JPH10182700A - 高圧液体クロマトグラフィーによるインシュリンの単離方法 - Google Patents

高圧液体クロマトグラフィーによるインシュリンの単離方法

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JPH10182700A
JPH10182700A JP9347383A JP34738397A JPH10182700A JP H10182700 A JPH10182700 A JP H10182700A JP 9347383 A JP9347383 A JP 9347383A JP 34738397 A JP34738397 A JP 34738397A JP H10182700 A JPH10182700 A JP H10182700A
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography

Abstract

(57)【要約】 【課題】 真性糖尿病治療用の注射液において、精製工
程をさらに行うことなく、直接使用に適するインシュリ
ンを得るための単離方法を提供する。 【解決手段】 １.１ＭＰａ〜４０ＭＰａの圧力下で圧
力安定性酸性陽イオン交換物質を用いて単離が行われ
る、クロマトグラフィーによりインシュリンを単離する
方法等に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、１.１ＭＰａ〜４
０ＭＰａの圧力下で圧力安定性酸性陽イオン交換物質を
用いて単離が行われることを特徴とする、クロマトグラ
フィーによりインシュリンを単離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】組換インシュリンの調製において、イン
シュリンの微生物における生合成は、天然インシュリン
のＡ及びＢ鎖の配列以外に、連結ペプチド及び融合蛋白
質配列からなる一本鎖前駆体分子を経由して、形質転換
大腸菌のようなバクテリアにおいて行われる。後者は、
遺伝子工学上の理由により完全蛋白質のＮ末端に結合
し、形質転換大腸菌において封入体の形で得られるイン
シュリン含有生産物の発現の原因となる。この作業の目
的は、多段階の蛋白質化学製造工程においてこの融合蛋
白質からインシュリンを得ることである。すべての場合
において、この作業は、膵臓ベータ細胞中におけるイン
シュリンの天然の生合成と同じように、（プレ）プロイ
ンシュリンのフォールディングの工程の経由を伴う。
（プレ）プロインシュリンは、（例えばトリプシンを用
いた）酵素切断により、ジ−Ａｒｇ−（Ｂ31〜32）−イ
ンシュリン及びモノ−Arg −Ｂ31−インシュリンである
他のインシュリン前駆体並びに連結ペプチド（３５アミ
ノ酸残基まで）からなる切断混合物へと変換される。不
完全な中間体である脱−Ｔｈｒ−Ｂ30−インシュリン又
はＡｒｇ−Ａ０−インシュリン及びプレインシュリンの
ような、トリプシンのプロテアーゼ活性により産生され
る副産物も製造される。US 5 101 013は、Ｓ−セファロ
ース（登録商標）、フラクトゲル（登録商標）、ＴＳＫ
又はＳＰトリアクリル（登録商標）のような強酸性イオ
ン交換体上での大気圧又は中圧クロマトグラフィーによ
るインシュリン及びインシュリン誘導体の前記混合物の
分離を開示している。公知のクロマトグラフィー物質は
圧力に安定でなく、1 ＭＰａ以上の圧力下のクロマトグ
ラフィー・カラム中で圧縮され、そしてインシュリン含
有混合物の分離が不可能となるのである。他の公知のイ
ンシュリンの単離方法は、脂肪親和的に修飾されたシリ
カゲル上での高圧液体クロマトグラフィーである（US 5
245 008、EP 0 547 544）。
【０００３】大気圧を使用する陽イオン交換精製方法で
は、最適化された慣用のゲル物質を使用しても、要求さ
れる程度の組換インシュリンの精製を達成するのに必要
な分離効率が得られない。最新の調製用ゲル物質、例え
ば、Poros ５０μm／Perseptiv、Source ３０μm／Phar
macia又はMakropep ５０μm／BioRadを用いるクロマト
グラフィーは、中圧の工程で行われる。小粒子サイズの
ゲル（例えば、Source１５μm）を用いての中圧クロマ
トグラフィーは、分離効率に関して僅かに選択性を改良
するだけであり、その結果、この場合においてもインシ
ュリン中のごく小さな不純物を除去するために、最終の
精製工程として必然的に高圧液体クロマトグラフィー
（High-pressure liquid chromatography: HPLC）が行
