図である。パネルＡ、Ｂ、Ｃはそれぞれ独立した実験の結果である。図４は、ＦＰ１５１発現量に対する発現誘導時の菌体密度（高密度）の影響を表すＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの写真の図である。パネルＡ、Ｂ、Ｃはそれぞれ独立した実験の結果である。図５は、ＦＰ１５１発現量に対する発現誘導時の菌体密度（低密度）の影響を表すＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの写真の図である。パネルＡ、Ｂ、Ｃはそれぞれ独立した実験の結果である。図６は、ＦＰ１５１を、酢酸を用いた可溶化及び凍結乾燥、及び低ｐＨ緩衝液を用いた溶出により調製した結果を表すＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの写真の図である。図７は、ＦＰ１５１を、酢酸を用いた可溶化及び凍結乾燥、及び低ｐＨ緩衝液を用いた溶出の後、さらにイミダゾールを用いた溶出を行って調製した結果を表すＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの写真の図である。図８は、ＦＰ１５１を、尿素を用いた可溶化、及びイミダゾールを用いた溶出により調製した結果を表すＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの写真の図である。図９は、Ｍｆｐ３（Ｓ）を、尿素を用いた可溶化、低ｐＨ緩衝液を用いた溶出、及びその後のイミダゾールを用いた溶出により調製した結果を表すＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの写真の図である。図１０は、Ｍｆｐ３（Ｆ）を、尿素を用いた可溶化、及び低ｐＨ緩衝液を用いた溶出、及びその後のイミダゾールを用いた溶出により調製した結果を表すＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの写真の図である。

以下、本発明について詳述する。

＜発現ベクター及び形質転換体＞
本発明において使用される遺伝子は、接着性タンパク質をコードするものであれば特に制限はない。接着性タンパク質としては、チロシン残基を多く含むアミノ酸配列が好ましく、例えば接着性タンパク質のアミノ酸配列中に２％以上、１０％以上、又は２０％以上のチロシン残基を含むアミノ酸配列を有するものが好ましい。チロシン残基の含有量は、４０％以下、３５％以下、又は３０％以下であることができる。接着性タンパク質の遺伝子は、例えば、イガイ類から単離されたＦＰ（ｆｏｏｔｐｒｏｔｅｉｎ）－１～ＦＰ－６の天然の配列を有するものであってもよく、それらを改変した配列、二種以上のＦＰの融合配列等を有する組換え体をコードする遺伝子であってもよい。これらの遺伝子は、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ精製のためにヒスチジンタグ（Ｈｉｓ-ｔａｇ；６～１０個程度のポリヒスチジンのタグ）をコードする配列を含むように改変される。なお、上記アミノ酸配列中のチロシン残基の含有量は、Ｈｉｓ-ｔａｇ等の付加的配列及び開始コドンを含まないアミノ酸残基数を１００％として算出される。

具体的には、例えば、組換えタンパクであるＦＰ１５１（チロシン残基２２．６％）、Ｍｆｐ３（Ｓ）（チロシン残基２４．４％）、Ｍｆｐ３（Ｆ）（チロシン残基２３．８％）が挙げられる。ＦＰ１５１は、ムラサキイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ）由来のＦＰ１及びＦＰ５の融合タンパク質である。配列的特徴は、ＦＰ５モチーフの両末端側に、ＦＰ１に由来するモチーフが６回リピートした配列が付加されている（非特許文献１）。Ｍｆｐ３（Ｓ）は、Ｍｙｔｉｌｕｓｃａｌｉｆｏｒｎｉａｎｕ由来の接着性タンパク質でシグナルペプチドを除いた４５残基のタンパク質である。配列的特徴はチロシン及びグリシンなどのアミノ酸を多く含む。Ｍｆｐ３（Ｆ）は、Ｍｙｔｉｌｕｓｃａｌｉｆｏｒｎｉａｎｕ由来の接着性タンパク質でシグナルペプチドを除いた４２残基のタンパク質である。配列的特徴はチロシン及びグリシン、リジンなどのアミノ酸を多く含む。

このような遺伝子を含む発現ベクターは、選択した遺伝子を公知の発現ベクターに挿入することにより、公知の方法で構築することができる。発現誘導を行うためのｌａｃプロモーター又はｔａｃプロモーターを持つ発現ベクターが好ましい。ｐＥＴシステムが利用可能なプラスミド、すなわち、Ｔ７プロモーターにより発現制御される発現ベクターが特に好ましい。

宿主としては、大腸菌の各種菌株を使用することができる。染色体にλファージＤＥ３が溶原化され、ｌａｃＵＶ５プロモーターに制御されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する株が望ましい。具体的には、例えばＢＬ２１（ＤＥ３）、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）が挙げられる。

