ES2296407T3 - Procedimiento para la purificacion cromatografica de insulinas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la purificación cromatográfica de insulinas, caracterizado porque un material cromatográfico orgánico, polimérico, estable a la presión, se utiliza como fase estacionaria para la cromatografía de fase inversa, la fase móvil para la elución contiene al menos un disolvente orgánico miscible con agua y al menos una sustancia tampón, y el valor del pH es 7 a 11, estando constituidas las partículas del material cromatográfico por polímeros orgánicos, cuya deformación por la acción de presiones de hasta 70 bar es tan sólo escasa.
Description
Procedimiento para la purificación
cromatográfica de insulinas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la purificación cromatográfica de insulinas,
mejorado.
Los procesos para la preparación de insulina,
junto a los procedimientos enzimáticos y/o de tecnología genética,
se caracterizan esencialmente por los procedimientos cromatográficos
para cumplir las exigencias de pureza extremadamente altas.
Bajo el concepto de insulinas se entienden aquí
las insulinas procedentes de fuentes naturales o las recombinantes
(es decir, expresadas por microorganismos genéticamente modificados)
de origen animal o humano (por ejemplo insulina de cerdo, insulina
de bovino o insulina humana), proinsulinas (por ejemplo productos
precursores de la insulina, preinsulinas) o derivados de
insulina.
Por derivados de insulina se designan en lo
sucesivo los derivados de insulinas de procedencia natural, a saber
insulina humana o insulinas de origen animal, las cuales se
diferencian por la sustitución de al menos un radical aminoácido
que se presenta de forma natural y/o por la adición de al menos un
radical aminoácido y/o de un radical orgánico de la correspondiente
insulina, por lo demás igual a la insulina de procedencia
natural.
La insulina humana es un polipéptido constituido
por 51 aminoácidos. La denominada cadena A (ácida) se compone de 21
radicales aminoácido, la cadena B (básica) de 30 radicales
aminoácido. En las dos cadenas de aminoácidos se presentan 6
radicales cisteína, de los cuales cada dos radicales cisteína están
unidos entre sí a través de un puente de disulfuro (las dos cadenas
se enlazan entre sí por dos puentes de cisteína). En la insulina
humana biológicamente activa las cadenas A y B se unen entre si a
través de dos puentes de cisteína y un puente más aparece en la
cadena A. En la insulina humana (biológicamente activa) están
enlazados entre sí los siguientes radicales cisteína:
- \quad
- A6 - A11
- \quad
- A7 - B7
- \quad
- A20 - B19
Las letras A o B representan la respectiva
cadena de aminoácidos de la insulina, el número representa la
posición del radical aminoácido, la cual se cuenta desde el amino
final hasta el carboxilo final de la respectiva cadena de
aminoácidos.
La preparación de insulina recombinante tiene
lugar habitualmente en las etapas de fermentación y apertura de
células, seguidas de procesos químicos de proteínas y procedimientos
técnicos, habitualmente procesos cromatográficos para la
purificación del producto.
Los procedimientos de tecnología genética
permiten preparar en microorganismos proinsulina humana o
proinsulina (proinsulina de derivados de insulina), que tiene una
secuencia de aminoácidos y/o una longitud de la cadena de
aminoácidos que se desvía de las de la insulina humana. Las
proinsulinas preparadas a partir de células de
Escherichia-coli genéticamente modificadas no
tienen puentes de cisteína correctamente unidos. Un procedimiento
para obtener insulina humana con puentes de cisteína unidos
correctamente a partir de E. coli se conoce, por ejemplo,
del documento EP 0 055 945. Procedimientos mejorados para la
preparación de insulina humana y derivados de insulina con puentes
de cisteína correctamente unidos se describe en los documentos EP 0
600 372 A1 (US 5,473,049) y en el documento EP 0 668 292 A2 (US
5,663,291).
La proinsulina preparada a partir de
microorganismos genéticamente modificados, un precursor de insulina,
se aísla primeramente de las células, se pliega correctamente y,
después, se transforma enzimáticamente en insulina humana. La
mezcla de los productos de ruptura que resultan de los procesos
enzimáticos de peptidación contiene, junto a productos secundarios
no deseados, tanto la sustancia valiosa como también sustancias
concomitantes parecidas a la insulina, no deseadas, las cuales no
se diferencian claramente de la sustancia válida ni en el peso
molecular ni en otras propiedades físicas, lo que dificulta mucho la
separación y purificación precisamente a gran escala técnica.