われる。蛋白質の変性の危険性、ＲＰシリカゲル相の滲
出（bleeding ）及び洗浄不足などの逆相ＨＰＬＣの不
利な点は受け入れなければならず、さらに、平均的以上
の費用と時間が必要となる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】酵素的切断反応からイ
ンシュリンを得るための改良した分離及び単離方法を提
供する本発明の研究において、インシュリン及びインシ
ュリン誘導体混合物の圧力安定性酸性陽イオン交換物質
による１.１ＭＰａ〜４０ＭＰａの圧力下でのクロマト
グラフィーにより、優れた効果が達成できることが見い
だされた。真性糖尿病治療用の注射液において、このよ
うに単離されたインシュリンは、精製工程をさらに行う
ことなく、直接使用するのに適している。
【０００５】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明は、
１.１ＭＰａ〜４０ＭＰａの圧力下で圧力安定性酸性陽
イオン交換物質を用いて単離が行われることを特徴とす
る、クロマトグラフィーによりインシュリンを単離する
方法に関する。インシュリンなる用語は、例えばヒト・
インシュリンやブタ・インシュリンのような動物起源や
ヒト起源の化合物、プロインシュリンやプレインシュリ
ンのようなインシュリン前駆体、又は遺伝学的に修飾さ
れた微生物により発現される組換インシュリンやインシ
ュリン誘導体を意味する。インシュリンは、例えば、脱
−Ｐｈｅ−Ｂ１−インシュリン、ジアルギニン−インシ
ュリン（Ｂ31、Ｂ32）、モノアルギニン−インシュリ
ン、ジフェニルアラニン−インシュリン（Ｂ31、Ｂ32）
（US 4 601 852）、又はＧｌｙA21−ＡｒｇB31−Ａｒ
ｇB32ヒト・インシュリン（EP 368 187）のように化学
的又は酵素的誘導化（derivatization）により修飾され
得る。
【０００６】本発明の方法に好適に用いられるインシュ
リンは、下記式(Ｉ)：
【化２】 （式中、Ｒ30は遺伝子にコードされ得るＬ−アミノ酸残
基を示し、Ｘは水酸基又は遺伝子にコードされ得るＬ−
アミノ酸残基を示し、ｎは０〜１０の整数を示し、Ｙは
水素原子又はＬ−フェニルアラニン残基を示し、Ｚは遺
伝子にコードされ得るＬ−アミノ酸残基を示し、及び、
残基Ａ２〜Ａ20はヒト・インシュリン、動物インシュリ
ン又はインシュリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応
し、残基Ｂ２〜Ｂ29はヒト・インシュリン、動物インシ
ュリン又はインシュリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に
対応する。）を有する。
【０００７】好適なインシュリンは、上記式(Ｉ)におい
て、Ｒ30はＬ−アラニンおよびＬ−スレオニンからなる
群より選択される残基を示し、ＸはＬ−アルギニン、Ｌ
−リジンおよびＬ−フェニルアラニンからなる群より選
択されるＬ−アミノ酸残基を示し、ｎは０〜６の整数を
示し、Ｚはグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−
スレオニン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン
酸からなる群より選択される残基を示し、Ａ１〜Ａ20又
はＢ２〜Ｂ29は、ヒト、ブタ又はウシ・インシュリンの
アミノ酸配列を表す。特に好適には、ヒト・インシュリ
ン及びＧｌｙA21−ＡｒｇB31−ＡｒｇB32−ヒト・イン
シュリンが単離される。
【０００８】ヒト・インシュリンのＡ１〜Ａ20のアミノ
酸配列は： Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys （配列番号１） である。ヒト・インシュリンのＢ１〜Ｂ29のアミノ酸配
列は： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys （配列番号２） である。
【０００９】
【発明の実施の形態】インシュリンは、比較的汚染され
た状態又は（例えばゲルクロマトグラフィーによる）前
精製段階のいずれも使用し得る。繰り返し結晶化及びゲ
ルクロマトグラフィーに付した後であっても、インシュ
リンは依然として、分子量が極めて類似しているが、適
切に選択されたｐＨにおいてはその電荷がお互いに、そ
してインシュリンとは異なる、インシュリンと複合体を
形成するインシュリン様随伴物質により汚染されている
