ES2233990T3 - Procedimiento para la obtencion de insulina mediante cromatografia en liquido a alta presion. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UN PROCESO PARA LA OBTENCION DE INSULINA, EN EL QUE LA SEPARACION SE REALIZA CON MATERIAL DE INTERCAMBIO CATIONICO ACIDO ESTABLE A LA PRESION, SIENDO ESTA DE 1,1 MPA A 40 MPA.

Description

Procedimiento para la obtención de insulina mediante cromatografía en líquido a alta presión.

En la preparación de insulinas recombinantes la biosíntesis microbiana de la insulina se efectúa en bacterias, tales como Escherichia coli transformada, se efectúa a través de una molécula precursora de una cadena que, junto a la secuencia de insulina nativa de las cadenas A y B, contiene un péptido de conexión y una secuencia de proteína de fusión. Esta última se enlaza, por motivos de tecnología genética, en el extremo N-terminal de la proteína completa y es la responsable de que el producto con contenido en insulina expresado resulte en forma de corpúsculos de inclusión en la E. coli transformada. Es misión de la elaboración poner a disposición insulina a partir de esta proteína de fusión en pasos del proceso de la química de las proteínas de múltiples etapas. Con ello, en cualquier caso, al igual que también en la biosíntesis natural de la insulina en las células beta del páncreas, se recorre la etapa del plegamiento para formar (pre)-proinsulina. La (pre)-proinsulina se transforma, mediante disociación enzimática (p.ej. con tripsina), en una mezcla de disociación que contiene otro precursor de insulina, la di-Arg-(B31-32)-insulina, mono-Arg-B31-insulina y el péptido de conexión (hasta 35 restos aminoácidos). Junto a ello, se forman, además, productos secundarios que son producidos por la actividad de proteasa de la tripsina, tales como productos intermedios incompletos, Des-Thr-B30-insulina o también Arg-A0-insulina y pre-insulina. Es conocido separar las mezclas mencionadas a base de insulina y derivados de insulina, mediante cromatografía a presión normal o a presión media, en intercambiadores de iones fuertemente ácidos, tales como S-Sepharose®, Fraktogel®TSK o SP Trisacryl® (documento US 5 101 013). Los materiales de cromatografía conocidos no son estables a la presión y se comprimen en las columnas de cromatografía a una presión por encima de 1 MPa, no siendo ya entonces posible una separación de las mezclas con contenido en insulina.

Otro procedimiento conocido para la obtención de insulina es la cromatografía en líquido a alta presión en gel de sílice lipófilamente modificado (documentos US 5 245 008, EP 0 547 544).

Los procedimientos de purificación con intercambiadores de cationes a presión normal tampoco alcanzan con los materiales de gel tradicionales optimizados los rendimientos de separación que se requieren para conseguir el grado de purificación deseado para la insulina recombinante. La cromatografía con materiales de gel preparativos modernos, p. ej. Poros 50 \mum/Perseptiv, Source 30 \mum/Pharmacia o Makropep 50 \mum/BioRad se lleva a cabo en el procedimiento a presión media. La cromatografía a presión media con geles de menor tamaño de partículas (p. ej. Source 15 \mum) sólo proporciona escasas mejoras en la selectividad con respecto al rendimiento de separación, de manera que también aquí sigue siendo inevitable la cromatografía en líquido a alta presión (HPLC) como última etapa de alta purificación para la eliminación de las más mínimas impurezas en las insulinas. Han de considerarse los inconvenientes de una HPLC de fase reversa (FR), tal como el riesgo de desnaturalización de la proteína, la extinción de la fase FR-gel de sílice y medidas de limpieza en el lugar ("Cleaning in Place") menos satisfactorias y requieren un coste en dinero y tiempo superior al promedio.

En el empeño de poner a disposición mejores procedimientos de separación y aislamiento para la obtención de insulina a partir de reacciones de disociación enzimáticas, se ha encontrado ahora que este objetivo se puede alcanzar mediante cromatografía de las mezclas de insulina y derivados de insulina en intercambiadores de cationes ácidos, estables a la presión, a un a presión de 1,1 MPa a 40 MPa. La insulina, así obtenida, se adecua para el empleo directo sin etapas de purificación adicionales en soluciones para inyección para el tratamiento de diabetes mellitus.

Por lo tanto, la invención se refiere a un procedimiento para obtener insulina mediante cromatografía, que se caracteriza porque la separación se lleva a cabo con materiales intercambiadores de cationes ácidos, estables a la presión, a una presión de 1,1 MPa a 40 MPa.