Los procesos técnicos del procedimiento de
purificación son diferentes procedimientos cromatográficos,
conectados sucesivamente uno tras otro (por ejemplo cromatografía
de adsorción, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía
de fase inversa o, respectivamente, cromatografía de fase inversa de
alta presión o combinaciones de ellas) en parte en varias etapas
con diferentes materiales soporte, en parte con subsiguiente
cristalización, alcanzándose la purificación propiamente dicha por
cromatografía. En este caso, la separación de las sustancias
concomitantes parecidas a la insulina tiene lugar en
intercambiadores iónicos o en soportes de gel de sílice de fase
inversa.
La purificación final
(End-polishing) (separación de las impurezas más
pequeñas, como última etapa de purificación) se lleva a cabo
habitualmente en la zona de elevada presión con una cromatografía en
gel de sílice de fase inversa (RP-HPLC = Reversed
Phase High Pressure Liquid Chromatography, cromatografía líquida de
alta presión, de fase inversa).
Por gel de sílice de fase inversa (o,
respectivamente gel de sílice de fase invertida, es decir modificada
lipofílicamente, o sea hidrófuga) se entiende un material de
silicato sobre el que se ha depositado una matriz hidrófuga.
Ejemplos de matrices hidrófugas son alcanos con una longitud de
cadena de 3 a 20 átomos de carbono, especialmente 4 a 18 átomos de
carbono. Los tamaños de grano se sitúan en el intervalo de 10 a 50
\mum, las amplitudes de poro en 50 a 300 A.
Ejemplos de procedimientos cromatográficos que
conforme al estado actual de la técnica utilizan geles de sílice RP
(geles de sílice modificados lipofílicamente) son EP 0 547 544 A2
(US 5,621,073) o EP 0 474 213 A1 (US 5,245,008). Según el estado
actual de la técnica sólo por la utilización de geles de sílice de
fase inversa se pueden cumplir las elevadas exigencias impuestas a
la pureza de las insulinas que se han de preparar. Pero la
utilización de gel de sílice de fase inversa tiene desventajas
decisivas:
Los geles de sílice de fase inversa sólo son
estables en el intervalo de pH 2 a pH 10. En el caso de la
cromatografía de productos de fermentación siempre se encuentran
contenidos productos secundarios de elevado peso molecular, los
cuales se adsorben de forma duradera y no se pueden desorber con la
elución habitual. Estos productos secundarios se van enriqueciendo
con el tiempo sobre el gel de sílice RP (se denomina envejecimiento
del adsorbente). Una regeneración o, respectivamente, una limpieza
in situ (CIP) se consigue generalmente sólo por lavado con
lejía de sodio diluida. Por consiguiente, en cada etapa de CIP se
destruye una parte del gel de sílice RP, cuyo continuo
reemplazamiento es muy costoso. Además, en las insulinas sobre geles
de sílice se corre el riesgo de la desnaturalización.
Se conocen muchos ensayos para reemplazar los
geles de sílice RP en base de silicatos. Ensayos con material RP en
base de óxido de aluminio o dióxido de titanio (ambos materiales no
son plenamente estables al pH, pero al menos más estables que gel
de sílice) han puesto de manifiesto que la separación sólo es
insuficiente y que no se alcanzan las especificaciones requeridas
en lo referente a la pureza.
Otra propiedad necesaria de los materiales
cromatográficos es su estabilidad frente a la presión. Por
materiales cromatográficos poliméricos estables a la presión se
entienden partículas (que se pueden presentar en todas las formas
posibles tales como en forma de varitas, en forma de fragmentos o,
preferentemente, en forma esférica y que preferentemente presentan
diámetros comprendidos entre 10 y 35 \mum) de polímeros orgánicos,
cuya deformación por la acción de la presión (hasta 70 bar) es tan
sólo escasa. El material que se encuentra en la columna
cromatográfica tiene que estar tan bien compactado que no existan
espacios huecos (la calidad de la empaquetadura es decisiva para el
resultado de la separación). Para la compactación de columnas se
conocen fundamentalmente dos técnicas distintas, las cuales se
pueden aplicar también en combinación. Existe el método de
comprimir la empaquetadura mediante un émbolo (generalmente
accionado hidráulicamente) (DAC = Direct Axial Compression,
compresión axial directa) o, respectivamente, compactar la columna
hidrodinámicamente mediante una bomba de alta presión, es decir
comprimir una suspensión de líquido y partículas en la columna. En
ambos casos, la práctica demuestra que tienen que actuar presiones
de hasta 70 bar sobre la sección de la columna para poder compactar
las partículas de modo lo más denso posible y sin que se produzcan
espacios huecos.