（ＵＳ 4 129 560）。このような物質の例は：脱アミド
・インシュリン、アルギニン−及びジアルギニン−イン
シュリン及びインシュリン−エチル−エステルである。
【００１０】圧力安定性酸性陽イオン交換物質なる用語
は、例えば、ポリスチレンと、スルホ基、特に、Ｒ−Ｏ
−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−Ｃ
Ｈ2−ＳＯ3−基により変性されたジビニルベンゼンとの
コポリマーのような物質を意味する。以下の生産物が特
に好適である。Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Swede
nにより供給され、圧力に安定で球形かつ多孔性の、粒
径約３０μmのSource（登録商標）30S（Downstream, N
o.19, (1995), Pharmacia Biotech AB, S-751 82 Uppsa
la, Sweden, pages 3-8）。Pharmacia Biotech AB, Upp
sala, Swedenにより供給され、圧力に安定で球形かつ多
孔性の、平均粒径約１５μmのSource（登録商標）15S
。Perseptivにより供給される、Poros ５０μm。Biora
dにより供給される、Makroprep ５０μm。
【００１１】溶離液は、溶離液のｐＨを一定に保つ緩衝
物質、水及び有機溶媒を含む。適当な緩衝物質は文献に
開示されており、例えば、リン酸塩、アルカリ金属、酢
酸カリウムのようなアルカリ土類金属塩、クエン酸アン
モニウム、クエン酸ナトリウム、酢酸塩、硫酸塩又は塩
化物である。溶離液は、さらに、アルコール、ケトン、
酢酸メチル、ジオキサン又はアセトニトリルのような水
混和性有機溶媒を含む。ｎ−又はイソ−プロパノール、
メタノール、エタノール又はブタノールのような（Ｃ1
〜Ｃ4）アルコールが好適に用いられる。
【００１２】クロマトグラフィーに用いられる水混和性
有機溶媒の濃度は、１０〜５０容量パーセント、好適に
は２０〜４０容量パーセント、特に好適には２５〜３５
容量パーセントである。緩衝物質の濃度は、溶媒として
の水に基づき約１mmol／リットル〜１４０mmol／リット
ル、好適には２mmol／リットル〜１２０mmol／リットル
である。緩衝液に添加し得るこれ以外の添加物は、例え
ば、塩、好適には生理学的に許容される鉱酸塩、蟻酸、
酢酸、乳酸又はクエン酸、好適には乳酸のような１種以
上の有機酸、塩基、好適にはＮａＯＨ、及び／又は防腐
剤である。緩衝液の好適なpHは、約ｐＨ２.５〜５.５、
特に好適には約３.５〜４.０である。有機酸の濃度は広
い範囲で変わり得る。有利な量は、溶媒としての水に基
づき１０から１００mmol／リットル、好適には２５〜５
０mmol／リットルである。クロマトグラフィーの温度は
０℃〜５０℃、好適には１５℃〜３０℃、特に好適には
１５〜２０℃である。クロマトグラフィーの操作圧力は
本質的に一定である。クロマトグラフィーは様々な圧力
下、例えば、１.１〜４０ＭＰａ、特に１.５〜１０ＭＰ
ａで行うことができる。溶離の流速は、２００〜１００
０cm／ｈ、最大２０００cm／ｈである。
【００１３】カラムへの負荷、クロマトグラフィー並び
にインシュリン及びインシュリン誘導体の溶離は、公知
の、従来用いられてきた技法により行われる。精製され
るべきインシュリン溶液のカラムへの負荷は、好適に
は、水性アルコール又は純粋に水性の緩衝液を用いて行
われる。インシュリン溶液は、約１〜１０％、好適には
３％の蛋白質含量を有する。圧力安定性酸性陽イオン交
換体の負荷は、例えば、インシュリン混合液を−好適に
は前述した組成を有し、前述のｐＨを有する−緩衝液に
溶解し、得られた溶液を圧力安定性酸性陽イオン交換体
に接触させることにより行うことができる。
【００１４】溶離液は、原則として前述の緩衝液と類似
の組成を有し得るが、好適には３.５〜４.０のｐＨを有
する。特に好適な溶離方法は、溶離液が塩濃度の時間的
勾配、好適には直線性を示すものである。この濃度勾配
は、溶離の開始時には溶離液に低濃度の塩（極限の場合
はゼロ）を存在させ、溶離過程の間に塩濃度を増大させ
ることにより得ることができる。このようにして、蛋白
質混合液の特に効果的な分離を達成することが可能であ
る。好適な塩濃度勾配は、（溶離の開始時に）０mol塩
／リットル付近〜（溶離の終了時に）０.８mol塩／リッ
トル、特に好適には、（溶離の開始時に）約０.１０〜
（溶離の終了時に）約０.２５mol／リットルである。添