Por el término insulina se entienden compuestos de origen animal o humano, p. ej. insulina humana o insulina de cerdo, precursores de insulina, tales como pro-insulina o pre-insulina, o insulina recombinante o derivados de insulina, que son expresados por microorganismos genéticamente modificados. Las insulinas también pueden estar modificadas por derivatización química o enzimática, p.ej. Des-Phe-B1-insulina, diarginininsulina, (B31, B32), monoarginininsulina, difenilalanininsulina (B31, B32) (documento US 4 601 852) o Gly^{A21}-Arg^{B31}-Arg^{B3Z}-insulina humana (documento EP 368 187).

En el procedimiento conforme a la invención se emplean, preferiblemente, insulinas de la fórmula I,

1

en donde

R^{30}

representa el radical de un L-aminoácido genéticamente codificable,

X

representa un grupo hidroxi, un resto L-aminoácido genéticamente codificable,

n

representa un número entero de 0 a 10,

Y

representa un átomo de hidrógeno o un resto L-fenilalanina, y

Z

representa un resto L-aminoácido genéticamente codificable, y en donde

los radicales A2-A20 corresponden a la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana, insulina animal o un derivado de insulina y los radicales B2-B29 corresponden a la secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana, insulina animal o un derivado de insulina.

Preferiblemente, se emplean insulinas de la fórmula I, en donde

R^{30}

representa un radical del grupo L-alanina y L-treonina,

X

representa un resto L-aminoácido del grupo L-arginina, L-lisina y L-fenilalanina,

n

representa un número entero de 0 a 6,

Z

representa un radical del grupo glicina, L-alanina, L-serina, L-treonina, ácido L-aspártico y ácido L-glutámico, y

A1 a A20 o B2 a B29 representa la secuencia de aminoácidos de la insulina humana, de cerdo o bovina.

De manera especialmente preferida, se obtiene insulina humana y Gly^{A21}-Arg^{B31}-Arg^{B32}-insulina humana.

La secuencia de aminoácidos A1 a A20 de insulina humana es:

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser

Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys (SEQ ID NO: 1)

La secuencia de aminoácidos B1 a B29 de insulina humana es:

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu

Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg

Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys (SEQ ID NO: 2)

La insulina puede emplearse tanto en estado relativamente impurificado, como en forma prepurificada (p. ej. mediante cromatografía en gel). La insulina, después de una cristalización múltiple y también después de cromatografía en gel, está todavía impurificada con sustancias acompañantes similares a insulina de peso molecular muy similar que, a pH adecuadamente elegido, se diferencian en su estado de carga entre sí y de la insulina, pero que forman complejos con insulina (documento US 4 129 560). Ejemplos de este tipo de sustancias son:

desamidoinsulina, arginin- y diarginin-insulina y éster etílico de insulina.

Por la expresión materiales intercambiadores de cationes ácidos, estables a la presión, se entienden, por ejemplo, materiales tales como un copolímero a base de poliestireno y divinilbenceno, que están modificados con grupos sulfo, en particular con grupos R-O-CH_{2}-CHOH-CH_{2}-O-CH_{2}CHOH-CH_{2}-SO_{3}^{-}. Son particularmente preferidos los siguientes productos

-

Source®30S, firma Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia, materiales estables a la presión, esféricos y porosos, con un diámetro de partícula de aproximadamente 30 \mum (Downstream, nº 19, (1995), Pharmacia Biotech AB, S-751 82 Uppsala, Suecia, páginas 3-8)

-

Source®15S, firma Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia, materiales estables a la presión, esféricos y porosos, con un diámetro de partícula de 15 \mum por término medio

-

Poros 50 \mum, firma Perseptiv

-

Makroprep 50 \mum, firma Biorad

Los agentes eluyentes contienen una sustancia tampón que mantiene constante el valor del pH del agente eluyente, agua y disolventes orgánicos. Sustancias tampón adecuadas son conocidas por la bibliografía, por ejemplo fosfatos, sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como acetato de potasio, citrato de amonio, citrato, acetato, sulfato o cloruro de sodio. Además, los agentes eluyentes contienen disolventes orgánicos miscibles con agua, tales como alcoholes, cetonas, acetato de metilo, dioxano o acetonitrilo. Preferiblemente, se emplean alcoholes (C_{1}-C_{4}), tales como n- o iso-propanol, metanol, etanol o butanol.

