JPH08100153A - 水酸化比の高いｉ型コラーゲン - Google Patents
水酸化比の高いｉ型コラーゲンInfo
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- JPH08100153A JPH08100153A JP6246578A JP24657894A JPH08100153A JP H08100153 A JPH08100153 A JP H08100153A JP 6246578 A JP6246578 A JP 6246578A JP 24657894 A JP24657894 A JP 24657894A JP H08100153 A JPH08100153 A JP H08100153A
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- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】［α１（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニット構
造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水酸化比
（ヒドロキシリシン／リシン）が０．４８以上及び／又
はプロリンの水酸化比（ヒドロキシプロリン／プロリ
ン）が０．９５以上であるＩ型コラーゲン；及びα１
（Ｉ）鎖のリシンの水酸化比（ヒドロキシリシン／リシ
ン）が０．４１以上及び／又はプロリンの水酸化比（ヒ
ドロキシプロリン／プロリン）が１．０１以上であるＩ
型コラーゲンのα１（Ｉ）サブユニット。 【効果】新規Ｉ型コラーゲンおよびそのα１（Ｉ）サブ
ユニットを提供する。
造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水酸化比
（ヒドロキシリシン／リシン）が０．４８以上及び／又
はプロリンの水酸化比（ヒドロキシプロリン／プロリ
ン）が０．９５以上であるＩ型コラーゲン；及びα１
（Ｉ）鎖のリシンの水酸化比（ヒドロキシリシン／リシ
ン）が０．４１以上及び／又はプロリンの水酸化比（ヒ
ドロキシプロリン／プロリン）が１．０１以上であるＩ
型コラーゲンのα１（Ｉ）サブユニット。 【効果】新規Ｉ型コラーゲンおよびそのα１（Ｉ）サブ
ユニットを提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規Ｉ型コラーゲン及
びそのα１（Ｉ）サブユニットに関する。
びそのα１（Ｉ）サブユニットに関する。
【０００２】なお、本明細書中で「ヒドロキシプロリ
ン」は、３−ヒドロキシプロリンと４−ヒドロキシプロ
リンの両方を含む意味で使用する。
ン」は、３−ヒドロキシプロリンと４−ヒドロキシプロ
リンの両方を含む意味で使用する。
【０００３】
【従来の技術】コラーゲンは、生体の組織、器官に広く
分布し、生体構成全蛋白質のほぼ１／３を占める重要蛋
白質である。コラーゲン、特にアテロコラーゲンは、抗
原性が少なく生体に対する適合性が高いため、軟組織修
復用のコラーゲンゲル、人工血管、人工皮膚、化粧品の
保湿剤などへの応用が研究されている。コラーゲンは、
現在Ｉ型〜XVIII型までが知られ、そのうち線維形成コ
ラーゲンとしてはＩ、II、III、Ｖ、XI型があるが、工
業、医療用素材としては、主としてＩ型が利用されてい
る。
分布し、生体構成全蛋白質のほぼ１／３を占める重要蛋
白質である。コラーゲン、特にアテロコラーゲンは、抗
原性が少なく生体に対する適合性が高いため、軟組織修
復用のコラーゲンゲル、人工血管、人工皮膚、化粧品の
保湿剤などへの応用が研究されている。コラーゲンは、
現在Ｉ型〜XVIII型までが知られ、そのうち線維形成コ
ラーゲンとしてはＩ、II、III、Ｖ、XI型があるが、工
業、医療用素材としては、主としてＩ型が利用されてい
る。
【０００４】しかしながら、コラーゲンは熱、光などに
対する安定性が低く、またコラーゲンが会合してできた
製品の強度も弱い難点があった。
対する安定性が低く、またコラーゲンが会合してできた
製品の強度も弱い難点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、物理的な安
定性の高い新規なＩ型コラーゲンを提供することを目的
とする。
定性の高い新規なＩ型コラーゲンを提供することを目的
とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
鑑み新たな性質を有するコラーゲンの探索を続けた結
果、プロリンおよびリシンの水酸化比が、公知のＩ型コ
ラーゲンよりも著しく高い新規Ｉ型コラーゲン及びその
α１（Ｉ）サブユニットを見出した。
鑑み新たな性質を有するコラーゲンの探索を続けた結
果、プロリンおよびリシンの水酸化比が、公知のＩ型コ
ラーゲンよりも著しく高い新規Ｉ型コラーゲン及びその
α１（Ｉ）サブユニットを見出した。
【０００７】すなわち、本発明は、［α１（Ｉ）］2α
２（Ｉ）のサブユニット構造を有するＩ型コラーゲンで
あって、リシンの水酸化比（ヒドロキシリシン／リシ
ン）が０．４８以上及び／又はプロリンの水酸化比（ヒ
ドロキシプロリン／プロリン）が０．９５以上であるＩ
型コラーゲン（以下、本第１発明という）を提供するも