Muchas partículas de polímeros orgánicos no son
estables a la presión y se deforman bajo la acción de la presión,
de tal manera que a partir de esferas se forman discos planos que se
solapan interfiriendo el paso de líquido a través de la
empaquetadura. Frente a esto, los geles de sílice de fase inversa
son por naturaleza más duros y apenas se deforman bajo las citadas
presiones.
Objeto de la presente invención es poner a
disposición un procedimiento para la purificación cromatográfica de
insulinas en materiales cromatográficos adecuados, que sean estables
a la presión, el cual tenga un poder de separación tan elevado, que
en lugar de las dos o más etapas de cromatografía sucesivas,
habituales en el estado actual de la técnica, para alcanzar la
pureza requerida de la insulina al tiempo que se incrementa el
rendimiento de esta etapa de purificación, tan sólo sea necesaria
una sola etapa.
Este problema se soluciona por un procedimiento
para la purificación cromatográfica de insulinas que se caracteriza
porque un material cromatográfico orgánico, polimérico, estable a la
presión, se utiliza como fase estacionaria para la cromatografía de
fase inversa, la fase móvil para la elución contiene al menos un
disolvente orgánico miscible con agua y al menos una sustancia
tampón, y el valor del pH es 7 a 11, estando constituidas las
partículas del material cromatográfico por polímeros orgánicos,
cuya deformación por la acción de presiones de hasta 70 bar es tan
sólo escasa.
Sorprendentemente, se encontró que con una
cromatografía en el intervalo de pH de 7 a 11, es decir en intervalo
básico, se podía conseguir una separación muy buena sobre
materiales cromatográficos orgánicos, poliméricos, estables a la
presión. El valor del pH es preferentemente 9 a 10.
Una ventaja especial del procedimiento conforme
a la presente invención consiste en que en este intervalo de pH
básico se reprime la formación de desamido-insulina,
una sustancia concomitante que se origina habitualmente en medio
ácido y que conforme a las especificaciones de los preparados de
insulina debe ser separada hasta cantidades residuales muy
pequeñas.
Las fases móviles que se emplean para la elución
contienen disolventes orgánicos miscibles con agua tales como, por
ejemplo, alcoholes con 1 a 4 átomos de carbono, cetonas, acetato de
metilo o acetonitrilo. Son preferidos alcoholes tales como
1-propanol o 2-propanol (n- o
iso-propanol), metanol o etanol. La concentración de
los disolventes orgánicos miscibles con agua se sitúa entre 1 y 90%
en volumen, preferentemente entre 10 y 50% en volumen.
Las fases móviles contienen, además, una
sustancia tampón para mantener constante el valor del pH del
eluyente. Sustancias tampón adecuadas son, por ejemplo, fosfatos,
sales alcalinas o alcalinotérreas tales como citrato de sodio o
acetato de potasio, citrato de amonio, acetato de amonio, sulfato de
amonio o cloruro de amonio.
El ajuste del valor del pH se efectúa por
adición de ácido clorhídrico o lejía de sodio.
La elución puede tener lugar isocráticamente, es
decir con concentración constante de las sustancias tampón y con
proporción constante del disolvente orgánico, o preferentemente con
un gradiente lineal, o sea con un incremento de la proporción de
disolvente.
Por término medio, el tamaño de las partículas
del material cromatográfico orgánico, polimérico, estable a la
presión debería ser ventajosamente 5 a 300 \mum, preferentemente
10 a 50 \mum. Cuanto más pequeño sea el tamaño de partículas,
tanto más precisa y mejor será la separación. No obstante, la
estabilidad a la presión de partículas más pequeñas es menor.