加する塩として好適なものは、多くの有機及び無機塩で
ある。アンモニウム塩やアルカリ金属塩のような生理学
的に許容される塩が好適であり、特に好適なものはナト
リウム塩であり、特に塩化ナトリウムである。
【００１５】本発明の分離方法は、カラムの方法で行わ
れる。温度は、好適にはイオン交換クロマトグラフィー
で一定に保持されるが、広い範囲で変化し得る。好適な
温度範囲は、約−１０℃〜約５０℃であり、特に約１５
〜約２５℃である。クロマトグラフィー後の溶離物のイ
ンシュリンの濃縮は、亜鉛塩による沈殿または結晶化に
より行われる。さらに場合により、減圧下における蒸留
法により溶液から予め実質的に溶媒を除去すること、ま
たは水で希釈してその濃度を下げることも可能である。
いずれにせよ、上清の蛋白質含量を＜５０mg／リットル
に保持するために、沈殿又は結晶化の前には溶媒の濃度
は１０％以下にしなければならない。得られたインシュ
リン沈殿物は、デカンテーション、遠心分離又は濾過に
より単離し、及び乾燥することができる。本発明の方法
は、分析用クロマトグラフィーばかりでなく、特に本発
明の方法が調製用高圧液体クロマトグラフィー（high-p
ressure liquid chromatography：ＨＰＬＣ）系で行わ
れる場合に、調製用クロマトグラフィーにも好適であ
る。「調製用クロマトグラフィー」なる用語は、各々の
クロマトグラフィーの実験において純粋な生成物を、単
に分析するだけでなく単離する目的の精製方法を意味す
る。純粋な生成物の量は広い範囲で変化し得、例えば、
１mg〜５.０kg、好適には５０mg〜２.５kgである。
【００１６】
【実施例】本発明の方法は、以下の実施例において詳細
に記載される。パーセンテージのデータは、他に示され
ない限り容量に基づく。 実施例１ 緩衝液Ａ：水に３０％ｎ−プロパノール、５０mM乳酸、
０.０１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ３.５ 吸着剤：Source（登録商標）S １５μm カラム容積：５cm×２５cm 調製用ＨＰＬＣカラム（５cm×２５cm、カラム容量約５
００ml）を、５０％水性エタノール中のSource S １５
μmの懸濁液で充填し、緩衝液Ａで平衡化した。この目
的のため、この緩衝液は流速９８ml／分でポンプでカラ
ムに送られた。この間１.９ＭＰａの圧力が加えられ
た。この場合において、このカラムはフラクション・コ
レクター及びＵＶ検出機（２５４／２８０nm）が付属し
たクロマトグラフィー系の一部であった。精製されるべ
き粗製ヒト組換インシュリン５ｇが５００mlの緩衝液Ａ
に溶解され、上記と同じ流速でカラム上にポンプで送ら
れた。それに続く洗浄の期間において、１０００mlの緩
衝液Ａを用いた新たな平衡化が行われた。溶離に際し、
緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ＝緩衝液Ａ＋０.１５
Ｍ ＮａＣｌ）からなる直線的ＮａＣｌ勾配が勾配混合
系によりカラムの低圧側にポンプで送られ、ＵＶ溶離図
が得られた。溶出物が分画され、個々の画分が従来より
用いられている分析的ＨＰＬＣ法により調べられた。要
求される純度に相当する画分が集められた。水で希釈し
た後（１容量の溶出物＋２容量の水）、高度に精製され
たインシュリンが、公知の方法によりＺｎ2+インシュリ
ンとしての結晶化により単離された。 収量：３.８ｇ；純度 ＞９８％
【００１７】ＨＰＬＣの分析 インシュリンを含む１２.５mgの蛋白質が２５mlの溶離
液Ｃ（溶離液参照）に溶解された。０.０２mlが高圧液
体クロマトグラフィー・カラムに充填された。 カラム：ＥＴ 250／8／4 (R)Nucleosil 300-5 C18 (Macherey & Nagel, Aachen, Germany) 溶離液：貯蔵液：二水素リン酸ナトリウム ＊Ｈ2Ｏ ４
１.４ｇ ２回蒸留水 １８００ml 85％のリン酸でpH2.5に調整され、２回蒸留した水で200
0mlにする。
【００１８】
【００１９】 勾配の傾斜は、溶離されるインシュリンの主なピークが
１７〜２１分になるように調整されなければならなかっ
た。 温度： ４０℃ 総実験時間： ４５分 流速： １ml／分 検出： ２１０nm
【００２０】実施例２ 脱−ＴｈrB30−ヒト・インシュリン（正しいシスチン架
橋を有する配列番号１及び３のインシュリン）、Ａｒｇ
−Ｂ31−ヒト・インシュリン（正しいシスチン架橋を有
する配列番号１及び５のインシュリン）及びＧｌｙA21