のである。
２（Ｉ）のサブユニット構造を有するＩ型コラーゲンで
あって、リシンの水酸化比（ヒドロキシリシン／リシ
ン）が０．４８以上及び／又はプロリンの水酸化比（ヒ
ドロキシプロリン／プロリン）が０．９５以上であるＩ
型コラーゲン（以下、本第１発明という）を提供するも
のである。
【０００８】また、本発明は、リシンの水酸化比（ヒド
ロキシリシン／リシン）が０．４１以上及び／又はプロ
リンの水酸化比（ヒドロキシプロリン／プロリン）が
１．０１以上であるＩ型コラーゲンのα１（Ｉ）サブユ
ニット（以下、本第２発明という）を提供するものであ
る。
ロキシリシン／リシン）が０．４１以上及び／又はプロ
リンの水酸化比（ヒドロキシプロリン／プロリン）が
１．０１以上であるＩ型コラーゲンのα１（Ｉ）サブユ
ニット（以下、本第２発明という）を提供するものであ
る。
【０００９】本第１および第２発明のＩ型コラーゲン
は、特に限定されるものではないが、例えばブタ、ウ
シ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物の腸（例えば小腸、大
腸）などから単離精製される。
は、特に限定されるものではないが、例えばブタ、ウ
シ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物の腸（例えば小腸、大
腸）などから単離精製される。
【００１０】本第１発明では、Ｉ型コラーゲンは［α１
（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニット構造を有する。一
方、本第２発明においては、Ｉ型コラーゲンのα１
（Ｉ）サブユニットは［α１（Ｉ）］2α２および［α
１（Ｉ）］3のいずれのＩ型コラーゲンから得られたも
のであってもよい。
（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニット構造を有する。一
方、本第２発明においては、Ｉ型コラーゲンのα１
（Ｉ）サブユニットは［α１（Ｉ）］2α２および［α
１（Ｉ）］3のいずれのＩ型コラーゲンから得られたも
のであってもよい。
【００１１】本第１発明は、以下のＩ型コラーゲンにも
関する。
関する。
【００１２】＊［α１（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニ
ット構造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水
酸化比が０．４８以上であるＩ型コラーゲン； ＊［α１（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニット構造を有
するＩ型コラーゲンであって、プロリンの水酸化比が
０．９５以上であるＩ型コラーゲン；および ＊［α１（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニット構造を有
するＩ型コラーゲンであって、リシンの水酸化比が０．
４８以上及びプロリンの水酸化比が０．９５以上である
Ｉ型コラーゲン。
ット構造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水
酸化比が０．４８以上であるＩ型コラーゲン； ＊［α１（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニット構造を有
するＩ型コラーゲンであって、プロリンの水酸化比が
０．９５以上であるＩ型コラーゲン；および ＊［α１（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニット構造を有
するＩ型コラーゲンであって、リシンの水酸化比が０．
４８以上及びプロリンの水酸化比が０．９５以上である
Ｉ型コラーゲン。
【００１３】＊［α１（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニ
ット構造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水
酸化比が０．４８以上及び／又はプロリンの水酸化比が
０．９６以上であるＩ型コラーゲン。
ット構造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水
酸化比が０．４８以上及び／又はプロリンの水酸化比が
０．９６以上であるＩ型コラーゲン。
【００１４】＊［α１（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニ
ット構造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水
酸化比が０．５０以上及び／又はプロリンの水酸化比が
０．９５以上であるＩ型コラーゲン。
ット構造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水
酸化比が０．５０以上及び／又はプロリンの水酸化比が
０．９５以上であるＩ型コラーゲン。
【００１５】＊［α１（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニ
ット構造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水