培地は、大腸菌の培養が可能な培地であればよく、使用する宿主に合わせて適宜選択して使用することができ、例えば、ＬＢ培地、ＹＴ培地等の公知の培地を使用することができる。

発現ベクターで宿主を形質転換して形質転換体を得る方法及び形質転換体を選択し、培養する方法は、公知である。例えば、適量（例えば５～５０ｎｇ）のプラスミドを、エレクトロポレーション法により大腸菌に導入することができる。形質転換体の選択は、好適な抗生物質等を使用することにより容易に行うことができ、例えば、接着性タンパク質遺伝子がｐＥＴ２２ｂベクターに導入されている場合はアンピシリン含有のＬＢ培地にて選択することができる。

タンパク発現のための培養は、得られた形質転換体又はそのストックを公知の方法でスケールアップして培養することにより行うことができる。培養条件は宿主に合わせて適宜選択することができ、大腸菌は、一般に、３０～３７℃で好気的に培養することができる。

＜誘導工程＞
本発明に係る一態様の方法においては、形質転換体の培養の特定の時点、すなわち細胞が高密度になった時点で発現誘導を行う。例えば、大腸菌の場合、６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）で表される密度が０．６以上、例えば０．６～２．０、好ましくは１．０～２．０、さらに好ましくは１．５～２．０に達した時点に誘導を開始することができる。誘導を開始する時点の細胞密度が高いと、低密度（すなわちＯＤ６００＜０．６）の場合と比較して目的のタンパク質の収量を３～５倍程度に増大させることができる。

誘導は、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培地に添加することにより開始する。培地中のＩＰＴＧの最終濃度は、０．１～１ｍＭとなるように添加することができる。０．１～０．８ｍＭが好ましく、さらには０．１～０．５ｍＭであることが好ましい。０．１ｍＭ程度までの低濃度の使用は、より高濃度で誘導した場合と同等量又はそれ以上のタンパク質が得られるうえ、コスト削減になるため好ましい。

ＩＰＴＧ添加後、培養温度で培養を継続することにより発現を誘導する。誘導時間は、１～２０時間、好ましくは４～１４時間、さらに好ましくは６～１４時間であることができる。ある条件下では、誘導時間は、１０時間程度でタンパク質収量が最大となるため、８～１２時間が好ましい。

誘導終了後、細胞を常法により回収する。必要に応じて回収した細胞ペレットを緩衝液等で洗浄してもよい。

＜可溶化工程＞
本発明に係る一態様の方法においては、回収した細胞を、タンパク質変性剤を用いて可溶化する。タンパク質変性剤としては、カオトロピック剤が好ましく、６～８Ｍ程度の濃度の尿素又は塩酸グアニジンが好ましい。タンパク質変性剤を含有する溶液は、タンパク質変性剤を含有する水溶液、水性溶液、又は緩衝液であることができる。

可溶化は、溶液成分が析出しない温度で行うことができ、室温で行うことが好ましい。可溶化工程の時間は、例えば１時間以上とすることができ、１２時間以内であることが好ましい。一般に２～１０時間が望ましく、６～８時間程度がさらに望ましい。１２時間を超えると粘性が高くなり、ろ過を行う場合にはろ過が困難になることがある。タンパク質変性剤の添加割合は、培養液１００ｍＬあたりの大腸菌ペレットに対して１０～４０ｍＬ程度であることができ、１５～３５ｍＬが好ましい。

従来の方法では、細胞を可溶化するために酢酸を使用していたが、酢酸が存在すると、その後の精製が困難になる。そのため、精製前に凍結乾燥及び緩衝液置換等の酢酸除去工程が必要になる。さらに、酢酸は、これらの工程において乾燥機の金属を腐食させる恐れがある。本発明に係る一態様の方法においては、精製前に酢酸を使用せず、尿素等を使用することにより、凍結乾燥及び緩衝液置換を回避することができる。

＜精製工程＞
本発明に係る一態様の方法においては、形質転換体細胞の可溶化された溶液（ライセート）を、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＭｅｔａｌＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＩＭＡＣ））を使用して精製することができる。金属イオンとしては、銅、ニッケル、亜鉛、コバルトが一般に使用され、担体としては、Ｎｉ－ＮＴＡ（ｎｉｃｋｅｌ－ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）アガロース、セファロース（登録商標）等を使用することができる。固定化金属アフィニティクロマトグラフィによる精製は、変性条件下で行うことができ、可溶化工程で使用したものと同じタンパク質変性剤を用いることが好ましい。

本発明に係る一態様の方法においては、溶出は、ヒスチジンよりも金属との親和性の高い競合剤、典型的にはイミダゾールを使用して行う。溶出液は、少なくとも、競合剤、例えば０．１～１Ｍ程度の濃度のイミダゾールと、上記のタンパク質変性剤、例えば６～８Ｍ程度の尿素とを含有する溶液（水溶液、水性溶液又は緩衝液）であることができる。溶出は、変性条件下、弱アルカリ性（ｐＨ８．０付近）条件下で、溶液成分が析出しない温度、好ましくは室温で行うことができる。したがって、具体的には、例えば５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、８Ｍ尿素、０．５Ｍイミダゾールの溶液を使用することができる。