−ＡｒｇB31−ＡｒｇB32−ヒト・インシュリン（正しい
シスチン架橋を有する配列番号６及び４のインシュリ
ン）の混合液５ｇが実施例１と同様の方法で精製され
た。この混合液は、典型的に組換インシュリンの単離で
製造される。該混合液はさらに、非特異的な酵素切断に
より極めて微量の他の不純物を含み、医薬物質として使
用するためにはその濃度を下げなければならなかった。
【００２１】様々な構成成分が実施例１と同様に溶離さ
れた。ＵＶ図形はＮａＣｌ勾配が増え等電点が上昇する
につれて個々の構成成分の選択的分離を示した（脱−Ｔ
ｈｒ B30−ヒト・インシュリン：Ｉ；ＡｒｇB31−ヒト・
インシュリン：II；ＧｌｙA2 1−ＡｒｇB31−ＡｒｇB32
−ヒト・インシュリン：III）。分画されたカラム溶出
物は実施例１と同様に分析され、要求される高純度生成
物ＧｌｙA21−ＡｒｇB31−ＡｒｇB32−ヒト・インシュ
リンが結晶化により単離された。 収量：１.７８ｇ；純度 >98.5%
【００２２】実施例３ （比較例）実施例２と同様の混合液５ｇが、３９ml／分
の溶離液流速で１ＭＰａ（１０bar）下、中圧クロマト
グラフィーの条件下で精製された。ＵＶ溶離図形は実施
例２と類似した構成成分の分離を示した。しかしなが
ら、この図形の経過だけからでも、個々の構成要素の分
離の鮮明さが劣ることが明らかであった。ＨＰＬＣの分
析により、個々のインシュリンの不純物が明確に重複し
ていることが確認された。精製された生成物は結晶化に
より単離された。やや低い収量にかかわらず、純度は医
薬物質として要求される規格に一致していなかった。そ
れゆえ調製物は、それに続く逆相シリカゲル上の調製用
ＨＰＬＣでの精製が必要であった。 収量：１.５ｇのＧｌｙA21−ＡｒｇB31−ＡｒｇB32−ヒ
ト・インシュリン；純度：９７.６％
【００２３】
【発明の効果】以上のように、本発明の方法により単離
されたインシュリンは、真性糖尿病治療用の注射液にお
いて、精製工程をさらに行うことなく、直接使用に対し
安定である。
【００２４】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Protein 起源：Escherichia coli 配列の特徴： 特徴を表す記号：Protein 存在位置：１．．２１ 配列： Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Thr Cys Asn 20
【００２５】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Protein 起源：Escherichia coli 配列の特徴： 特徴を表す記号：Protein 存在位置：１．．３０ 配列： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30
【００２６】配列番号：３ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Protein 起源：Escherichia coli 配列の特徴： 特徴を表す記号：Protein 存在位置：１．．２９ 配列： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25
【００２７】配列番号：４ 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Protein 起源：Escherichia coli 配列の特徴： 特徴を表す記号：Protein 存在位置：１．．３２ 配列： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30
【００２８】配列番号：５ 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Protein 起源：Escherichia coli 配列の特徴： 特徴を表す記号：Protein 存在位置：１．．３１ 配列： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg 20 25 30
【００２９】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Protein 起源：Escherichia coli 配列の特徴： 特徴を表す記号：Protein 存在位置：１．．２１ 配列： Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Thr Cys Asn 20