酸化比が０．５０以上及び／又はプロリンの水酸化比が
０．９６以上であるＩ型コラーゲン。
ット構造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水
酸化比が０．５０以上及び／又はプロリンの水酸化比が
０．９６以上であるＩ型コラーゲン。
【００１６】＊［α１（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニ
ット構造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水
酸化比が０．４８〜０．５０及び／又はプロリンの水酸
化比が０．９５〜０．９６であるＩ型コラーゲン。
ット構造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水
酸化比が０．４８〜０．５０及び／又はプロリンの水酸
化比が０．９５〜０．９６であるＩ型コラーゲン。
【００１７】また、第２発明は、以下のＩ型コラーゲン
のα１（Ｉ）サブユニットにも関する。
のα１（Ｉ）サブユニットにも関する。
【００１８】＊リシンの水酸化比が０．４１以上である
Ｉ型コラーゲンのα１（Ｉ）サブユニット； ＊プロリンの水酸化比が１．０１以上であるＩ型コラー
ゲンのα１（Ｉ）サブユニット；および ＊リシンの水酸化比が０．４１以上及びプロリンの水酸
化比が１．０１以上であるＩ型コラーゲンのα１（Ｉ）
サブユニット。
Ｉ型コラーゲンのα１（Ｉ）サブユニット； ＊プロリンの水酸化比が１．０１以上であるＩ型コラー
ゲンのα１（Ｉ）サブユニット；および ＊リシンの水酸化比が０．４１以上及びプロリンの水酸
化比が１．０１以上であるＩ型コラーゲンのα１（Ｉ）
サブユニット。
【００１９】＊リシンの水酸化比が０．４１以上及び／
又はプロリンの水酸化比が１．０２以上であるＩ型コラ
ーゲンのα１（Ｉ）サブユニット。
又はプロリンの水酸化比が１．０２以上であるＩ型コラ
ーゲンのα１（Ｉ）サブユニット。
【００２０】＊リシンの水酸化比が０．４３以上及び／
又はプロリンの水酸化比が１．０１以上であるＩ型コラ
ーゲンのα１（Ｉ）サブユニット。
又はプロリンの水酸化比が１．０１以上であるＩ型コラ
ーゲンのα１（Ｉ）サブユニット。
【００２１】＊リシンの水酸化比が０．４１〜０．４３
及びプロリンの水酸化比が１．０１〜１．０２であるＩ
型コラーゲンのα１（Ｉ）サブユニット。
及びプロリンの水酸化比が１．０１〜１．０２であるＩ
型コラーゲンのα１（Ｉ）サブユニット。
【００２２】本第１および第２発明のＩ型コラーゲン及
びそのα１（Ｉ）サブユニットは、リシンの水酸化比お
よびプロリンの水酸化比が、従来公知のＩ型コラーゲン
等よりも明らかに高く、この点で公知のＩ型コラーゲン
等と明確に区別される。コラーゲンの水酸化比が高いほ
ど三重ラセン及び線維の安定性が高まることが知られて
おり、水酸化比の高いＩ型コラーゲンは、従来のものに
比べて物性面でも強度が高まると考えられる。
びそのα１（Ｉ）サブユニットは、リシンの水酸化比お
よびプロリンの水酸化比が、従来公知のＩ型コラーゲン
等よりも明らかに高く、この点で公知のＩ型コラーゲン
等と明確に区別される。コラーゲンの水酸化比が高いほ
ど三重ラセン及び線維の安定性が高まることが知られて
おり、水酸化比の高いＩ型コラーゲンは、従来のものに
比べて物性面でも強度が高まると考えられる。
【００２３】本発明において、「リシンの水酸化比」お
よび「プロリンの水酸化比」とは、Ｉ型コラーゲンの全
アミノ酸中のヒドロキシリシン、リシン、ヒドロキシプ
ロリンおよびプロリンの数を各々計算し、プロリンの水
酸化比（％）＝（ヒドロキシプロリンの数）／（プロリ
ンの数）の式で計算され、リシンの水酸化比（％）＝
（ヒドロキシリシンの数）／（リシンの数）の式で計算
される。
よび「プロリンの水酸化比」とは、Ｉ型コラーゲンの全
アミノ酸中のヒドロキシリシン、リシン、ヒドロキシプ
ロリンおよびプロリンの数を各々計算し、プロリンの水
酸化比（％）＝（ヒドロキシプロリンの数）／（プロリ
ンの数）の式で計算され、リシンの水酸化比（％）＝
（ヒドロキシリシンの数）／（リシンの数）の式で計算
される。
【００２４】本発明のコラーゲンは、アミノ酸組成、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の分析結果、プ
ロテアーゼにより限定分解したペプチドの液体クロマト
グラフィーなどのパターンなどから、Ｉ型コラーゲンで
あると同定される。
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の分析結果、プ
ロテアーゼにより限定分解したペプチドの液体クロマト
グラフィーなどのパターンなどから、Ｉ型コラーゲンで
あると同定される。
【００２５】本発明のＩ型コラーゲンは、中性条件で一
度不溶化させると再溶解し難く、公知のＩ型コラーゲン
がほぼ完全に溶解する１．７Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に対しても不
溶化し、溶解度は２０％以下となる。
度不溶化させると再溶解し難く、公知のＩ型コラーゲン
がほぼ完全に溶解する１．７Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に対しても不