本発明に係る一態様の方法においては、溶出時にイミダゾール等の競合剤を使用することにより、安定的に精製が可能になる。Ｈｉｓ－ｔａｇ精製に用いられる溶出方法としてはｐＨ低下により担体のｐＫａをヒスチジンのｐＫａ以下にすることで目的タンパク質を解離させる方法があるが、接着性タンパク質に関してはｐＨ低下による溶出は不適であることが判明した。これは、ｐＨ低下により、接着性タンパク質が担体やカラム内表面に接着するようになることがあるためと考えられる。

回収された画分について、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）等を行うことにより、目的のタンパク質の存在及び精製の程度を確認することができる。

＜透析工程＞
本発明に係る一態様の方法においては、目的のタンパク質を含む画分を集めて、透析を行うことにより精製に使用した不要な成分を除去する。透析は、溶液成分が析出しない温度で行うことができ、室温で行うことが好ましい。分子量カットオフ値は、目的のタンパク質の分子量に応じて適宜選択することができ、例えばＦＰ１５１については６，０００～８，０００Ｄａ、Ｍｆｐ３（Ｓ）及びＭｆｐ３（Ｆ）については３，５００Ｄａとすることができる。

従来の５％酢酸溶液による透析は、接着性タンパク質の凝集が起こりやすいことが判明した。したがって、本発明に係る一態様の方法においては、それより低濃度の酢酸を含有する溶液（水溶液、水性溶液又は緩衝液）が使用される。具体的には、酢酸の濃度は、０．０１～３％が好ましく、０．１～１％程度であることがさらに好ましい。さらに、透析を二段階で行い、第一段階では可溶化に使用したタンパク質変性剤を含む低濃度の酢酸溶液を使用して緩衝液を酢酸溶液に交換し、第二段階でタンパク質変性剤を含まない低濃度の酢酸溶液を使用することにより、タンパク質の凝集をさらに防止することができる。あるいは、透析を三段階以上で行い、第一段階では可溶化に使用したタンパク質変性剤を含む低濃度の酢酸溶液を使用し、第二段階以降でタンパク質変性剤の濃度を次第に低減させ、最終的にタンパク質変性剤を含まない低濃度の酢酸溶液に対して透析してもよい。第一段階の透析において、タンパク質変性剤としては、可溶化及び／又は溶出液に使用したものと同じタンパク質変性剤を、可溶化及び／又は溶出液に使用した濃度と同じ濃度で用いることが好ましい。また、各段階の透析時間は、透析する試料及び使用する外液の容量などに応じて適宜選択することができる。例えば、１～３回外液を交換し、各回１～１２時間、さらには４～８時間程度が望ましい。

本発明に係る一態様の方法は、必要に応じて、菌体破砕（例えば超音波処理）、洗浄、濃縮、ろ過等の工程を、透析工程の前の任意の時点にさらに含んでもよい。

＜ＤＯＰＡ置換工程＞
精製した接着性タンパク質を、チロシナーゼによるＤＯＰＡ置換工程に供することにより、接着性タンパク質の粘性をさらに高めることができる。ＤＯＰＡ置換工程において、接着性タンパク質中のチロシンは、ホウ砂、アスコルビン酸、及びチロシナーゼを含む反応系において反応させることにより、ＤＯＰＡに置換される。ホウ砂はタンパク系間の錯体形成に役立ち、アスコルビン酸はＤＯＰＡ置換の際の電子供与として役立つ。具体的には、例えば、２５ｍＭホウ砂、２０ｍＭアスコルビン酸、及び１０～１００μｇ／ｍＬの濃度範囲のチロシナーゼを含む溶液中で、接着性タンパク質（１ｍｇ／ｍＬ）を室温（２０～３０℃の範囲内）で１時間反応させることにより、ＤＯＰＡ置換を行うことができる。

ＤＯＰＡ置換された接着性タンパク質は、限外濾過（ポアサイズ３ｋ又は１０ｋＤａ）により２０倍濃縮後に等量の１Ｍ塩化カルシウム水溶液を添加し、遠心分離して回収することで粘性化した接着性タンパク質を得ることができる。

＜接着剤組成物＞
本発明に係る一態様の方法により調製した接着性タンパク質を使用して、接着剤組成物を製造することができる。本発明の接着性タンパク質は、生体適合性であり、安全性が高いため、医療用接着剤として使用したり、化粧又は美容用の接着剤として生体に使用することができる。