Para la cromatografía, la concentración de los disolventes orgánicos miscibles con agua asciende a 10 hasta 50 por ciento en volumen, preferiblemente a 20 hasta 40 por ciento en volumen, de manera particularmente preferida, a 25 hasta 35 por ciento en volumen. La concentración de la sustancia tampón asciende a aproximadamente 1 mmol/l hasta 140 mmol/l, referida a agua como disolvente, preferiblemente a 2 mmol/l hasta 120 mmol/l. Otros aditivos que se pueden añadir a la solución tampón son, p. ej. sal, preferiblemente sal mineral fisiológicamente compatible, uno o varios ácidos orgánicos, tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido láctico o ácido cítrico, preferiblemente ácido láctico, una base, preferiblemente NaOH, y/o sustancias conservantes. El valor del pH preferido de la solución tampón asciende a aproximadamente 2,5 hasta 5,5, de manera particularmente preferida a aproximadamente 3,5 hasta 4,0. La concentración del ácido orgánico puede oscilar dentro de un amplio intervalo. Cantidades ventajosas son de 10 hasta 100 mmol/l, referidas al agua como disolvente, preferiblemente de 25 hasta 50 mmol/l.

La temperatura durante la cromatografía asciende a 0ºC hasta 50ºC, preferiblemente a 15 hasta 30ºC, de manera particularmente preferida a 15 hasta 20ºC. La presión de trabajo durante la cromatografía es ampliamente constante. La cromatografía puede llevarse a cabo con diferente presión, p. ej. la cromatografía se puede llevar a cabo a una presión de 1,1 hasta 40 MPa, en particular a 1,5 hasta 10 MPa. Los caudales de eluyente se encuentran en 200 hasta 1000 cm/h, como máximo 2000 cm/h.

La carga de las columnas, la cromatografía y la elución de las insulinas y derivados de insulina se efectúan según métodos técnicos conocidos y habituales. La carga de la columna con la solución de insulina a purificar se efectúa preferiblemente con solución tampón acuosa-alcohólica o puramente acuosa. La solución de insulina tiene una proporción de proteínas de aproximadamente 1 a 10%, preferiblemente 3%.

La carga del intercambiador de cationes estable a la presión, ácido, puede efectuarse, por ejemplo, disolviendo la mezcla de insulinas en una solución tampón -preferiblemente con la composición previamente descrita y el valor del pH previamente descrito- y la solución, así obtenida, se pone en contacto con el intercambiador de cationes estable a la presión, ácido.

La solución de elución que, en principio, puede tener una composición similar a la solución tampón previamente descrita, presenta preferiblemente un valor del pH de 3,5 a 4,0. Es particularmente adecuado un procedimiento de elución en el que la solución de elución presente un gradiente de concentración salina en el tiempo con un transcurso preferiblemente lineal. Este gradiente de concentración puede aplicarse, p. ej., debido a que al principio de la elución está presente en la solución de elución una baja concentración salina (en caso límite tendiendo a cero) y debido a que la concentración salina se aumenta durante el proceso de elución. De este modo se puede alcanzar una separación particularmente adecuada de la mezcla de proteínas. Un gradiente de concentración salina preferido varía desde próximo a 0 mol de sal/l (al comienzo de la elución) hasta aproximadamente 0,8 mol de sal/l (al final de la elución), de manera particularmente preferida desde aprox. 0,10 (al comienzo de la elución) hasta aprox. 0,25 mol/l (al final de la elución). Para el aditivo de sal entran en consideración muchas sales orgánicas e inorgánicas. Se prefieren sales fisiológicamente compatibles, tales como sales de amonio y de metales alcalinos, en particular sales de sodio, en particular cloruro de sodio.

El procedimiento de separación conforme a la invención se efectúa en el procedimiento en columna. La temperatura a la que preferiblemente se ha de mantener constante la cromatografía de intercambio de iones puede variarse en un amplio intervalo. Se ha de preferir un intervalo de temperaturas de aprox. -10ºC hasta aprox. 50ºC, en particular de aprox. 15 hasta aprox. 25ºC.

La concentración de la insulina tras la cromatografía a partir de los materiales eluidos se realiza mediante precipitación con sal de zinc o mediante cristalización. En este caso, la solución puede liberarse antes ampliamente de disolvente mediante destilación a presión reducida o su concentración se puede reducir mediante dilución con agua. En cualquier caso, la concentración de disolvente debería encontrarse, antes de la precipitación o cristalización, en 10% o menos, con el fin de mantener el contenido en proteínas en el sobrenadante en < 50 mg/l. Los precipitados de insulina resultantes se pueden aislar y secar mediante decantación, centrifugación o filtración. El procedimiento conforme a la invención no sólo se adecua para la cromatografía analítica, sino también para la cromatografía preparativa, en particular cuando el procedimiento conforme a la invención se lleva a cabo con una instalación de cromatografía en líquido a alta presión (HPLC).