溶化し、溶解度は２０％以下となる。
【００２６】本発明のＩ型コラーゲンおよびそのα１
（Ｉ）サブユニットは、新規物質であり、例えば、以下
の（１）〜（１１）の方法に従い調製される。
（Ｉ）サブユニットは、新規物質であり、例えば、以下
の（１）〜（１１）の方法に従い調製される。
【００２７】（１）ブタ腸などの目的の動物組織から、
脂肪組織などの非コラーゲン画分をナイフでできる限り
取り除く。
脂肪組織などの非コラーゲン画分をナイフでできる限り
取り除く。
【００２８】（２）残りを細切し、０．１Ｎ−ＮａＯＨ
に懸濁し、一晩撹拌抽出し、遠心分離（３０００ｇ、１
０分間）して沈殿を得る操作を数回繰り返す。
に懸濁し、一晩撹拌抽出し、遠心分離（３０００ｇ、１
０分間）して沈殿を得る操作を数回繰り返す。
【００２９】（３）冷蒸留水で洗浄を繰り返す。
【００３０】（４）湿重量の５−１０倍量の０．５Ｍ酢
酸に懸濁し、一晩撹拌抽出の後に遠心分離（３０００
ｇ、１０分間）し、再度０．５Ｍ酢酸に懸濁し、一晩撹
拌抽出の後に遠心分離（３０００ｇ、１０分間）を行
う。
酸に懸濁し、一晩撹拌抽出の後に遠心分離（３０００
ｇ、１０分間）し、再度０．５Ｍ酢酸に懸濁し、一晩撹
拌抽出の後に遠心分離（３０００ｇ、１０分間）を行
う。
【００３１】（５）沈殿物に０．５Ｍ酢酸を加え、塩酸
でｐＨを２．５に調整し、組織湿重量の１／１００〜１
／２００のペプシンを加えて４℃で一晩抽出する。
でｐＨを２．５に調整し、組織湿重量の１／１００〜１
／２００のペプシンを加えて４℃で一晩抽出する。
【００３２】（６）遠心分離（３０００ｇ、１０分間）
により上清（ペプシン可溶性コラーゲン）を得る。
により上清（ペプシン可溶性コラーゲン）を得る。
【００３３】（７）このペプシン処理および遠心分離操
作を３回繰り返す。
作を３回繰り返す。
【００３４】（８）ペプシン可溶性コラーゲン２００部
に、１０Ｍ尿素と２５０ｍＭ ＮａＣｌの混合溶液６０
部を加え、２Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液でｐＨを８．０
に調整する。
に、１０Ｍ尿素と２５０ｍＭ ＮａＣｌの混合溶液６０
部を加え、２Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液でｐＨを８．０
に調整する。
【００３５】（９）１０ｍＭ ＨＣｌ、２Ｍ尿素、５０
ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液を２Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝
液を用いてコラーゲン溶液と同じｐＨに調整する。
ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液を２Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝
液を用いてコラーゲン溶液と同じｐＨに調整する。
【００３６】（１０）ＤＥＡＥセルロースカラムを工程
（９）で用いた緩衝液で平衡化する。
（９）で用いた緩衝液で平衡化する。
【００３７】（１１）ペプシン可溶性コラーゲン溶液３
０部をカラムに注入し、工程（９）で用いた緩衝液２０
部で溶出後に水で透析し、凍結乾燥し、［α１（Ｉ）］
2α２（Ｉ）のサブユニット構造を有するＩ型コラーゲ
ンを得る。
０部をカラムに注入し、工程（９）で用いた緩衝液２０
部で溶出後に水で透析し、凍結乾燥し、［α１（Ｉ）］
2α２（Ｉ）のサブユニット構造を有するＩ型コラーゲ
ンを得る。
【００３８】また、得られたＩ型コラーゲンからのα１
（Ｉ）サブユニットの分離は、例えば以下の（ｉ）〜
（ｖ）の方法により行うことができる。
（Ｉ）サブユニットの分離は、例えば以下の（ｉ）〜
（ｖ）の方法により行うことができる。
【００３９】（ｉ）Ｉ型コラーゲン１ｍｇに、２Ｍ尿素
および５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．８）を１ｍｇ／ｍＬの割合で加え、５０℃で
５分間加熱してサブユニットを解離させる。
および５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．８）を１ｍｇ／ｍＬの割合で加え、５０℃で
５分間加熱してサブユニットを解離させる。
【００４０】（ii）この溶液を、上記酢酸緩衝液で平衡
化したBAKERBOND CSX強カチオン交換カラム（Ｊ．Ｔ．
Ｂａｋｅｒ Ｕ．Ｓ．Ａ製）に注入し、流速１ｍＬ／分
で３０分間、０〜３００ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配によ
り、蛋白質を溶離する。
化したBAKERBOND CSX強カチオン交換カラム（Ｊ．Ｔ．
Ｂａｋｅｒ Ｕ．Ｓ．Ａ製）に注入し、流速１ｍＬ／分
で３０分間、０〜３００ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配によ
り、蛋白質を溶離する。
【００４１】(iii）各サブユニットを含む画分を集め、
凍結乾燥により濃縮する。
凍結乾燥により濃縮する。
【００４２】（iv）２Ｍ尿素、１５０ｍＭ ＮａＣｌを
含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）により平衡化したＴＳ