このような用途の接着剤は、生体に使用可能な公知の賦形剤、界面活性剤、酸化剤及び充填剤等の成分を含む組成物とすることができる。界面活性剤は陽イオン性、陰イオン性、非イオン性、両性界面活性剤等のいずれであってもよい。酸化剤としては、チロシナーゼ、カテコールオキシダーゼ、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ビス（スルホスクシニミディル）スベレート、３，３’－ジチオビス（スルホスクシニミディルプロピオネート）、過酸化水素等が挙げられる。充填剤としては、コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイタンスルフェート、エラスチン、ラミニン、カゼイン、ヒドロキシアパタイト、アルブミン、フィブロネクチン及びヒブリン等が挙げられる。

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（１．ＦＰ１５１発現におけるＩＰＴＧ濃度の影響評価（１））
菌株として、ｐＥＴ２２ｂベクター上にＦＰ１５１遺伝子を含む発現プラスミドとしてｐＥＴ２２ｂ＿ＦＰ１５１（ｐＥＴ２２ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、品番６９７４４）のクローニングサイトのＮｄｅ１及びＸｈｏ１の領域内にインサートＤＮＡ（ＦＰ１５１遺伝子）を挿入して作製したもの）を用いてエレクトロポレーション法により形質転換した大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）株）を使用した。

上記菌を、培地（２×ＹＴ培地、５００ｍＬ）に植菌し、３７℃で培養した。０．１ｍＭ又は１．０ｍＭのＩＰＴＧ濃度で、ＯＤ６００＝１．０の時点で発現誘導し、ＩＰＴＧ添加後、４、６、８、１０、１２、又は１４時間経過時点で８０ｍＬの培養物を、３０００×ｇ、１５分、４℃で遠心分離し、集菌した。

０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液で菌体を懸濁し、超音波破砕した。菌体破砕物を遠心分離（１１０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、不溶性画分を回収し、変性緩衝液（８Ｍ尿素、５０ｍＭトリス塩酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム）を２０ｍＬ加え、可溶化した。

ライセートを遠心分離（１１０００ｒｐｍ、３０分、室温）し、上清を０．４５μｍフィルターでろ過した。ろ液を、Ｎｉ^２+固定化カラムである「ＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ」（商品名、Ｃｙｔｉｖａ）を用いて組換えＦＰ１５１を吸着させ、０．５Ｍイミダゾール、８Ｍ尿素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、「０．５Ｍイミダゾール溶出緩衝液」ということがある）で溶出させた（Ｈｉｓ－ｔａｇ精製）。

精製画分を回収し、透析チューブ（商品名「スペクトラ／ポア１」（ＭＷＣＯ：６，０００～８，０００）、再生セルロース製、ＲＥＰＬＩＧＥＮ社）に入れて８Ｍ尿素、０．５％酢酸水溶液に対して透析した（１００ｍＬ中に１～２時間程度）。

「ＱｕｂｉｔＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙｋｉｔ」（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してタンパク濃度を測定し、回収液量から回収量を推定した。以下のすべてのタンパク質濃度測定は同様に行った。

各画分のサンプル（いずれもアプライ量は５μＬ）を１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。以下のすべての電気泳動は同様に行った。

結果を図１及び表１に示す（２回の実験の平均値である）。

培養液８０ｍＬあたりのタンパク質収量は、ＩＰＴＧ濃度０．１ｍＭで２．６～３．５ｍｇ、１ｍＭで２．９～３．４ｍｇであり、ＩＰＴＧ濃度に依存せずに２．６～３．５ｍｇ付近を示した。したがって、ＩＰＴＧ濃度は０．１～１．０ｍＭの範囲内ではタンパク質収量に影響を与えない可能性が示された。また、誘導時間に関しては、この実験結果からは４～１４時間の範囲内では収量に顕著な差は観察されず、この範囲であれば問題ないことがわかった。

（２．ＦＰ１５１発現におけるＩＰＴＧ濃度の影響評価（２））
菌株として、上記１．と同じ大腸菌を使用した。

上記菌を、培地（２×ＹＴ培地、４００ｍＬ）に植菌し、３７℃で培養した。０．１ｍＭ又は１．０ｍＭのＩＰＴＧ濃度で、ＯＤ６００＝０．６～１．０（ＩＰＴＧ１．０ｍＭについては０．６０、０．７０、及び１．００；ＩＰＴＧ０．１ｍＭについては０．８９、０．９６、及び１．００）の時点で発現誘導し、ＩＰＴＧ添加後、６～１４時間（ＩＰＴＧ１．０ｍＭについては６、６、及び１２時間；ＩＰＴＧ０．１ｍＭについては１４、１４、及び１４時間）経過時点で４００ｍＬの培養物を、３０００×ｇ、１５分、４℃で遠心分離し、集菌した。