La insulina es un polipéptido relativamente
pequeño (peso molecular aproximadamente 6000) y se puede difundir
sin problemas en poros con un diámetro de 10 nm (ningún impedimento
estérico). Son más adecuados los materiales con pequeños diámetros
de partícula, puesto que la superficie específica y, con ello, la
capacidad de adsorción son mayores. Por término medio, el tamaño de
partículas del material cromatográfico orgánico, polimérico,
estable a la presión es ventajosamente 5 a 500 nm, preferentemente
10 a 50 nm.
Para el procedimiento conforme a la presenta
invención son particularmente adecuados los materiales
cromatográficos orgánicos poliméricos, estables a la presión que se
componen preferentemente de
poli-estireno-divinilbenceno o de
polimetilacrilato. Ejemplos de materiales cromatográficos orgánicos,
poliméricos, estables a la presión, habituales en el comercio, los
cuales se pueden emplear ventajosamente en el procedimiento conforme
a la presente invención, se recopilan en la Tabla 1.
El procedimiento conforme a la invención es
adecuado para la cromatografía analítica, para la cromatografía
semipreparativa y, especialmente para la cromatografía preparativa.
Por la expresión "cromatografía preparativa" se entiende la
preparación de productos puros a escala técnica.
Para conseguir la pureza requerida para los
preparados de insulina, es necesario anteponer a la cromatografía
de fase inversa, por ejemplo conforme al documento EP 0 547 544 A2
(US 5,621,073) o EP 0 474 213 A1 (US 5,245,008), al menos otra
cromatografía de fase inversa o una cromatografía de intercambio de
cationes y, eventualmente, una etapa de cristalización. En el
procedimiento conforme a la invención se consigue el mismo resultado
con una cromatografía en una sola etapa sobre el soporte de
polímero. Por lo tanto, con el procedimiento conforme a la
invención se mejora sensiblemente el rendimiento general en la
preparación de insulina, puesto que al reunir varias etapas de
proceso en una sola etapa se suprimen pérdidas de rendimiento.
El procedimiento conforme a la presente
invención es adecuado para la purificación cromatográfica de todas
las insulinas conformes con la definición establecida al comienzo, a
saber de las insulinas procedentes de fuentes naturales o de las
recombinantes (es decir expresadas por microorganismos genéticamente
modificados) de origen animal o humano (por ejemplo, insulina de
cerdo, insulina de bovino o insulina humana), proinsulinas (por
ejemplo, productos precursores de insulina, preinsulinas) o
derivados de insulina, entendiéndose por derivados de insulina los
derivados de insulinas que se encuentran de forma natural, a saber
insulina humana o insulinas animales, las cuales se diferencian por
sustitución de al menos un radical aminoácido que aparece de forma
natural y/o por adición de al menos un radical aminoácido y/o de un
radical orgánico de la respectiva insulina, por lo demás igual a la
insulina que se encuentra de forma natural.
Ejemplos de tales insulinas son insulina humana,
insulina de bovino, insulina de cerdo, insulinas conformes a los
documentos EP 0 368 187 (US 5,656,722), por ejemplo insulina
humana-Gly(A21), -Arg(B31),
-Arg(B32), insulinas conforme a los documentos EP 0 821 006
(ZA 97/6645) o las insulinas descritas en los documentos EP 0 547
544 A1 (US 5,621,073), EP 0 474 213 A1 (US 5,245,008), EP 0 600 372
A1 (US 5,473,049) o en el documento EP 0 668 292 (US 5,663,291).
(Las letras A y B representan la respectiva cadena de aminoácidos de
la insulina, el número representa la posición del radical
aminoácido que se encuentra de forma natural, el cual se ha
intercambiado por el radical aminoácido indicado delante del
paréntesis).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
En el Ejemplo 1 se hicieron ensayos en una
columna semipreparativa de dimensiones 10 mm de diámetro y 120 mm
de longitud, repleta con PLRP-S
10-15 \mum 100A (Polymer Laboratories). El
objetivo consistía en purificar insulina prepurificada, la cual
tiene una pureza del 95% en superficie, de tal manera que la pureza
fuera mayor del 98,5% en superficie.