Ｋ ＧＥＬ ＳＷ３０００ＸＬに注入し、β鎖以上の重
合物を除去する。
含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）により平衡化したＴＳ
Ｋ ＧＥＬ ＳＷ３０００ＸＬに注入し、β鎖以上の重
合物を除去する。
【００４３】（ｖ）塩および緩衝液を除くため、BAKERB
OND C4逆相カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｕ．Ｓ．Ａ
製）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸存在下で１０−
８０％のアセトニトリルの直線勾配溶出を行う。
OND C4逆相カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｕ．Ｓ．Ａ
製）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸存在下で１０−
８０％のアセトニトリルの直線勾配溶出を行う。
【００４４】上記のＩ型コラーゲンの分離方法及びサブ
ユニットの解離・精製方法は、単なる例示であり、当業
者であれば極めて容易にその条件を適宜変更することが
できる。
ユニットの解離・精製方法は、単なる例示であり、当業
者であれば極めて容易にその条件を適宜変更することが
できる。
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば、新規Ｉ型コラーゲン及
びそのα１（Ｉ）サブユニットが提供される。本発明の
コラーゲン及びそのサブユニットは、軟組織修復用コラ
ーゲンゲル、人工血管、人工皮膚、人工毛髪、ソフトコ
ンタクトレンズ、化粧品等の保湿剤、細胞培養の基質、
手術用の縫合糸、ソーセージのケーシング、癒着防止膜
などに有用である。
びそのα１（Ｉ）サブユニットが提供される。本発明の
コラーゲン及びそのサブユニットは、軟組織修復用コラ
ーゲンゲル、人工血管、人工皮膚、人工毛髪、ソフトコ
ンタクトレンズ、化粧品等の保湿剤、細胞培養の基質、
手術用の縫合糸、ソーセージのケーシング、癒着防止膜
などに有用である。
【００４６】
【実施例】以下、本発明を実施例および比較例を用いて
より詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されな
い。
より詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されな
い。
【００４７】なお、以下の実施例において、「Hyp」は
３−ヒドロキシプロリンと４−ヒドロキシプロリンの合
計、「Pro」はプロリン、「Hyl」はヒドロキシリシン、
「Lys」はリシンを各々表す。
３−ヒドロキシプロリンと４−ヒドロキシプロリンの合
計、「Pro」はプロリン、「Hyl」はヒドロキシリシン、
「Lys」はリシンを各々表す。
【００４８】実施例１ ＊Ｉ型コラーゲンの精製 以下のプロトコール（１）〜（１１）に従い、原料であ
るブタ腸（小腸及び大腸）１０００ｇから精製Ｉ型コラ
ーゲン５．１ｇを得た。
るブタ腸（小腸及び大腸）１０００ｇから精製Ｉ型コラ
ーゲン５．１ｇを得た。
【００４９】（１）ブタの小腸および大腸から、脂肪組
織などの非コラーゲン画分をナイフでできる限り取り除
く。
織などの非コラーゲン画分をナイフでできる限り取り除
く。
【００５０】（２）残りを細切し、０．１Ｎ−ＮａＯＨ
に懸濁し、一晩撹拌抽出し、遠心分離（３０００ｇ、１
０分間）して沈殿を得る操作を６回繰り返す。
に懸濁し、一晩撹拌抽出し、遠心分離（３０００ｇ、１
０分間）して沈殿を得る操作を６回繰り返す。
【００５１】（３）冷蒸留水で洗浄を繰り返す。
【００５２】（４）湿重量の５−１０倍量の０．５Ｍ酢
酸に懸濁し、一晩撹拌抽出の後に遠心分離（３０００
ｇ、１０分間）し、再度０．５Ｍ酢酸に懸濁し、一晩撹
拌抽出の後に遠心分離（３０００ｇ、１０分間）を行
う。
酸に懸濁し、一晩撹拌抽出の後に遠心分離（３０００
ｇ、１０分間）し、再度０．５Ｍ酢酸に懸濁し、一晩撹
拌抽出の後に遠心分離（３０００ｇ、１０分間）を行
う。
【００５３】（５）沈殿物に０．５Ｍ酢酸を加え、塩酸
でｐＨを２．５に調整し、組織湿重量の１／１００〜１
／２００のペプシンを加えて４℃で一晩抽出する。
でｐＨを２．５に調整し、組織湿重量の１／１００〜１
／２００のペプシンを加えて４℃で一晩抽出する。
【００５４】（６）遠心分離（３０００ｇ、１０分間）
により上清（ペプシン可溶性コラーゲン）を得る。
により上清（ペプシン可溶性コラーゲン）を得る。
【００５５】（７）このペプシン処理および遠心分離操
作を３回繰り返す。
作を３回繰り返す。
【００５６】（８）ペプシン可溶性コラーゲン２００部
に、１０Ｍ尿素と２５０ｍＭ ＮａＣｌの混合溶液６０
部を加え、２Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液でｐＨを８．０
に調整する。
に、１０Ｍ尿素と２５０ｍＭ ＮａＣｌの混合溶液６０
部を加え、２Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液でｐＨを８．０
に調整する。
【００５７】（９）１０ｍＭ ＨＣｌ、２Ｍ尿素、５０
ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液を２Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝
液を用いてコラーゲン溶液と同じｐＨに調整する。
ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液を２Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝
液を用いてコラーゲン溶液と同じｐＨに調整する。
【００５８】（１０）ＤＥＡＥセルロースカラムを工程
（９）で用いた緩衝液で平衡化する。
（９）で用いた緩衝液で平衡化する。
【００５９】（１１）ペプシン可溶性コラーゲン溶液３
０部をカラムに注入し、工程（９）で用いた緩衝液２０
部で溶出後に水で透析し、凍結乾燥し、［α１（Ｉ）］
2α２（Ｉ）のサブユニット構造を有するＩ型コラーゲ
ンを得る。
０部をカラムに注入し、工程（９）で用いた緩衝液２０
部で溶出後に水で透析し、凍結乾燥し、［α１（Ｉ）］
2α２（Ｉ）のサブユニット構造を有するＩ型コラーゲ
ンを得る。
【００６０】＊サブユニットの分離 上記で得られたＩ型コラーゲン凍結乾燥物１ｍｇに、２
Ｍ尿素および５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ４．８）を１ｍｇ／ｍＬの割合で加え、５０℃
で５分間加熱してサブユニットを解離させた。この溶液
を、上記酢酸緩衝液で平衡化したBAKERBOND CSX強カチ
オン交換カラム（Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒＵ．Ｓ．Ａ製）に
注入し、流速１ｍＬ／分で３０分間、０〜３００ｍＭ
ＮａＣｌの直線勾配により、蛋白質を溶離した。各サブ
ユニットを含む画分を集め、凍結乾燥により濃縮した。
２Ｍ尿素、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液
（ｐＨ６．５）により平衡化したＴＳＫ ＧＥＬ ＳＷ
３０００ＸＬに注入し、β鎖以上の重合物を除去した。
Ｍ尿素および５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ４．８）を１ｍｇ／ｍＬの割合で加え、５０℃
で５分間加熱してサブユニットを解離させた。この溶液
を、上記酢酸緩衝液で平衡化したBAKERBOND CSX強カチ
オン交換カラム（Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒＵ．Ｓ．Ａ製）に
注入し、流速１ｍＬ／分で３０分間、０〜３００ｍＭ
ＮａＣｌの直線勾配により、蛋白質を溶離した。各サブ
ユニットを含む画分を集め、凍結乾燥により濃縮した。
２Ｍ尿素、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液
（ｐＨ６．５）により平衡化したＴＳＫ ＧＥＬ ＳＷ
３０００ＸＬに注入し、β鎖以上の重合物を除去した。
【００６１】さらに、塩および緩衝液を除くため、BAKE
RBOND C4逆相カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｕ．Ｓ．Ａ
製）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸存在下で１０−
８０％のアセトニトリルの直線勾配溶出を行った。
RBOND C4逆相カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｕ．Ｓ．Ａ
製）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸存在下で１０−
８０％のアセトニトリルの直線勾配溶出を行った。
【００６２】BAKERBOND C4逆相カラムの溶出パターンを
図１に示す。
図１に示す。
【００６３】実施例２〜３ 実施例１の実験を２回追試して、各々Ｉ型コラーゲンを
得た。
得た。
【００６４】比較例１ 原料をブタ腸からブタ皮膚に代えた以外は、実施例１と
同様にしてＩ型コラーゲンおよびそのサブユニットを得
た。
同様にしてＩ型コラーゲンおよびそのサブユニットを得
た。
【００６５】分析試験 （イ）α１（Ｉ）のアミノ酸分析 上記実施例１〜３で得られたＩ型コラーゲンのα１
（Ｉ）のアミノ酸組成を、高速液体クロマトグラフィー
（島津製作所製）を用いてＰＩＴＣ法により分析した。
下記の公知文献１〜４に記載されているアミノ酸分析結
果を併せて表１に示す。
（Ｉ）のアミノ酸組成を、高速液体クロマトグラフィー
（島津製作所製）を用いてＰＩＴＣ法により分析した。
下記の公知文献１〜４に記載されているアミノ酸分析結
果を併せて表１に示す。
【００６６】文献１：Miller E.J.及びGay S., Methods
in Enzymology, 82, 3-32 (1982) 文献２：コラーゲン代謝と疾患（藤本大三郎、永井裕
編）、講談社、ｐ１１６（１９８２） 文献３：Bornstein P.及びPiez K. A., J. Clin. Inve
t., 43, 1813 (1964) 文献４：ＭｃＣｌａｉｎ Ｐ．Ｅ．， Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４６， ２３０３−２３１１