Por la expresión "cromatografía preparativa" se entiende un procedimiento de purificación con el objetivo de obtener, y no sólo de analizar, productos puros por cada paso de cromatografía. La cantidad de los productos puros puede oscilar dentro de amplios límites, por ejemplo de 1 mg a 5,0 kg, preferiblemente de 50 mg a 2,5 kg.

En los Ejemplos siguientes se describe en particular el procedimiento conforme a la invención. Los datos de porcentaje se refieren al volumen, si no se indica de otro modo.

Ejemplo 1

Tampón A:

\hskip0,8cm

30% de n-propanol, ácido láctico 50 mM, NaCl 0,01 M en agua, pH 3,5

Sorbente:

\hskip1cm

Source® S15 \mum

Dimensiones de la columna: 5 cm x 25 cm.

Una columna de HPLC preparativa (5 cm x 25 cm, volumen de la columna de aproximadamente 500 ml) se carga con una suspensión de Source S 15 \mum en etanol acuoso al 50% y se equilibra con tampón A. Para ello, el tampón se bombea a la columna con un caudal de 98 ml/minuto. En este caso, se establece una presión de 1,9 MPa. En este caso, la columna es componente de una instalación de cromatografía con recolector de fracciones y detector de UV (254/280 nm).

5 g de la insulina humana recombinante bruta a purificar se disuelven en 500 ml del tampón A y se bombean a la columna con el mismo caudal que antes. Durante una fase de aclarado posterior, se equilibra de nuevo con 1000 ml de tampón A.

Para la elución se bombea a la columna, a través de un sistema mixto de gradientes y en el lado de baja presión, un gradiente lineal de NaCl a base de tampón A y tampón B (tampón B = tampón A + NaCl 0,15 M) y se alcanza un diagrama de elución UV. El material eluido se fracciona y las fracciones individuales se examinan con ayuda de un método analítico por HPLC habitual. Se reúnen las fracciones que corresponden a la pureza deseada Después de la dilución con agua (1 vol. de material eluido + 2 vol. de agua), la insulina muy purificada se aisla mediante cristalización, según procedimientos conocidos, en forma de Zn^{2+}-insulina.

Rendimiento: 3,8 g de pureza > 98%

Análisis por HPLC

12,5 mg de proteína que contiene insulina se disuelven en 25 ml del eluyente C (véanse los eluyentes). Se aplican 0,02 ml sobre una columna de cromatografía en líquido a alta presión.

Columna:

ET 250/814 \registrado Nucleosil 300-5 C_{18} (Macherey \textamp Nagel, Aachen, Alemania)

Eluyente:

Solución de origen:

41,4 g

\begin{minipage}[t]{95mm} de hidrógeno-fosfato de sodio * H_{2}O ajustar a pH 2,5 1800 ml de agua bidestilada con ácido fosfórico al 85% y completar hasta 2000 ml con agua bidestilada. \end{minipage}

	Eluyente C:	500 ml	de solución de origen
		500 ml	de acetonitrilo
		1000 ml	de agua bidestilada
	Eluyente D:	500 ml	de solución de origen
		1300 ml	de acetonitrilo
		200 ml	de agua bidestilada
		6,4 g \;	de cloruro de sodio

Gradiente:
	Tiempo	% de C	% de D
	0 min	96	4
	6 min	91	9
	15 min	91	9
	25 min	85	15
	30 min	65	35
	32 min	10	90
	35 min	96	4
	45 min	96	4

El aumento del gradiente se ha de ajustar de manera que se eluya el pico principal de la insulina al cabo de 17 a 21 min.

Temperatura:	40ºC
Duración total:	45 min,
Caudal:	1 ml/min
Detección:	210 nm

Ejemplo 2

Conforme al Ejemplo 1 se purifican 5 g de una mezcla de Des-Thr^{B30}-insulina humana (insulina a base de Seq ID No. 1 y No. 3 con puentes cisteína correctos), Arg-B31-insulina humana (insulina a base de Seq ID No. 1 y No. 5 con puentes cisteína correctos), y Gly^{A21}-Arg^{B31}-Arg^{B32}-insulina humana (insulina a base de Seq ID No. 6 y No. 4 con puentes cisteína correctos). La mezcla resulta, típicamente, en la obtención de insulina recombinante. La citada mezcla contiene, además de ello, en virtud de disociaciones enzimáticas inespecíficas, aún muy pequeñas cantidades de otras impurezas, que han de empobrecerse hasta formar la sustancia medicamentosa acabada.