０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、０．１Ｍトリス塩酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で菌体を懸濁し、超音波破砕した。菌体破砕物を遠心分離（１１０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、不溶性画分を回収し、変性緩衝液（８Ｍ尿素、５０ｍＭトリス塩酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム）を２０ｍＬ加え、可溶化した。

ライセートを遠心分離（１１０００ｒｐｍ、３０分、室温）し、上清を０．４５μｍフィルターでろ過した。ろ液を、上記１．と同じＮｉ^２+固定化カラムを用いて組換えＦＰ１５１を吸着させ、０．５Ｍイミダゾール溶出緩衝液で溶出させた（Ｈｉｓ－ｔａｇ精製）。

精製画分を回収し、上記１．と同じ透析チューブに入れて８Ｍ尿素、０．５％酢酸水溶液に対して透析した（１００ｍＬ中に１～２時間程度）。液を回収し、タンパク質濃度測定及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。

ＩＰＴＧ濃度１．０ｍＭの３回の実験の結果を図２及び表２、ＩＰＴＧ濃度０．１ｍＭの３回の実験の結果を図３及び表３にそれぞれ示す。図２及び図３において、パネルＡ、Ｂ、Ｃはそれぞれ表２及び表３に示す３回の独立した実験を表し、各レーンは、Ｍ＝タンパク質マーカー、レーン１＝不溶性画分、レーン２＝素通り画分、レーン３＝洗浄画分、レーン４＝溶出画分１、レーン５＝溶出画分１、レーン６＝溶出画分２、レーン７＝溶出画分３、レーン８＝溶出画分４である。ＦＰ１５１のバンドは約２８～２９ｋＤａの位置に見られる。

培養液４００ｍＬあたりのタンパク質収量は、ＩＰＴＧ濃度１ｍＭでは平均９．０３ｍｇ、０．１ｍＭでは１３．６ｍｇとなった。この実験では、ＩＰＴＧ濃度０．１ｍＭの方が１．５倍高い収量を示した。また、ＩＰＴＧ濃度１ｍＭの同一系列内では、初期ＯＤ（誘導直前の菌体量）又は誘導時間の値が大きいほど収量が高くなる傾向があった。

（３．ＦＰ１５１発現における誘導時菌体密度の影響評価）
タンパク質収量に及ぼす初期菌体量の影響を、高密度又は低密度状態でタンパク質誘導を行い、その収量を比較することにより調べた。
菌株として、上記１．と同じ大腸菌を使用した。

上記菌を、培地（２×ＹＴ培地、４００ｍＬ）に植菌し、３７℃で培養した。０．１ｍＭのＩＰＴＧ濃度で、ＯＤ６００＝１．５～２．０（１．７９、１．５７、及び１．６７）又はＯＤ６００＜０．６（０．５５、０．４２、及び０．３９）の時点で発現誘導し、ＩＰＴＧ添加後、１２時間経過時点で４００ｍＬの培養物を、３０００×ｇ、１５分、４℃で遠心分離し、集菌した。

精製画分を回収し、上記１．と同じ透析チューブに入れて８Ｍ尿素、０．５％酢酸水溶液に対して透析した（１００ｍＬ中に１～２時間程度）。

液を回収し、タンパク質濃度測定及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。

高密度（ＯＤ６００＝１．５～２．０）の３回の実験の結果を図４及び表４、低密度（ＯＤ６００＜０．６）の３回の実験の結果を図５及び表５に示す。図４及び図５において、パネルＡ、Ｂ、Ｃはそれぞれ表４及び図５に示す３回の独立した実験を表し、各レーンは、Ｍ＝タンパク質マーカー、レーン１＝不溶性画分、レーン２＝素通り画分、レーン３＝洗浄画分、レーン４＝溶出画分１、レーン５＝溶出画分１、レーン６＝溶出画分２、レーン７＝溶出画分３、レーン８＝溶出画分４である。

培養液４００ｍＬあたりのタンパク質収量は、低密度培養物では６．２７ｍｇ、高密度培養物では３５．６ｍｇと推定された。収量の差は約５．７倍あり、誘導開始時の菌体密度が収量に及ぼす影響が非常に大きいことが示された。

（４．ＦＰ１５１のＨｉｓ－ｔａｇ精製溶出条件の最適化（ｐＨ低下による溶出とイミダゾール溶出の比較））
公知のプロトコル（非特許文献１）に基づいて、ＦＰ１５１の抽出精製方法を検討した。

菌株として、上記１．と同じ大腸菌を使用した。

上記菌を、培地（ＬＢ培地、１００ｍＬ）に植菌し、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３２の時点で１．０ｍＭのＩＰＴＧ濃度で発現誘導し、ＩＰＴＧ添加後、１２．７時間経過時点で１００ｍＬの培養物を、３０００×ｇ、１５分、４℃で遠心分離し、集菌した。