La cantidad de problema se ajustó de tal modo
que daba como resultado una carga de material cromatográfico
polimérico de 6 g/litro [volumen del lecho]. El tampón a aplicar y
la fase móvil son mezclas de agua-propanol con 0,05
m de acetato de amonio y 0,1 m de glicina, los cuales se ajustaron
al correspondiente valor de pH con ácido clorhídrico o,
respectivamente, con NaOH. La velocidad del tubo vacío era de 150
cm/h. Se ajustaron los tres valores de pH 3,5 - pH 6,8 - pH 9. El
material eluído se recogió en fracciones.
En la Tabla 2 se representan los resultados.
Sólo en el caso de pH 9 se alcanzan purezas superiores a 98% en
superficie y, con ello, se cumplen las especificaciones. Se puede
ver claramente, que la purificación de insulina sobre materiales
cromatográficos polimétricos sólo presenta la eficacia requerida en
medio básico.
Ejemplo
2
Se compactó una columna cromatográfica
(Prochrom® LC50, con 50 mm de diámetro) con la técnica DAC
("Direct Axial Compression", compresión axial directa). El
material cromatográfico (fase estacionaria) se dispuso previamente
en 100% de metanol y se compactó en la columna. Se midió la pérdida
de presión de una mezcla de 11% de n-propanol en
distintos tasas de fluencia. La presión del émbolo de la columna
cromatográfica se varió entre 5 y 80 bar.
Se examinaron los siguientes materiales
cromatográficos:
- \quad
- PLRP-S 10-15 100® (Polymer Laboratories)
- \quad
- Source® 15 RPC (Amersham Pharmacia Biotech)
- \quad
- Kromasil® 13-120 (Akzo Nobel)
Los materiales tienen aproximadamente el mismo
tamaño de partículas (partículas esféricas). PLRP® y Source® son
polímeros, el Kromasil® es un gel de sílice RP de alto valor.
\vskip1.000000\baselineskip
Una pérdida de presión específica de 1 bar/cm
significa una caída de presión de 30 bar en una empaquetadura de 30
cm de altura, lo cual es habitual en cromatografías técnicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
A continuación se describen en total 3 ejemplos,
en los cuales se purifica insulina humana en una columna técnica,
la cual se compacta según el principio DAC con un émbolo
desplazable. Se utilizó una columna Prochrom®, tipo LC50. Para
todos los ensayos la empaquetadura tiene respectivamente la misma
dimensión de diámetro 50 mm, longitud de lecho 120 mm.
Insulina humana con una pureza de 95% en
superficie se debía llevar a una pureza superior a 98,5% en
superficie.
Se utilizaron tres soportes cromatográficos:
- \quad
- PLRP-S 10-15 100® (Polymer Laboratories)
- \quad
- Source® 15 RPC (Amersham Pharmacia Biotech)
- \quad
- Kromasil® 13-120 (Akzo Nobel)
Como ya se ha descrito en el ejemplo 2, PLRP y
Source® son materiales poliméricos, mientras que Kromasil® es un
soporte de gel de sílice RP de alto valor.
El tampón de aplicación y la fase móvil
corresponden a los datos del Ejemplo 1. La carga se indica en gramos
de insulina humana por litro de volumen de lecho. Por rendimiento
se entiende la parte de material eluído que presenta una pureza
superior a 98,5% en superficie.
En la Tab. 4 se confrontan los rendimientos
alcanzados. Los valores de 60 a 70% son sorprendentemente buenos
para una longitud de lecho de aproximadamente 12 cm. La diferencia
decisiva entre el estado actual de la técnica (purificación con
soporte de gel de sílice, aquí Kromasil®) y la cromatografía con un
soporte polimérico es la diferencia de pH: sólo con un valor de pH
de 9 se pueden alcanzar rendimientos de esta magnitud.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
En este ejemplo se debía purificar un bolo de
insulina
("Fast-Acting-Insulin",
insulina de efecto rápido). Aparte de esto, el ejemplo debe
demostrar, que como cargas de partida para esta etapa cromatográfica
también se admiten calidades peores. En el estado actual de la
técnica la purificación final de insulina se lleva a cabo
habitualmente en dos etapas cromatográficas. Si la etapa final de
purificación se carga directamente con un género malo, es decir
fuertemente impurificado, ya no se pueden alcanzar las purezas y, al
mismo tiempo, los elevados rendimientos
exigidos.
exigidos.