La elución de los distintos componentes se efectúa como en el Ejemplo 1. El diagrama UV muestra una separación selectiva de los componentes individuales según el punto isoeléctrico creciente en el caso de un gradiente de NaCl creciente (Des-Thr^{B30}-insulina humana: I; Arg^{B31}-insulina humana: II; Gly^{A21}-Arg^{B31}-Arg^{B32}-insulina humana: III). El material eluido de la columna fraccionada se analiza como en el Ejemplo 1 y se aisla mediante cristalización el producto muy puro Gly^{A21}-Arg^{B31}-Arg^{B32}-insulina humana deseado.

Rendimiento: 1,78 g; pureza > 98,5%.

Ejemplo 3

Ejemplo comparativo

5 g de una mezcla como en el Ejemplo 2 se purifican bajo las condiciones de la cromatografía a presión media a 1 MPa (10 bar) y un caudal de eluyente de 39 ml/min. El diagrama de elución UV muestra una separación típica de los componentes como en el Ejemplo 2. Sin embargo, en el transcurso de este diagrama se puede reconocer una menor nitidez de separación de los componentes individuales. La analítica por HPLC confirma un claro solapamiento de las distintas impurezas de insulina. El producto purificado se aisla mediante cristalización. A pesar de un rendimiento menor, la pureza no corresponde a la especificación deseada de la sustancia medicamentosa. Para su preparación es necesaria una subsiguiente purificación por HPLC preparativa en gel de sílice de fase reversa.

Rendimiento: 1,5 g de Gly^{A21}-Arg^{B3l}-Arg^{B32}-insulina humana; pureza 97,6%.

Claims (12)

1. Procedimiento para la obtención de insulina por cromatografía, caracterizado porque la separación se efectúa con material intercambiador de cationes ácido, estable a la presión, a una presión de 1,1 MPa hasta 40 MPa.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se obtiene una insulina de la fórmula I,

\vskip1.000000\baselineskip

2

en donde

R^{30}

representa el radical de un L-aminoácido genéticamente codificable,

X

representa un grupo hidroxi, o el resto de un L-aminoácido genéticamente codificable,

n

representa un número entero de 0 a 10,

Y

representa un átomo de hidrógeno o un resto L-fenilalanina, y

Z

representa el resto de un L-aminoácido genéticamente codificable, y los radicales A2-A20 corresponden a la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana, insulina animal o un derivado de insulina, y los radicales B2-B29 corresponden a la secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana, insulina animal o un derivado de insulina.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque se obtiene un derivado de insulina de la fórmula I, en donde R^{30} representa L-alanina o L-treonina y X representa un L-aminoácido del grupo L-arginina, L-lisina o L-fenilalanina, Z representa glicina, L-alanina, L-serina, L-treonina, ácido L-aspártico o ácido L-glutámico, n representa un número entero de cero a 6 y A1 hasta A20 o B2 hasta B29 representan la secuencia de aminoácidos de insulina humana, de cerdo o bovina.

4. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se obtiene insulina humana.

5. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la elución se lleva a cabo por medio de una mezcla de H_{2}O/alcanol (C_{1}-C_{4}), que contiene de 10 a 50 por ciento en volumen, preferiblemente de 20 a 40 por ciento en volumen, en particular de 25 a 35 por ciento en volumen de alcanol (C_{1}-C_{4}).

6. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque como intercambiador de cationes ácido, estable a la presión, se utiliza un copolímero reticulado a base de poliestireno y divinilbenceno con grupos sulfo.

7. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se lleva a cabo una carga de 5 a 15 g de proteína por litro de volumen de la columna del intercambiador de cationes ácido, estable a la presión, a un valor del pH de 2,5 a 5,5, preferiblemente de 3,5 a 4,0.

8. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la mezcla de H_{2}O/alcanol (C_{1}-C_{4}) utilizada para la elución contiene, en calidad de alcanol (C_{1}-C_{4}) etanol o isopropanol, en particular propanol.

9. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el valor del pH de la solución de elución se ajusta a 3,5 hasta 4,0.

10. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la solución de carga y de elución contiene una sustancia tampón, preferiblemente a base de un ácido orgánico, en particular ácido láctico.

11. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se eluye con un gradiente de sales de amonio o de metales alcalinos de 0 a 0,8 mol/l, en particular de 0,10 a 0,25 mol/l.

12. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la cromatografía se lleva a cabo a una presión de 1,5 a 10 MPa.