（１９７４）
in Enzymology, 82, 3-32 (1982) 文献２：コラーゲン代謝と疾患（藤本大三郎、永井裕
編）、講談社、ｐ１１６（１９８２） 文献３：Bornstein P.及びPiez K. A., J. Clin. Inve
t., 43, 1813 (1964) 文献４：ＭｃＣｌａｉｎ Ｐ．Ｅ．， Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４６， ２３０３−２３１１
（１９７４）
【００６７】
【表１】
【００６８】上記のように、本発明で得られるブタ腸由
来のＩ型コラーゲンのα１（Ｉ）は、公知のものと比べ
てプロリンおよびリシンの水酸化比が高く、新規物質で
あることが確認された。
来のＩ型コラーゲンのα１（Ｉ）は、公知のものと比べ
てプロリンおよびリシンの水酸化比が高く、新規物質で
あることが確認された。
【００６９】（ロ）α２（Ｉ）のアミノ酸分析 次に、α２（Ｉ）のアミノ酸組成を、高速液体クロマト
グラフィー（島津製作所製）を用いてＰＩＴＣ法により
分析した。文献１〜３に記載されているアミノ酸分析結
果を併せて表２に示す。
グラフィー（島津製作所製）を用いてＰＩＴＣ法により
分析した。文献１〜３に記載されているアミノ酸分析結
果を併せて表２に示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】本発明のα２（Ｉ）のリシンの水酸化比お
よびプロリンの水酸化比は、公知のＩ型コラーゲンのα
２（Ｉ）と比較して同等以上である。
よびプロリンの水酸化比は、公知のＩ型コラーゲンのα
２（Ｉ）と比較して同等以上である。
【００７２】（ハ）［α１（Ｉ）］２α２のサブユニッ
ト構造を有するＩ型コラーゲンのリシンの水酸化比およ
びプロリンの水酸化比 上記の（イ）および（ロ）のアミノ酸分析の結果から、
本発明と文献１〜４のＩ型コラーゲンのリシンの水酸化
比およびプロリンの水酸化比を計算により求めた。結果
を表３に示す。
ト構造を有するＩ型コラーゲンのリシンの水酸化比およ
びプロリンの水酸化比 上記の（イ）および（ロ）のアミノ酸分析の結果から、
本発明と文献１〜４のＩ型コラーゲンのリシンの水酸化
比およびプロリンの水酸化比を計算により求めた。結果
を表３に示す。
【００７３】
【表３】
【００７４】表３に示すように、本発明のＩ型コラーゲ
ンは、全体としてもリシンおよびプロリンの水酸化比が
高いことが明らかである。
ンは、全体としてもリシンおよびプロリンの水酸化比が
高いことが明らかである。
【００７５】（ニ）Ｉ型コラーゲンの電気泳動パターン 実施例１および比較例１で得られたα１（Ｉ）サブユニ
ット（各０．１ｍｇ）を、重量比で１／２０〜１／５０
のＶ８プロテアーゼ（和光純薬工業株式会社製）を用い
て３７℃で３０分間加水分解して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行った。結果を図２に示す。
ット（各０．１ｍｇ）を、重量比で１／２０〜１／５０
のＶ８プロテアーゼ（和光純薬工業株式会社製）を用い
て３７℃で３０分間加水分解して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを
行った。結果を図２に示す。
【００７６】（ホ）Ｉ型コラーゲンの溶解性 Ｉ型コラーゲンを９０％以上含む実施例１および比較例
１のペプシン可溶性コラーゲンを２Ｍ ＮａＣｌで塩析
し、沈殿として回収後に、２．４Ｍ ＮａＣｌを含む５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩
抽出する操作を３回繰り返した。可溶性のコラーゲンは
０．５Ｍ 酢酸中で１１．５％（Ｗ／Ｖ）硫酸によりさ
らに可溶性のものと不溶性のものに分離した。２．４Ｍ
ＮａＣｌ不溶性のコラーゲンは、１．７Ｍ ＮａＣｌ
を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で一晩抽出する操作を３
回繰り返し、各塩濃度の緩衝液に対する溶解性および非
溶解性成分の割合を求めた。結果を下記の表４に示す。
１のペプシン可溶性コラーゲンを２Ｍ ＮａＣｌで塩析
し、沈殿として回収後に、２．４Ｍ ＮａＣｌを含む５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩
抽出する操作を３回繰り返した。可溶性のコラーゲンは
０．５Ｍ 酢酸中で１１．５％（Ｗ／Ｖ）硫酸によりさ
らに可溶性のものと不溶性のものに分離した。２．４Ｍ
ＮａＣｌ不溶性のコラーゲンは、１．７Ｍ ＮａＣｌ
を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で一晩抽出する操作を３
回繰り返し、各塩濃度の緩衝液に対する溶解性および非
溶解性成分の割合を求めた。結果を下記の表４に示す。
【００７７】
【表４】 塩分画によるコラーゲンの回収 2.4M NaCl溶解性 １．７Ｍ ＮａＣｌ 11.5% (NH 4) 2SO 4 溶解性 非溶解性 溶解性 非溶解性コラーゲン （非Ｉ型） （Ｉ型）＊ （Ｉ型）＊（Ｉ型）＊ 比較例１ 0.7 0.8 98.2 0.2実施例１ 6.6 5.9 2.0 85.5 表４中、＊のコラーゲンは、電気泳動によりＩ型であることを確認した。