Sorprendentemente se encontró, ahora, que el
material polimérico examinado alcanza esta pureza en una única
etapa cromatográfica, lo cual se puede atribuir a los pequeños
diámetros de las partículas, de 10 a 15 \mum, y a las excelentes
propiedades de adsorción.
Se efectuaron cuatro ensayos, con los siguientes
cargas de partida:
- \quad
- pureza de 75% en superficie
- \quad
- pureza de 85% en superficie
- \quad
- pureza de 89% en superficie
- \quad
- pureza de 93% en superficie
En la Tab. 5 se han recopilado los rendimientos
alcanzados (es decir, la proporción de la insulina empleada que se
eluyó con una pureza superior a 98,5% en superficie). Si la carga de
partida tiene sólo 75% en superficie, entonces no se alcanza pureza
alguna superior a 98,5% en superficie. La pureza se sitúa en el
intervalo de sólo 98,0% en
superficie.
superficie.
Sin embargo, si los estados de partida se
encuentran por encima de 85% en superficie, entonces se alcanzan de
forma fiable las purezas exigidas, superiores a 98,5%, con
rendimientos comprendidos entre 60 y 80%.
Las condiciones preparativas eran como las
descritas en el Ejemplo 1. Todos los ensayos se llevaron a cabo en
una columna Prochrome® tipo LC50 con 50 mm de diámetro y 12 cm de
altura de empaquetadura. La carga fue en cada caso de 6 g/L BV, el
valor del pH se ajustó a 9, y la presión del émbolo se midió con 35
bar.
Con ayuda de la Tab. 5 es bien visible cómo en
función de la calidad de la carga de partida aumenta el rendimiento
en la cromatografía. Los ensayos muestran sin lugar a dudas que la
purificación es posible, de manera fiable, en una única etapa
cromatográfica.
Claims (19)
1. Procedimiento para la purificación
cromatográfica de insulinas, caracterizado porque un material
cromatográfico orgánico, polimérico, estable a la presión, se
utiliza como fase estacionaria para la cromatografía de fase
inversa, la fase móvil para la elución contiene al menos un
disolvente orgánico miscible con agua y al menos una sustancia
tampón, y el valor del pH es 7 a 11, estando constituidas las
partículas del material cromatográfico por polímeros orgánicos,
cuya deformación por la acción de presiones de hasta 70 bar es tan
sólo escasa.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el valor del pH es 9 a 10.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2,
caracterizado porque el disolvente orgánico miscible con agua
es un alcohol con 1 a 4 átomos de carbono.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque el alcohol es 1-propanol
o 2-propanol.
5. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque el alcohol es etanol.
6. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque el alcohol es metanol.
7. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque el disolvente orgánico miscible con agua
es una cetona.
8. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque el disolvente orgánico miscible con agua
es acetato de metilo.
9. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque el disolvente orgánico miscible con agua
es acetonitrilo.
10. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la concentración
del disolvente orgánico miscible con agua en la fase móvil es 1 a
90% en volumen.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque la concentración del disolvente orgánico
miscible con agua en la fase móvil es 10 a 50% en volumen.
12. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la elución se
efectúa de modo isocrático.
13. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la elución
tiene lugar con un gradiente de la proporción de disolvente
orgánico miscible con agua, incrementado linealmente.
14. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el material
cromatográfico orgánico, polimérico, estable a la presión presenta
por término medio un tamaño de partículas de 5 a
300 \mum.
300 \mum.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque el tamaño medio de partículas es de 10
a
50 \mum.
50 \mum.
16. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el tamaño medio
de poros del material cromatográfico orgánico, polimérico, estable
a la presión es 5 a 500 nm.
17. Procedimiento según la reivindicación 16,
caracterizado porque el tamaño medio de poros es 10 a 50
\mum.
18. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el material
cromatográfico orgánico, polimérico, estable a la presión se
compone de un polimetacrilato.
19. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el material
cromatográfico orgánico, polimérico, estable a la presión se
compone de un
poli-estireno-divinilbenceno.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19838097 | 1998-08-24 | ||
| DE19838097A DE19838097A1 (de) | 1998-08-24 | 1998-08-24 | Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulinen |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| ES99944373T Expired - Lifetime ES2296407T3 (es) | 1998-08-24 | 1999-08-11 | Procedimiento para la purificacion cromatografica de insulinas. |
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