１０ｍＭトリス塩酸、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、同じ緩衝液で菌体を懸濁し、超音波破砕した。菌体破砕物を遠心分離（１１０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、不溶性画分を回収し、２５％酢酸水溶液を加え（ペレット１ｇあたり５ｍＬ）、可溶化した。

ライセートを凍結乾燥し、８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス塩酸、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した後、遠心分離（１１０００ｒｐｍ、１５分、室温）し、上清を０．４５μｍフィルターでろ過した。ろ液を、上記１．と同じＮｉ^２+固定化カラムを用いて組換えＦＰ１５１を吸着させ、８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス塩酸、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で溶出させた（Ｈｉｓ－ｔａｇ精製）。

精製画分（２ｍＬずつ）を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。

結果を図６に示す。図６において、各レーンは、レーン１＝タンパク質マーカー、レーン２＝酢酸抽出直後、レーン３＝凍結乾燥後、レーン４＝素通り画分、レーン５＝洗浄画分、レーン６＝溶出画分１、レーン７＝溶出画分２、レーン８＝溶出画分３、レーン９＝溶出画分４、レーン１０＝溶出画分５、レーン１１＝溶出画分６、レーン１２＝溶出画分７、レーン１３＝溶出画分８、レーン１４＝溶出画分９、レーン１５＝溶出画分１０である。矢印は、ＦＰ１５１のバンドを表す。

酢酸抽出及びその抽出液の凍結乾燥後のサンプルにはＦＰ１５１のバンド（約２８ｋＤａ）が確認された。一方、溶出画分にはＦＰ１５１は確認されなかった。したがって、この方法ではカラムからＦＰ１５１を溶出できないことが判明した。

ｐＨ４．５の条件下で溶出されなかったカラムに、溶出液として０．５Ｍイミダゾール溶出緩衝液を加えて、再度溶出を行った。結果を、図７に示す。図７において、各レーンは、レーン１＝タンパク質マーカー、レーン２＝溶出画分１、レーン３＝溶出画分２、レーン４＝溶出画分３、レーン５＝溶出画分４、レーン６＝溶出画分５、レーン７＝溶出画分６、レーン８＝溶出画分７、レーン９＝溶出画分８、レーン１０＝溶出画分９、レーン１１＝溶出画分１０である。

イミダゾールを用いて溶出した場合、溶出画分にもＦＰ１５１が確認された。したがって、この方法で可溶化した場合であってもイミダゾールでの溶出の方が適していることが示された。

（５．ＦＰ１５１のＨｉｓ－ｔａｇ精製可溶化条件の最適化（酢酸溶液と尿素溶液との比較））
上記４．における酢酸による可溶化の代わりに使用できるＦＰ１５１の抽出方法を検討した。
菌株として、上記１．と同じ大腸菌を使用した。

上記菌を、培地（ＬＢ培地、１００ｍＬ）に植菌し、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝０．２７の時点で１．０ｍＭのＩＰＴＧ濃度で発現誘導し、ＩＰＴＧ添加後、１２．７時間経過時点で１００ｍＬの培養物を、３０００×ｇ、１５分、４℃で遠心分離し、集菌した。

ライセートを遠心分離（１１０００ｒｐｍ、１５分、室温）し、上清を０．４５μｍフィルターでろ過した。ろ液を、上記１．と同じＮｉ^２+固定化カラムを用いて組換えＦＰ１５１を吸着させ、０．５Ｍイミダゾール溶出緩衝液で溶出させた（Ｈｉｓ－ｔａｇ精製）。精製画分（２ｍＬずつ）を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。

結果を図８に示す。図８において、各レーンは、レーン１＝タンパク質マーカー、レーン２＝尿素抽出、レーン３＝素通り画分、レーン４＝洗浄画分、レーン５＝溶出画分１、レーン６＝溶出画分２、レーン７＝溶出画分３、レーン８＝溶出画分４、レーン９＝溶出画分５、レーン１０＝溶出画分６、レーン１１＝溶出画分７、レーン１２＝溶出画分８、レーン１３＝溶出画分９である。

尿素抽出（可溶化）のサンプルにはＦＰ１５１のバンド（約２８ｋＤａ）が確認された。また、溶出画分にもＦＰ１５１（矢印）が確認された。したがって、ＦＰ１５１は尿素で抽出可能であることが確認された。

（６．Ｍｆｐ３（Ｓ，Ｆ）のＨｉｓ－ｔａｇ精製溶出条件の最適化（ｐＨ低下とイミダゾールの比較））
公知のプロトコル（非特許文献２）に基づいて、Ｍｆｐ３（Ｓ，Ｆ）の抽出精製方法を検討した。