【００７８】上記のように、本発明のコラーゲンは、水
に対する溶解性が低い。この結果は、本発明のコラーゲ
ンは、より安定性が高いことを示唆している。
に対する溶解性が低い。この結果は、本発明のコラーゲ
ンは、より安定性が高いことを示唆している。
【図１】Ｉ型コラーゲンのBAKERBOND C4逆相カラムの溶
出パターンを示す。
出パターンを示す。
【図２】Ｉ型コラーゲンの部分加水分解物の電気泳動パ
ターンを示す。レーン１は、比較例１の皮膚由来のコラ
ーゲンを示し、レーン２は、実施例１の腸由来のコラー
ゲンを示す。
ターンを示す。レーン１は、比較例１の皮膚由来のコラ
ーゲンを示し、レーン２は、実施例１の腸由来のコラー
ゲンを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 591105801 丸大食品株式会社 大阪府高槻市緑町21−３ (72)発明者 河端 信 京都府京都市左京区大原野村町208−２ (72)発明者 大槻 耕三 京都府向日市上植野町南開34−２ (72)発明者 佐藤 健司 京都府京都市左京区浄土寺石橋町16 リバ ーサイドマンション302号
Claims (5)
- 【請求項１】［α１（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニッ
ト構造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水酸
化比（ヒドロキシリシン／リシン）が０．４８以上及び
／又はプロリンの水酸化比（ヒドロキシプロリン／プロ
リン）が０．９５以上であるＩ型コラーゲン。 - 【請求項２】［α１（Ｉ）］2α２（Ｉ）のサブユニッ
ト構造を有するＩ型コラーゲンであって、リシンの水酸
化比（ヒドロキシリシン／リシン）が０．４８以上及び
プロリンの水酸化比（ヒドロキシプロリン／プロリン）
が０．９５以上であるＩ型コラーゲン。 - 【請求項３】リシンの水酸化比（ヒドロキシリシン／リ
シン）が０．４１以上及び／又はプロリンの水酸化比
（ヒドロキシプロリン／プロリン）が１．０１以上であ
るＩ型コラーゲンのα１（Ｉ）サブユニット。 - 【請求項４】リシンの水酸化比（ヒドロキシリシン／リ
シン）が０．４１以上及びプロリンの水酸化比（ヒドロ
キシプロリン／プロリン）が１．０１以上であるＩ型コ
ラーゲンのα１（Ｉ）サブユニット。 - 【請求項５】哺乳動物の腸から得られる請求項１または
２に記載のＩ型コラーゲン。
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|---|---|---|---|
| JP24657894A JP3521238B2 (ja) | 1994-08-04 | 1994-10-12 | 水酸化比の高いｉ型コラーゲン |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP6-183797 | 1994-08-04 | ||
| JP18379794 | 1994-08-04 | ||
| JP24657894A JP3521238B2 (ja) | 1994-08-04 | 1994-10-12 | 水酸化比の高いｉ型コラーゲン |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08100153A true JPH08100153A (ja) | 1996-04-16 |
| JP3521238B2 JP3521238B2 (ja) | 2004-04-19 |
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ID=26502087
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24657894A Expired - Lifetime JP3521238B2 (ja) | 1994-08-04 | 1994-10-12 | 水酸化比の高いｉ型コラーゲン |
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|---|---|
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU729068B2 (en) * | 1997-04-03 | 2001-01-25 | Clearcoll Pty Ltd | Improved process for the manufacture of collagen |
| KR100910120B1 (ko) * | 2007-03-23 | 2009-08-03 | 강릉원주대학교산학협력단 | 오징어 외피 유래 콜라겐 및 이를 함유한 미용 마스크 팩 |
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-
1994
- 1994-10-12 JP JP24657894A patent/JP3521238B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
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