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １.１ＭＰａ〜４０ＭＰａの圧力下で圧
    力安定性酸性陽イオン交換物質を用いて単離を行う、ク
    ロマトグラフィーによりインシュリンを単離する方法。
  2. 【請求項２】 式（Ｉ）： 【化１】 （式中、 Ｒ30は遺伝子にコードされ得るＬ−アミノ酸残基を示
    し、 Ｘは水酸基又は遺伝子にコードされ得るＬ−アミノ酸残
    基を示し、 ｎは０〜１０の整数を示し、 Ｙは水素原子又はＬ−フェニルアラニン残基を示し、 Ｚは遺伝子にコードされ得るＬ−アミノ酸残基を示し、
    及び、 残基Ａ２〜Ａ20はヒト・インシュリン、動物インシュリ
    ン又はインシュリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応
    し、残基Ｂ２〜Ｂ29はヒト・インシュリン、動物インシ
    ュリン又はインシュリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に
    対応する。)で表されるインシュリンを単離する請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】 式(Ｉ)において、 Ｒ30はＬ−アラニン又はＬ−スレオニンを示し、 ＸはＬ−アルギニン、Ｌ−リジン又はＬ−フェニルアラ
    ニンからなる群より選択されるＬ−アミノ酸を示し、 ｎは０〜６の整数を示し、 Ｚはグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオ
    ニン、Ｌ−アスパラギン酸又はＬ−グルタミン酸を示
    し、 Ａ１〜Ａ20又はＢ２〜Ｂ29は、ヒト、ブタ又はウシ・イ
    ンシュリンのアミノ酸配列を表すインシュリン誘導体を
    単離する請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 ヒト・インシュリンを単離する請求項１
    〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 １０〜５０容量パーセント、好適には２
    ０〜４０容量パーセント、特に好適には２５〜３５容量
    パーセントの（Ｃ1〜Ｃ4）アルカノールを含有するＨ2
    Ｏ／（Ｃ1〜Ｃ4）アルカノール混合液を用いて溶離を行
    なう請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 圧力安定性酸性陽イオン交換物質とし
    て、ポリスチレンとスルホ基を有するジビニルベンゼン
    との架橋ポリマーを用いる請求項１〜５のいずれか一項
    に記載の方法。
  7. 【請求項７】 ｐＨ２.５〜５.５、好適には３.５〜４.
    ０にて、カラム容量１リットル当たり５〜１５ｇの蛋白
    質を圧力安定性酸性陽イオン交換体に負荷する請求項１
    〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 溶離に使用されるＨ2Ｏ／（Ｃ1〜Ｃ4）
    アルカノール混合液が、（Ｃ1〜Ｃ4）アルカノールとし
    てエタノール又はイソプロパノール、特にプロパノール
    を含有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 溶離液のｐＨを３.５〜４.０に調整する
    請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 負荷及び溶離液が緩衝物質、好適には
    有機酸をベースとする緩衝物質、特に好適には乳酸をベ
    ースとする緩衝物質を含有する請求項１〜９のいずれか
    一項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ０〜０.８mol／リットル、特に０.１
    ０から０.２５mol／リットルのアンモニウム又はアルカ
    リ金属塩の勾配により溶離が行われる請求項１〜１０の
    いずれか一項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 クロマトグラフィーを１.５ＭＰａ〜
    １０ＭＰａの圧力下で行なう請求項１〜１１のいずれか
    一項に記載の方法。
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