菌株として、ｐＥＴ２２ｂベクター上にコドン最適化したＭｆｐ３（Ｓ）又はＭｆｐ３（Ｆ）遺伝子を含む発現プラスミド（ｐＥＴ２２ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、品番６９７４４）のクローニングサイトのＮｄｅ１及びＸｈｏ１の領域内にインサートＤＮＡ（コドン最適化したＭｆｐ３（Ｓ）又はＭｆｐ３（Ｆ）遺伝子）を挿入して作製したもの）を用いてエレクトロポレーション法で形質転換した大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）株）を使用した。

上記菌を、培地（ＬＢ培地、１００ｍＬ）に植菌し、３７℃で培養した。Ｍｆｐ３（Ｓ）についてはＯＤ６００＝１．０８、Ｍｆｐ３（Ｆ）についてはＯＤ６００＝１．００の時点で１．０ｍＭのＩＰＴＧ濃度で発現誘導し、ＩＰＴＧ添加後、７．６時間経過時点で１００ｍＬの培養物を、３０００×ｇ、１５分、４℃で遠心分離し、集菌した。

０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、０．１Ｍトリス塩酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で菌体を懸濁し、超音波破砕した。菌体破砕物を遠心分離（１１０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、不溶性画分を回収し、変性緩衝液（８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス塩酸、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）を２０ｍＬ加え、可溶化した。

ライセートを遠心分離（１１０００ｒｐｍ、３０分、室温）し、上清を０．４５μｍフィルターでろ過した。ろ液を、上記１．と同じＮｉ^２+固定化カラムを用いて組換えＭｆｐ３を吸着させた。カラムを、８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス塩酸、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）で洗浄（１０ｍＬ）した後、８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス塩酸、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．９）で洗浄（１０ｍＬ）した。
その後、８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス塩酸、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で溶出させた（２ｍＬずつ回収）。

追加で、ｐＨ低下による溶出後の同じカラムを、８Ｍ尿素、５０ｍＭトリス塩酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．０）で再度溶出させた（Ｈｉｓ－ｔａｇ精製）。

Ｍｆｐ３（Ｓ）及びＭｆｐ３（Ｆ）についての結果を、図９及び図１０にそれぞれ示す。図９及び図１０において、各レーンは、レーン１＝タンパク質マーカー、レーン２＝尿素可溶化直後、レーン３＝素通り画分、レーン４＝洗浄１、レーン５＝洗浄２、レーン６＝低ｐＨ溶出画分１、レーン７＝低ｐＨ溶出画分２、レーン８＝低ｐＨ溶出画分３、レーン９＝低ｐＨ溶出画分４、レーン１０＝低ｐＨ溶出画分５、レーン１１＝低ｐＨ溶出画分６、レーン１２＝低ｐＨ溶出画分７、レーン１３＝低ｐＨ溶出画分８、レーン１４＝低ｐＨ溶出画分９、レーン１５＝低ｐＨ溶出画分１０である。レーン１６＝イミダゾール溶出画分１、レーン１７＝イミダゾール溶出画分２、レーン１８＝イミダゾール溶出画分３、レーン１９＝イミダゾール溶出画分４、レーン２０＝イミダゾール溶出画分５である。Ｍｐｆ３のバンドは約６．４ｋＤａの位置に見られる。なお、理論的な分子量は、Ｍｆｐ３（Ｓ）が６．４ｋＤａであるのに対し、Ｍｆｐ３（Ｆ）は６．３ｋＤａであるが、後者はアミノ酸含有量の影響を受けてやや上に出る。

ＦＰ１５１の場合と同様、ｐＨ低下による溶出画分にはＭｆｐ３のバンドは確認できず、イミダゾールによる溶出画分にはＭｆｐ３のバンドが確認された。したがって、溶出条件はｐＨ低下よりもイミダゾールでの溶出の方が適していることが示された。

（７．透析条件の最適化（１））
精製された接着性タンパク質から尿素を除去するためには透析操作を行う。この際、高濃度のタンパク質が存在する場合、急激な溶媒変化に伴ってタンパクの凝集が観察されることがある。そこで、透析用緩衝液の種類についてＦＰ１５１の最適な透析条件を検討した。

上記１．（ＯＤ６００＝１、ＩＰＴＧ濃度１．０ｍＭ）と同様に調製し、Ｈｉｓ－ｔａｇ精製直後のＦＰ１５１溶液（５ｍＬ）を、上記１．と同じ透析チューブに入れ、１Ｌの各溶液（５％酢酸水溶液、１％酢酸水溶液、０．５％酢酸水溶液、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、又は生理食塩水（ＰＢＳ））中にそれぞれ浸漬して室温で透析した。溶液は、３回交換（１回目は約４時間、２回目は約１２時間、３回目は約４時間）し、尿素を完全に除去した。透析終了後、凝集の有無を目視で確認した。

結果を表６に示す。

５０ｍＭトリス塩酸緩衝液又はＰＢＳで透析を行った場合、タンパク質の白い凝集が確認された。また、５％酢酸水溶液及び１％酢酸水溶液でも凝集が確認できたが、酢酸濃度が高いほど凝集が多く見られる傾向にあることが判明した。したがって、この結果からは、５％未満の酢酸水溶液が好ましく、０．５％酢酸水溶液が最も適していることが分かった。

（８．透析条件の最適化（２））
段階的に尿素を除去することでタンパク質の凝集を防止する方法を検討した。

＜一段階透析法＞
ＦＰ１５１、Ｍｆｐ３（Ｓ）及びＭｆｐ３（Ｆ）は、上記７．と同様に調製したものを使用した。ただし、Ｍｆｐ３（Ｓ）はＯＤ６００＝０．７９～１．８４、Ｍｆｐ３（Ｆ）はＯＤ６００＝０．６２～１．３３で発現誘導を開始した。Ｈｉｓ－ｔａｇ精製直後のＦＰ１５１、Ｍｆｐ３（Ｓ）、Ｍｆｐ３（Ｆ）の溶液（１０ｍＬ）を１Ｌの０．５％酢酸水溶液中に浸漬して透析した。透析チューブは、Ｍｆｐ３にはスペクトラ／ポアＲＣ透析チューブ（商品名、再生セルロース製）、スペクトラ／ポア３（ＭＷＣＯ：３，５００）、ＦＰ１５１にはスペクトラ／ポアＲＣ透析チューブ（商品名、再生セルロース製）、スペクトラ／ポア１（ＭＷＣＯ：６，０００～８，０００）を使用し、室温で各回６時間程度、行った。外液は、３回交換し、尿素を完全に除去した。

＜二段階透析法＞
上記と同じＨｉｓ－ｔａｇ精製直後のＦＰ１５１、Ｍｆｐ３（Ｓ）、Ｍｆｐ３（Ｆ）の溶液（１０ｍＬ）を１００ｍＬの８Ｍ尿素、０．５％酢酸水溶液中に浸漬して透析し、精製画分中の緩衝液成分（トリス緩衝液（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ塩化ナトリウム）を酢酸と交換した。次に、尿素を完全に除去するために、一段階透析法の場合と同様に１Ｌの０．５％酢酸水溶液を３回交換して透析した。透析終了後、凝集の有無を目視で確認した。

結果を表７に示す。

溶出緩衝液と同じ尿素濃度で緩衝液を変更した後、尿素除去を行うことにより、タンパク質の凝集をさらに有効に防止できることが示された。

Claims

ＤＯＰＡ含有接着性タンパク質を調製する方法であって、
前記タンパク質をコードする遺伝子を含む形質転換大腸菌の高密度培養物に、０．１～１ｍＭの濃度のＩＰＴＧを用いて前記遺伝子の発現を誘導する誘導工程と、
前記発現誘導された菌体を、タンパク質変性剤を含有する溶液を用いて可溶化する可溶化工程と、
前記可溶化された菌体溶液中の前記遺伝子産物を、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ担体に吸着させ、競合剤により溶出させる精製工程と、
前記溶出液を、５％未満の酢酸を含有する溶液に対して透析する透析工程と、
を含む方法。
ＤＯＰＡ含有接着性タンパク質を調製する方法であって、
前記タンパク質をコードする遺伝子を含む形質転換大腸菌の高密度培養物に、０．１～１ｍＭの濃度のＩＰＴＧを用いて前記遺伝子の発現を誘導する誘導工程と、
前記発現誘導された菌体を、タンパク質変性剤を含有する溶液を用いて可溶化する可溶化工程と、
前記可溶化された菌体溶液中の前記遺伝子産物を、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ担体に吸着させ、競合剤により溶出させる精製工程と、
前記溶出液を、５％未満の酢酸を含有する溶液に対して透析する透析工程と、
前記透析後の前記遺伝子産物中のチロシン残基をＤＯＰＡに置換するＤＯＰＡ置換工程と
を含む方法。
前記大腸菌の高密度培養物が、ＯＤ６００＝０．６～２．０である、請求項１又は２記載の方法。
前記大腸菌の高密度培養物が、ＯＤ６００＝１．０～２．０である、請求項３記載の方法。
前記大腸菌の高密度培養物が、ＯＤ６００＝１．５～２．０である、請求項４記載の方法。
前記タンパク質変性剤が、６～８Ｍの尿素である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
前記競合剤が、イミダゾールである、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
前記透析工程が、前記可溶化工程において使用したタンパク質変性剤を含む酢酸溶液に対して透析する第一の透析と、その後に前記タンパク質変性剤を含まない酢酸溶液に対して透析する第二の透析とを含む、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
請求項１～８のいずれか１項記載の方法によって調製されたＤＯＰＡ含有接着性タンパク質。
請求項９記載のＤＯＰＡ含有接着性タンパク質及び賦形剤を含む接着剤組成物。